Name: TPS-Sa purification: A deux pas daffinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez une méthode de purification protéique en deux étapes par affinité utilisant des tags GST et His avec des cellules d'insectes SF9. Ce protocole efficace et économique produit des protéines recombinantes hautement pures et solubles.

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Nous remercions Anne-Marie Dion-Côte des discussions menant à l&#39;élaboration de la méthode. JK et RB sont FQNRT chercheurs doctorants, M.-MG est un savant Vanier IRSC, et J.-YM est un chercheur senior du FRSQ. Ce travail a été soutenu par des fonds du Conseil de recherches en génie à JY sciences naturelles et en. M.

Une. Production de baculovirus recombinant Les baculovirus sont générés en utilisant le système d&#39;expression Bac-to-Bac Baculovirus d&#39;Invitrogen principalement en conformité avec le protocole du fabricant avec seulement de légères modifications: <ol><li> Un vecteur pFastBac1 modifié (Gibco, la vie) a été créé contenant la TPS et ses balises (Figure 2). Le site clonage multiple (MCS) d&#39;un animal-52b (+) vecteur (Novagen), contenant un 10xHis-étiquette, a été inséré dans le MCS d&#39;un vecteur pFastBac1 pour générer pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence de MCS pET-52b (+) a été amplifié par PCR entre les sites de restriction XbaI et BLPI, en ajoutant un site de restriction BglII à l&#39;extrémité 5 &#39;et un site de restriction HindIII à l&#39;extrémité 3&#39;. Le produit de PCR a ensuite été clone entre les sites BamHI et HindIII de pFastBac1 de restriction, en utilisant la compatibilité de BamHI et BglII séquences de restriction. Etant donné que l&#39;objectif était de produire un pFastBac1 permettant l&#39;expression d&#39;protéine recombinante avec streptavidine et 10xHis-tags, le site de restriction BamHI de l&#39;animal-52b (+) séquence MCS n&#39;a pas été utilisé. En outre, le site de restriction XbaI n&#39;a pas été utilisé pour éviter la redondance des sites de restriction qui se produisent entre les sites déjà dans le SCM de pFastBac1 et les insérer avec le MCS de pET-52b (+). La séquence codante de la TPS avec le site PreScission protéase reconnaissance (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) a ensuite été inséré dans pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence d&#39;ADNc de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) a été amplifié par PCR avec des amorces contenant des sites de restriction Ncol et Kpnl aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; des extrémités, respectivement. Le site Ncol permet l&#39;ajout d&#39;un codon d&#39;initiation, mais aussi une alanine à la GST. Le produit de PCR a ensuite été clone dans pFastBac1-Strep-10xHis entre les sites de restriction Ncol et Kpnl, ce qui entraîne la suppression de la streptavidine-tag. Le nouveau vecteur de fusion ainsi obtenu a été nommé pFastBac1-TPS-10xHis. </li><li> Cloner le ADNc codant pour la protein d&#39;intérêt dans le vecteur pFastBac-TPS-10xHis entre le TPS (N-terminal) et l&#39;His-tag (C-terminal). Faire attention à éliminer le codon d&#39;arrêt de l&#39;ADNc à permettre la fusion avec le His-tag C-terminal. </li><li> Transformer E. coli avec le pFastBac DH10Bac recombinant (obtenu à l&#39;étape 1.2) pour générer le bacmide. Permettre aux colonies de se développer pendant une nuit à 37 ° C et plusieurs heures à 30 ° C sur des plaques de sélection contenant Bluo-gal et IPTG (10 ng / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 7 ng / ml de gentamycine, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml d&#39;IPTG). </li><li> Choisissez et restreak 2 colonies blanches (de l&#39;étape 1.3) sur des plaques de sélection pour confirmer le phénotype blanc. </li><li> Inoculer 2 ml de LB contenant 10 ug / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 10 pg / ml de gentamycine avec les deux colonies blanches de l&#39;étape 1.4 et de les laisser croître pendant une nuit sous agitation (250 rpm) à 37 ° C. </li><li> Afin de purifier l&#39;ADN de bacmide, un culot de bactéries à partir de l&#39;étape 1.5,remettre en suspension les cellules dans 300 ul de solution I et ajouter 300 ul de solution II (kit Maxiprep de Qiagen). Incuber pendant 5 min à température ambiante, ajouter 300 ul de 3 M de KOAc pH 5,5 et incubation pendant 10 min sur de la glace. Centrifuger les échantillons à 4 ° C, la vitesse maximale pendant 10 minutes. Ajouter 800 ul d&#39;isopropanol pour les surnageants et incuber pendant 10 min sur la glace. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 4 ° C et on lave le culot avec 500 ul d&#39;éthanol à 70%. Laissez le culot sec et remettre en suspension dans des conditions stériles dans 40 pi de Tris-EDTA pH 8,0. L&#39;ADN de bacmide doit être conservé à 4 ° C. </li><li> Générer des baculovirus comme décrit dans le protocole du fabricant. Baculovirus peuvent être conservés à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> 2. Recombinant Protein Expression <ol><li> Afin de choisir le baculovirus plus efficace pour la purification et de surveiller ce temps le pic d&#39;expression de la protéine est atteinte, effectuer une mini-infection essai uns suit: Infect 2 x 10 7 de Sf9 infectées en culture à 27 ° C dans les médias de Grace (complété avec 10% de FBS et 1% P / S) avec 133 pi (1/150) de baculovirus. Recueillir des aliquotes de 1,5 ml à 0, 24, 48, et 72 heures après l&#39;infection. Sédimenter les cellules et d&#39;analyser le niveau de la protéine d&#39;intérêt par Western blot en utilisant des anticorps anti-tag expression. </li><li> Utilisez le baculovirus plus efficace de l&#39;étape 2.1 pour infecter un spinner contenant 1,0 x 10 6 cellules Sf9 par ml dans 500 ml de milieu avec un ratio de 1/150 entre le virus et les médias. Laissez les cellules infectées se développent en suspension à 27 ° C et récolter les cellules où l&#39;expression de la protéine maximale (déterminée à l&#39;étape 2.1 ci-dessus) est atteint. Culot cellulaire peuvent être stockées à -80 ° C jusqu&#39;à son utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Préparation de Soluble Cell Lysate Toutes les étapes d&#39;incubation ci-dessous sont effectuées à 4 ° C sous rotation doux. <ol><li> Lyse Scellules F9 exprimant votre protéine d&#39;intérêt à ~ 20 ml de TPS tampon de liaison (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT dans PBS1X pour une concentration finale de NaCl de 250 mM, et de l&#39;inhibiteur de la protéase cocktail (Roche). dans un bain d&#39;eau glacée, la solution 20x Dounce avec un homogénéisateur Dounce, sonication 3 x 30 secondes chacun (de sortie) de 70%, et encore une fois de Dounce 20x. </li><li> (Optionnel). Incuber le lysat cellulaire totale avec 1 mM de MgCl2 et benzonase nuclease 7 (2,5 U / ml) pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer l&#39;ADN de l&#39;ARN ou de contamination. </li><li> Centrifuger à 18 000 tours par minute pendant 30 min à 4 ° C. Gardez le surnageant. </li><li> (Optionnel). Centrifuger le surnageant à nouveau pendant 30 min à 18 000 rpm à 4 ° C pour obtenir un lysat soluble claire. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 ou 0,45 um pour éviter le colmatage. </li></ol> 4. Liaison de la protéine sur Perles TPS <ol><li> Incuber le lysat cellulaire soluble avec 1 ml de billes de GST (préalablement lavée deux fois avec de l&#39;10 ml de tampon TPS) de liaison pendant 1 h à 4 ° C sous une légère rotation. </li></ol> Commentaire: Le temps d&#39;incubation doit être optimisée en fonction de la stabilité de la protéine et de l&#39;efficacité de liaison. <ol start="2"><li> Tour rapide à 700 rpm et enlever le surnageant contenant les protéines non liées (ce peuvent être conservés pour analyse ultérieure). Laver les protéines de la TPS lié (figure 3B, piste 1) avec le tampon de lavage de la TPS (TPS tampon de liaison avec 350 mM de NaCl final). </li><li> Répétez l&#39;étape 4.2 2x. Au dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible. </li><li> Incuber les billes avec 5 mM d&#39;ATP et 15 mM de MgCl2 (10 ml dans un tampon de liaison TPS) pendant 1 h à 4 ° C pour éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique 8. Laver les billes trois fois avec du tampon de lavage de la TPS. </li></ol> 5. PreScission clivage de la TPS <ol><li> Centrifuger les perles de la TPS, éliminer le surnageant et laver les billes de la TPS avec P5 buffer (50 mM, pH 7,0 NaHPO 4, 500 mM de NaCl, 10% de glycerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM d&#39;imidazole). </li><li> Incuber les TPS-perles avec PreScission enzyme dans un tampon P5 de 3 heures à une nuit à 4 ° C. (Diviser les perles de la TPS en fractions de 100 ul et ajouter 4-8 unités (2-4 pi) d&#39;enzyme dilué dans 100 pi de tampon P5). </li></ol> Commentaire: Le temps d&#39;incubation de l&#39;étape de PreScission doit être optimisée en fonction de la masse moléculaire ainsi que la stabilité de la protéine. Si la dégradation est observée, ce temps d&#39;incubation peut être réduite à un minimum de 2 heures au lieu d&#39;une nuit. <ol start="3"><li> Rotation rapide et recueillir le surnageant. Répétez cette étape deux fois après addition de 100 pi de P5 tampon pour les perles et mutualiser toutes les fractions (figure 3B, piste 2). </li></ol> Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l&#39;analyse de l&#39;efficacité de clivage (figure 3B </strong&gt;, piste 3). Habituellement, 70 à 80% de la protéine est clivée. 6. Protéine de liaison à TALON Métal Résine Affinity <ol><li> Diviser l&#39;élution à partir d&#39;au-dessus dans 3 fractions de 1 ml et incuber chacun avec 100 billes sèches Talon de résine d&#39;affinité métallique pl (prélavées deux fois avec du tampon P5) pendant 1 heure sous rotation. </li></ol> Commentaire: La division de la élution en plusieurs fractions augmente de liaison / lavages efficacité. <ol start="2"><li> Laver la résine 5 min avec du tampon P30 (tampon P5 avec une concentration finale de 30 mM imidazole). </li><li> Répétez l&#39;étape 6.2 2x et mutualiser les perles dans un seul tube. Avant le dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible. </li></ol> Commentaire: Ceci correspond à la TALON lié échantillon (figure 3B, piste 4). 7. L&#39;élution de la protéine purifiée <ol><li> Incuber la résine TALON lié aux protéines pendant 5 min sous rotation avec P500 un tampon (tampon de P5 avec une concentration finale de 500 mM d&#39;imidazole). Utiliser un ratio entre le tampon et perles de 1:1 v / v (Par exemple, si vous aviez pris 200 ul de billes sèches, vous devrez ajouter 200 ul de P500). Répétez cette étape deux fois et garder chaque fraction éluée séparément (nommé élution 1 (E1), élution 2 (E2) et élution 3 (E3); la figure 3B, pistes 5-7). </li></ol> Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l&#39;analyse de l&#39;efficacité d&#39;élution (figure 3B, piste 8). Typiquement, 60 à 80% de la protéine est éluée au total. <ol start="2"><li> Analyser la quantité et la qualité de votre protéine purifiée en chargeant environ 20-40 ul de chaque fraction avec une concentration standard BSA sur un SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie (figure 3B) ou SYPRO protéine tache pour la visualisation. </li></ol> Commentaire: La protéine d&#39;intérêt peut également être détectée throughout la procédure de purification utilisant des anticorps anti-GST et ses anti-anticorps (Figure 3C). 8. Le stockage de la protéine purifiée <ol><li> Dialyser la protéine purifiée contre un tampon de stockage approprié (par exemple, 20 mM de Tris acétate pH 8,0, KAc 200 mM, glycérol 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) à 4 ° C. Il est important de vérifier la précipitation de la protéine purifiée au cours de la dialyse. Nous dialyser habituellement 2x pendant 1 h à 4 ° C sous rotation de l&#39;agitation. </li><li> Faire de petites fractions de la protéine purifiée (10-20 pi) et geler sur glace sèche pendant 30 min. Entreposer les aliquotes à -80 ° C et éviter de nombreuses dégel / cycles de congélation. </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

Le-His TPS protocole de purification présentée ici est approprié pour la purification d&#39;une large gamme de tailles et de protéines recombinantes: Nous avons purifié avec succès Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), et une protéine de haut poids moléculaire instable de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. En outre, les protéines purifiées avec ce protocole étaient biochimiquement active 6. Le succès de ce procédé dépend uniquement de l&#39;expression, de la...

La purification de protéines recombinantes est crucial de répondre aux questions fondamentales de la biochimie. Des moyens classiques de purification des protéines, comme la Chromatographie d&#39;échange d&#39;ions et une Chromatographie d&#39;exclusion de taille dépendent des propriétés physiques de la protéine cible, tels que son point isoélectrique et la charge ou de la taille, respectivement. Ces dernières caractéristiques de protéine sont partagées par une variété de protéines, ce qui augmente considérablement le risque de contamination de protéines dans des stratégies de purification de protéines classiques. Ce problème peut être contourné par l&#39;utilisation de plusieurs colonnes de purification, ce qui prend du temps. Dans le même temps, ces derniers exigent des méthodes de chromatographie montage expérimental coûteux. Affinity-tag purification augmente fortement cible spécificité, comme dans la plupart des cas, le tag sera unique à la protéine d&#39;intérêt. Dans des études récentes, la purification de drapeau ou HA-affinité a été largement utilisé. Contrairement à rec existanteprotocoles de purification de protéines ombinant dans les balises simples sont utilisés, nous avons établi la combinaison unique de deux balises. Notre procédé implique la fusion d&#39;une GST-tag à l&#39;extrémité N-terminale et une étiquette His à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine d&#39;intérêt, pour un rapport optimal entre la quantité et la pureté de la protéine souhaitée. La TPS est une longue étiquette (29 kDa), qui est très efficace pour la purification de glutathion billes de Sepharose. En outre, en utilisant la TPS garantit coût-efficacité de notre méthode 1. La possibilité de cliver la GST avec l&#39;enzyme PreScission (avec la séquence de reconnaissance LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, soit un ajout de seulement deux acides aminés) présente de nombreux avantages, par exemple, cette stratégie permet d&#39;éviter les altérations des fonctions des protéines physiologiques dus à encombrement allostérique. La petite étiquette His fusionnés à l&#39;autre extrémité sert de protéine dans une seconde étape de purification pour augmenter la pureté de la protéine par lavage hors de la TPS clivé, ainsi que les protéines dégradées et les autres<html> contaminants. En outre, le protocole ne nécessite pas d&#39;étape de dialyse lors du passage de la TPS à la colonne de l&#39;étape de purification His-(résine TALON). Contaminants communs dans ces procédés de purification sont Heat Shock Proteins (HSP). L&#39;ajout d&#39;une étape d&#39;incubation avec du MgCl 2 et de l&#39;ATP permet l&#39;élimination de ces contaminants (Figure 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) et chromatographie liquide haute performance (HPLC) sont des techniques courantes qui dépendent de l&#39;instrumentation coûteuse à produire un rendement élevé de la protéine purifiée d&#39;intérêt. Le protocole de purification en discontinu nous présentons ici, en revanche, est manuel et ne nécessite pas une installation coûteuse instrumental. Un rendement élevé de protéines peut être atteint par l&#39;intensification de la protocole. Dans le même temps, avec le protocole de purification en discontinu, le volume d&#39;élution peut être ajusté afin d&#39;augmenter la concentration en protéine, qui n&#39;est pas donné par FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; En outre, avec la TPS-Son protocole de purification de lots, des protéines avec une gamme de taille de ~ 10-300 kDa peuvent être purifiés. Un des plus grands avantages est donnée par le fait que l&#39;on peut purifier plusieurs protéines en même temps , par exemple, à la fois de type sauvage et de sa protéine mutante. Le succès du protocole présenté dépend uniquement du niveau d&#39;expression et la solubilité de la protéine d&#39;intérêt.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</strong</td></tr><tr><td>>E.Coli DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I et II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Cellules infectées par Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de préscision</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Milieu infecté de Grace complété</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal caractérisé</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Pénicilline-Streptomycine)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Résine de sépharose</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon résine</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonaux GST</td><td>Production en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonaux 6X-His</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce homogénéisateur (étanche)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Sac de dialyse (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

tps-sa purification: a deux pas d&#39;affinité protocole purification cédant longs protéines purifiées

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Dosages clés en enzymologie pour la caractérisation biochimique des protéines in vitro requièrent des concentrations élevées de la protéine purifiée d&#39;intérêt. protocoles de purification de protéines devraient combiner l&#39;efficacité, la simplicité et l&#39;efficacité des coûts 1. Ici, nous décrivons la TPS-Sa méthode comme un nouveau système de purification d&#39;affinité à petite échelle de protéines recombinantes, basée sur une marque N-terminal glutathion Sepharose (TPS) 2,3 et une étiquette de 10xHis C-terminal 4, qui sont tous deux fusionné pour la protéine d&#39;intérêt. Cette dernière construction est utilisée pour générer des baculovirus, par infection de cellules Sf9 infectées pour l&#39;expression des protéines 5. TPS est un peu long tag (29 kDa) qui sert à assurer l&#39;efficacité de la purification. Toutefois, il pourrait influencer les propriétés physiologiques de la protéine. Par conséquent, il est par la suite éliminé par clivage de la protéine en utilisant l&#39;enzyme PreScission 6. Afin d&#39;assurer une pureté maximale et d&#39;éliminer la TPS clivé, nousd&#39;ajouter une deuxième étape de purification par affinité sur la base de la relativement faible His-Tag. Surtout, notre technique est basée sur deux étiquettes différentes flanquant les deux extrémités de la protéine, qui est un outil efficace pour éliminer les protéines dégradées et, par conséquent, enrichit protéines pleine longueur. La méthode présentée ici ne nécessite pas une configuration instrumentale coûteux, comme FPLC. En outre, nous avons intégré MgCl2 et lavages ATP pour enlever les impuretés chaleur de protéines de choc et de traitement à la nucléase de supprimer les acides nucléiques contaminants. En résumé, la combinaison de deux étiquettes différentes flanquant la N-et C-terminal et la capacité de cliver une des balises, garantit la récupération d&#39;une protéine hautement purifiée et sur toute la longueur d&#39;intérêt.

Afin d&#39;illustrer l&#39;efficacité de la GST-His protocole de purification, nous avons purifié Rec14, un S. protéine de 32,9 kDa pombe. Le Rec14 ADNc a été cloné dans notre vecteur pFastBac1 modifiée permettant l&#39;ajout de la TPS et-ses-tags à la N-et C-terminales, respectivement (figure 1A). Baculovirus recombinants ont ensuite été préparés et utilisés pour infecter des cellules SF9 infectées pour l&#39;expression de la protéine. Les lysats cellulaires solubles ont été incubées ...

Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His.

TPS-Sa purification: A deux pas d&#39;affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une protéine d'intérêt hautement purifiée et de longueur complète. Cela est réalisé en produisant un virus recombinant bao, utilisé pour infecter des cellules d'insectes SF nine afin d'obtenir une version doublement marquée de la protéine d'intérêt, fortement exprimée et soluble. Une purification par affinité en deux étapes est ensuite effectuée, caractérisée par la purification de la protéine marquée par le glutathion-séros, suivie d'une chromatographie d'affinité métallique.Le résultat de la purification est une protéine marquée par une étiquette d'histidine hautement purifiée. Ensuite, les échantillons de protéine purifiée sont dialysés afin de garantir de faibles concentrations de sel dans le tampon de stockage. Les résultats obtenus montrent la solubilité, la quantité et la qualité de l'expression protéique, basés sur une coloration totale des protéines sur un gel SDS-PAGE.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons eu des difficultés à purifier des protéines grandes et instables, telles que PAL B deux et BOC deux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la purification par affinité en une étape, est que, dans notre protocole de purification par affinité en deux étapes, la protéine obtenue est très pure et généralement dépourvue de produits de dégradation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des protéines, telles que les fonctions biochimiques des protéines recombinantes purifiées.Ce protocole commence par la production d'un virus bao recombinant, suivi de la sélection du virus BA le plus efficace, comme décrit dans le protocole textuel pour l'infection. Préparez un flacon agité contenant entre 0,75 et 1,0 fois 10 à la puissance six cellules SF9 dans 500 millilitres de milieu, avec un rapport de un à 150 entre le virus et le milieu. Placez le flacon agité sous une hotte de culture cellulaire et infectez les cellules en ajoutant le volume nécessaire de suspension virale baula dans la suspension cellulaire par l'un des bras du flacon agité.Laisser les cellules infectées croître en suspension à 27 degrés Celsius et récolter les cellules lorsque l'expression maximale de la protéine est atteinte, ce qui est déterminé lors du choix du virus maculaire le plus efficace. Après la récolte des cellules, lyser les cellules SF9 exprimant la protéine d'intérêt dans environ 20 millilitres de tampon de liaison GST, complété par des inhibiteurs de protéases, dans un bain glace-eau. Homogénéiser la solution 20 fois à l’aide d’un homogénéisateur Dounce, puis soumettre à une sonication pendant trois cycles de 32 secondes avant de remélanger doucement 20 fois. Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire à 18 000 tr/min pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius et conserver le surnageant. Incuber le lysat cellulaire soluble avec un millilitre de billes GST préalablement lavées pendant une heure à 4 degrés Celsius sous agitation douce.Le temps d'incubation doit être optimisé en fonction de la stabilité du pro et de l'efficacité de liaison après fixation. Faire une courte centrifugation à 700 tr/min et éliminer le surnageant contenant les protéines non liées. Laver les protéines liées à la GST avec le tampon de lavage GST.Répétez ce processus deux fois après le dernier lavage. Éliminez autant que possible le surnageant. Incubez ensuite les billes avec de l'ATP à cinq millimolaire et du chlorure de magnésium à 15 millimolaire dans 10 millilitres de tampon de liaison GST pendant une heure à quatre degrés Celsius afin d'éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique après l'incubation.Lavez les billes trois fois avec le tampon de lavage GST. Après centrifugation des billes GST et élimination du surnageant, lavez les billes GST avec le tampon P cinq. Ensuite, divisez les billes GST en fractions de 100 microlitres et ajoutez quatre à huit unités d'enzyme de précision diluées dans 100 microlitres de tampon P cinq.Incuber les billes de GST avec l'enzyme de trois heures à toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Le temps d'incubation doit être optimisé en fonction du poids moléculaire ainsi que de la stabilité de la protéine après clivage. Faire une courte centrifugation et recueillir le surnageant.Ajouter 100 microlitres de tampon P cinq aux billes. Répéter ensuite la centrifugation et la collecte du surnageant deux fois. Récupérer toutes les fractions.Diviser l'EIT en trois fractions d'un millilitre et incuber chacune avec 100 microlitres de billes sèches de résine d'affinité métallique Talon préalablement lavées pendant une heure sous agitation rotative, ce qui, en divisant l'élution en plusieurs fractions, augmente l'efficacité de fixation et de lavage. Laver ensuite la résine pendant cinq minutes avec le tampon P 30 à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Après avoir répété le lavage deux fois, rassembler les billes dans un seul tube pour éluer la protéine purifiée.Ajouter le tampon P 500 à la résine Talon liée à la protéine. Ajouter un tampon selon un rapport volume à volume de un pour un. Incuber la suspension pendant cinq minutes sous agitation rotative.Répétez cette étape deux fois. Conservez chaque fraction éluée séparément pour le stockage de la protéine purifiée. Dialysez la protéine contre un tampon de stockage approprié deux fois pendant une heure à quatre degrés Celsius sous agitation.Il est important de vérifier la présence d'un précipité de la protéine purifiée pendant la dialyse. Préparer de petites aliquotes de la protéine purifiée et les congeler sur de la glace sèche pendant 30 minutes. Conserver les aliquotes à moins 80 degrés Celsius et éviter de nombreux cycles de décongélation-congélation.Analyser le processus de purification en chargeant environ 20 à 40 microlitres de chaque fraction sur un gel SDS-PAGE. Après avoir fait migrer le gel et l’avoir coloré au bleu de Kumasi ou à un colorant protéique pour la visualisation, les extraits cellulaires solubles et totaux provenant de cellules SF9 infectées par le virus valo recombinant REC 14 ou non infectées (témoin) ont été analysés par coloration au bleu de Kumasi, permettant de confirmer l’expression de la protéine GST-RE 14-His au cours du processus de purification. De nombreux échantillons ont été analysés afin de suivre l’efficacité de la méthode, par analyse de ces échantillons au bleu de Kumasi.La coloration montre qu'au cours de la première étape de purification, GST Rec 14 s'est correctement fixé sur les billes GST avec un poids moléculaire apparent d'environ 50 kilodaltons, dû à la fusion de rec 14 avec GST après clivage de précision par G-S-T-G-S-T. Rec 14 hiss libre migre autour de 37 kilodaltons. Bien que le GST clivé puisse être visualisé sur les billes GST, malgré une fraction de GST rec 14 libre qui est restée liée aux billes GST, un enrichissement notable de rec 14 hiss a été obtenu. Cette étape pourrait être améliorée en augmentant le temps d'incubation de la protéine avec la protéase de précision. L'analyse de rec 14 hiss liée aux billes Talon par rapport aux protéines présentes après l'étape de purification GST montre qu'une grande fraction de rec 14 hiss est liée aux billes Talon.Après plusieurs lavages, le rec 14 hiss a été élué et collecté, trois illusions ont été réalisées. L'analyse a révélé une forte pureté du rec 14 hiss et la concentration la plus élevée de rec 14 hiss dans la première comparaison éluante des fractions éluées par rapport aux billes de talon après qu'Ellucian illustre l'efficacité de l'illusion. Étant donné que peu de rec 14 hiss peut être détecté comme lié aux billes.Ces échantillons ont également subi une analyse sanguine par immunotransfert avec des anticorps anti-GST et anti-hiss afin de suivre le REC 14. Tout au long de la procédure, le transfert avec l'anticorps anti-GST montre que certaines protéines GS TRE 14 et le GST seul étaient présents parmi les protéines obtenues à l'étape de purification GST, et que les contaminants ont été éliminés lors de l'étape de purification par affinité via la balise hiss. Ce transfert révèle que le GST a été efficacement éliminé du re 14 grâce au traitement de précision et à l'étape de purification par balise hiss ttag.Le « blot anti hiss » vise à détecter Rec14. Ce « blot » confirme que GST Rec14 hiss et REC14 hiss n'ont pas été complètement clivés et éliminés des billes GST. De plus, à forte concentration, REC14 semble s'agréger.En résumé, les résultats présentés démontrent l'efficacité de la purification par GST hiss pour l'isolement de la protéine S palm B rec 14. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir une protéine recombinante hautement purifiée. Une fois maîtrisée.Cette technique peut être réalisée 12 heures après la dégénérescence de l'acide ly soluble, à condition qu'elle soit effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler rapidement et strictement à quatre degrés Celsius afin d'éviter la dégradation des protéines. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que des dosages par précipitation conjointe ou la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'identification des partenaires protéiques ou les modifications post-traductionnelles de la protéine d'intérêt.Bien que nous utilisions cette méthode pour l'ADN, la stratégie concernant les protéines de réparation pourrait être modifiée afin d'étudier la fonction des protéines dans d'autres domaines de recherche.

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