TPS-Sa purification: A deux pas d'affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une protéine d'intérêt hautement purifiée et de longueur complète. Cela est réalisé en produisant un virus recombinant bao, utilisé pour infecter des cellules d'insectes SF nine afin d'obtenir une version doublement marquée de la protéine d'intérêt, fortement exprimée et soluble. Une purification par affinité en deux étapes est ensuite effectuée, caractérisée par la purification de la protéine marquée par le glutathion-séros, suivie d'une chromatographie d'affinité métallique.

Le résultat de la purification est une protéine marquée par une étiquette d'histidine hautement purifiée. Ensuite, les échantillons de protéine purifiée sont dialysés afin de garantir de faibles concentrations de sel dans le tampon de stockage. Les résultats obtenus montrent la solubilité, la quantité et la qualité de l'expression protéique, basés sur une coloration totale des protéines sur un gel SDS-PAGE.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons eu des difficultés à purifier des protéines grandes et instables, telles que PAL B deux et BOC deux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la purification par affinité en une étape, est que, dans notre protocole de purification par affinité en deux étapes, la protéine obtenue est très pure et généralement dépourvue de produits de dégradation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des protéines, telles que les fonctions biochimiques des protéines recombinantes purifiées.

Ce protocole commence par la production d'un virus bao recombinant, suivi de la sélection du virus BA le plus efficace, comme décrit dans le protocole textuel pour l'infection. Préparez un flacon agité contenant entre 0,75 et 1,0 fois 10 à la puissance six cellules SF9 dans 500 millilitres de milieu, avec un rapport de un à 150 entre le virus et le milieu. Placez le flacon agité sous une hotte de culture cellulaire et infectez les cellules en ajoutant le volume nécessaire de suspension virale baula dans la suspension cellulaire par l'un des bras du flacon agité.

Laisser les cellules infectées croître en suspension à 27 degrés Celsius et récolter les cellules lorsque l'expression maximale de la protéine est atteinte, ce qui est déterminé lors du choix du virus maculaire le plus efficace. Après la récolte des cellules, lyser les cellules SF9 exprimant la protéine d'intérêt dans environ 20 millilitres de tampon de liaison GST, complété par des inhibiteurs de protéases, dans un bain glace-eau. Homogénéiser la solution 20 fois à l’aide d’un homogénéisateur Dounce, puis soumettre à une sonication pendant trois cycles de 32 secondes avant de remélanger doucement 20 fois. Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire à 18 000 tr/min pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius et conserver le surnageant. Incuber le lysat cellulaire soluble avec un millilitre de billes GST préalablement lavées pendant une heure à 4 degrés Celsius sous agitation douce.

Le temps d'incubation doit être optimisé en fonction de la stabilité du pro et de l'efficacité de liaison après fixation. Faire une courte centrifugation à 700 tr/min et éliminer le surnageant contenant les protéines non liées. Laver les protéines liées à la GST avec le tampon de lavage GST.

Répétez ce processus deux fois après le dernier lavage. Éliminez autant que possible le surnageant. Incubez ensuite les billes avec de l'ATP à cinq millimolaire et du chlorure de magnésium à 15 millimolaire dans 10 millilitres de tampon de liaison GST pendant une heure à quatre degrés Celsius afin d'éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique après l'incubation.

Lavez les billes trois fois avec le tampon de lavage GST. Après centrifugation des billes GST et élimination du surnageant, lavez les billes GST avec le tampon P cinq. Ensuite, divisez les billes GST en fractions de 100 microlitres et ajoutez quatre à huit unités d'enzyme de précision diluées dans 100 microlitres de tampon P cinq.

Incuber les billes de GST avec l'enzyme de trois heures à toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Le temps d'incubation doit être optimisé en fonction du poids moléculaire ainsi que de la stabilité de la protéine après clivage. Faire une courte centrifugation et recueillir le surnageant.

Ajouter 100 microlitres de tampon P cinq aux billes. Répéter ensuite la centrifugation et la collecte du surnageant deux fois. Récupérer toutes les fractions.

Diviser l'EIT en trois fractions d'un millilitre et incuber chacune avec 100 microlitres de billes sèches de résine d'affinité métallique Talon préalablement lavées pendant une heure sous agitation rotative, ce qui, en divisant l'élution en plusieurs fractions, augmente l'efficacité de fixation et de lavage. Laver ensuite la résine pendant cinq minutes avec le tampon P 30 à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Après avoir répété le lavage deux fois, rassembler les billes dans un seul tube pour éluer la protéine purifiée.

Ajouter le tampon P 500 à la résine Talon liée à la protéine. Ajouter un tampon selon un rapport volume à volume de un pour un. Incuber la suspension pendant cinq minutes sous agitation rotative.

Répétez cette étape deux fois. Conservez chaque fraction éluée séparément pour le stockage de la protéine purifiée. Dialysez la protéine contre un tampon de stockage approprié deux fois pendant une heure à quatre degrés Celsius sous agitation.

Il est important de vérifier la présence d'un précipité de la protéine purifiée pendant la dialyse. Préparer de petites aliquotes de la protéine purifiée et les congeler sur de la glace sèche pendant 30 minutes. Conserver les aliquotes à moins 80 degrés Celsius et éviter de nombreux cycles de décongélation-congélation.

Analyser le processus de purification en chargeant environ 20 à 40 microlitres de chaque fraction sur un gel SDS-PAGE. Après avoir fait migrer le gel et l’avoir coloré au bleu de Kumasi ou à un colorant protéique pour la visualisation, les extraits cellulaires solubles et totaux provenant de cellules SF9 infectées par le virus valo recombinant REC 14 ou non infectées (témoin) ont été analysés par coloration au bleu de Kumasi, permettant de confirmer l’expression de la protéine GST-RE 14-His au cours du processus de purification. De nombreux échantillons ont été analysés afin de suivre l’efficacité de la méthode, par analyse de ces échantillons au bleu de Kumasi.

La coloration montre qu'au cours de la première étape de purification, GST Rec 14 s'est correctement fixé sur les billes GST avec un poids moléculaire apparent d'environ 50 kilodaltons, dû à la fusion de rec 14 avec GST après clivage de précision par G-S-T-G-S-T. Rec 14 hiss libre migre autour de 37 kilodaltons. Bien que le GST clivé puisse être visualisé sur les billes GST, malgré une fraction de GST rec 14 libre qui est restée liée aux billes GST, un enrichissement notable de rec 14 hiss a été obtenu. Cette étape pourrait être améliorée en augmentant le temps d'incubation de la protéine avec la protéase de précision. L'analyse de rec 14 hiss liée aux billes Talon par rapport aux protéines présentes après l'étape de purification GST montre qu'une grande fraction de rec 14 hiss est liée aux billes Talon.

Après plusieurs lavages, le rec 14 hiss a été élué et collecté, trois illusions ont été réalisées. L'analyse a révélé une forte pureté du rec 14 hiss et la concentration la plus élevée de rec 14 hiss dans la première comparaison éluante des fractions éluées par rapport aux billes de talon après qu'Ellucian illustre l'efficacité de l'illusion. Étant donné que peu de rec 14 hiss peut être détecté comme lié aux billes.

Ces échantillons ont également subi une analyse sanguine par immunotransfert avec des anticorps anti-GST et anti-hiss afin de suivre le REC 14. Tout au long de la procédure, le transfert avec l'anticorps anti-GST montre que certaines protéines GS TRE 14 et le GST seul étaient présents parmi les protéines obtenues à l'étape de purification GST, et que les contaminants ont été éliminés lors de l'étape de purification par affinité via la balise hiss. Ce transfert révèle que le GST a été efficacement éliminé du re 14 grâce au traitement de précision et à l'étape de purification par balise hiss ttag.

Le « blot anti hiss » vise à détecter Rec14. Ce « blot » confirme que GST Rec14 hiss et REC14 hiss n'ont pas été complètement clivés et éliminés des billes GST. De plus, à forte concentration, REC14 semble s'agréger.

En résumé, les résultats présentés démontrent l'efficacité de la purification par GST hiss pour l'isolement de la protéine S palm B rec 14. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir une protéine recombinante hautement purifiée. Une fois maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée 12 heures après la dégénérescence de l'acide ly soluble, à condition qu'elle soit effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler rapidement et strictement à quatre degrés Celsius afin d'éviter la dégradation des protéines. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que des dosages par précipitation conjointe ou la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'identification des partenaires protéiques ou les modifications post-traductionnelles de la protéine d'intérêt.

Bien que nous utilisions cette méthode pour l'ADN, la stratégie concernant les protéines de réparation pourrait être modifiée afin d'étudier la fonction des protéines dans d'autres domaines de recherche.