TPS-Sa purification: A deux pas d'affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir une protéine d’intérêt hautement purifiée et complète. Ceci est réalisé en produisant un virus bao recombinant, qui est utilisé pour infecter les cellules d’insectes SF neuf afin d’obtenir une version hautement exprimée et soluble à deux marqueurs de la protéine d’intérêt. Une purification d’affinité en deux étapes est ensuite entreprise, caractérisée par une purification du glutathion, protéine marquée au séros, suivie d’une chromatographie d’affinité métallique.

Le résultat de la purification est une protéine hautement pure marquée à l’histidine. Ensuite, les échantillons de protéines purifiées sont dialysés afin de garantir de faibles concentrations de sel dans le tampon de stockage. On obtient des résultats qui montrent la solubilité d’expression, la quantité et la qualité de la protéine sur la base de la coloration de la protéine entière d’un gel de page SDS.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu du mal à purifier des protéines grandes et instables telles que PAL, B deux et BOC deux. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la purification par affinité en une étape, est que dans notre protocole de purification par affinité en deux étapes, la protéine obtenue est très pure et généralement exempte de produits de dégradation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des protéines, telles que les fonctions biochimiques des protéines recombinantes purifiées.

Ce protocole commence par la production du virus BAO recombinant, suivie de la sélection du virus BA le plus efficace, comme décrit dans le protocole textuel pour l’infection. Préparez un récipient de culture à rotor contenant entre 0,75 et 1,0 fois 10 à six cellules SF neuf dans 500 millilitres de milieu avec un rapport de un à 150 entre le virus et le milieu. Placez la toupie sous une hotte de culture cellulaire et infectez les cellules en ajoutant le volume nécessaire de suspension de virus baula dans la suspension cellulaire à travers un bras de la toupie.

Laissez les cellules infectées se développer en suspension à 27 degrés Celsius et récoltez les cellules lorsque l’expression maximale des protéines est atteinte, ce qui est déterminé lors du choix du virus maculaire le plus efficace. Après avoir récolté des cellules, neuf cellules ont exprimé la protéine d’intérêt dans environ 20 millilitres de tampon de liaison à la GST, complétées par des inhibiteurs de protéase dans un bain d’eau glacée. Descendez la solution 20 fois avec un homogénéisateur descendant, puis sonicate pendant trois 32e cycles avant de danser à nouveau 20 fois ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 18 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et maintenez le surnageant incuber le lysat cellulaire soluble avec un millilitre de billes de GST prélavées pendant une heure à quatre degrés Celsius sous une rotation douce.

Le temps d’incubation doit être optimisé en fonction de la stabilité du pro et de l’efficacité de liaison après liaison. Essorage rapide à 700 tr/min et élimination du surnageant contenant des protéines non liées. Lavez les protéines liées à la GST avec le tampon de lavage GST.

Répétez ce processus deux fois après le dernier lavage. Retirez autant de surnageant que possible. Ensuite, incubez les billes avec cinq millimolaires d’A TP et 15 millimolaires de chlorure de magnésium dans 10 millilitres de tampon de liaison GST pendant une heure à quatre degrés Celsius pour éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique après l’incubation.

Lavez les perles trois fois avec un tampon de lavage GST. Après avoir centrifugé les billes de GST et retiré le surnageant, lavez les billes de GST avec un tampon P cinq. Ensuite, divisez les billes de TPS, infractions de 100 microlitres et ajoutez quatre à huit unités d’enzyme de précision diluées dans 100 microlitres de tampon P cinq.

Incuber les billes de GST avec de l’enzyme pendant trois heures jusqu’à toute la nuit à quatre degrés Celsius sous une rotation douce. Le temps d’incubation doit être optimisé en fonction du poids moléculaire ainsi que de la stabilité de la protéine après clivage. Tournez rapidement et récupérez le surnageant.

Ajoutez 100 microlitres de tampon P cinq aux billes. Ensuite, répétez, tournez et collectez deux fois le surnageant. Tirez toutes les fractions.

Divisez l’EIT en trois fractions d’un millilitre et incubez chacune avec 100 microlitres de billes sèches de résine d’affinité prélavée pendant une heure sous rotation, divisant l’élution en plusieurs fractions, augmente l’efficacité de la liaison et du lavage. Ensuite, lavez la résine pendant cinq minutes avec un tampon P 30 à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Après avoir répété le lavage deux fois, tirez les perles dans un seul tube pour éluer la protéine purifiée.

Ajoutez le tampon P 500 à la résine de talon liée aux protéines. Ajoutez un rapport tampon/talon de volume un pour un. Volume. Incuber la suspension pendant cinq minutes en rotation.

Répétez cette étape deux fois. Garder chaque fraction éludée séparée pour le stockage de la protéine purifiée. Dialysez la protéine contre un tampon de stockage approprié deux fois pendant une heure à quatre degrés Celsius sous agitation.

Il est important de vérifier la précipitation de la protéine purifiée pendant la dialyse. Faites de petites aliquotes de la protéine purifiée et congelez-les sur de la glace sèche pendant 30 minutes. Stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius et évitez de nombreux cycles de dégel.

Analysez le processus de purification en chargeant environ 20 à 40 microlitres de chaque fraction sur un gel de page SDS. Après avoir analysé la coloration au gel avec du bleu de Kumasi ou une coloration protéique pour la visualisation, les lysats cellulaires solubles et totaux de neuf cellules SF infectées par le virus valo recombinant REC 14 ou un simulacre infecté comme témoin ont été analysés par coloration au bleu de Kumasi, permettant de confirmer l’expression de la protéine GST re 14 his pendant le processus de purification. De nombreux échantillons ont été analysés pour suivre l’efficacité de la méthode d’analyse de ces échantillons par kumasi Blue.

La coloration montre que lors de la première étape de purification, GST Rec 14 a été correctement lié aux billes de GST avec un poids moléculaire apparent d’environ 50 kilodaltons en raison de la fusion de rec 14 avec GST après clivage de précision avec G-S-T-G-S-T, le sifflement libre rec 14 migre autour de 37 kilodaltons. Bien que la GST clivée puisse être visualisée sur les billes de TPS, malgré une partie de la REC 14 exempte de TPS qui restait liée aux billes de la TPS, un enrichissement notable du sifflement de la REC 14 a été obtenu. Cette étape pourrait être améliorée en augmentant le temps d’incubation de la protéine grâce à une analyse précise de la protéase du sifflement REC 14 lié aux billes de Talon par rapport aux protéines auxquelles il a été fait allusion après que l’étape de purification GST ait montré qu’une grande fraction du sifflement de REC 14 est liée aux billes de Talon.

Après plusieurs lavages, le sifflement REC 14 a été échappé et collecté, trois illusions ont été réalisées. L’analyse a révélé une grande pureté du sifflement rec 14 et la plus grande concentration du sifflement rec 14 dans la première comparaison ellucienne des fractions éludées aux perles de la serre après qu’Ellucian illustre l’efficacité de l’illusion. Comme le sifflement little rec 14 peut être détecté comme lié aux billes.

Ces échantillons ont également été soumis à des analyses de sang occidentales avec des anticorps anti GST et anti hiss afin de suivre REC 14. Tout au long de la procédure, le transfert anti-GST montre que des protéines GS TRE 14 et GST seules étaient présentes dans les protéines mentionnées lors de l’étape de purification de la GST et que les contaminants ont été éliminés par l’étape de purification par affinité de l’étiquette de sifflement. Cette tache révèle que la GST a été efficacement éliminée de re 14 par le traitement de précision et l’étape de purification du sifflement.

La tache anti sifflement vise à détecter re 14. Cette tache confirme que le sifflement GST Rec 14 et le sifflement REC 14 n’ont pas été complètement clivés et retirés des perles GST. De plus, à une concentration élevée, REC 14 semble s’agréger.

En résumé, les résultats présentés démontrent l’efficacité de la purification par sifflement GST pour la purification du palmier S B rec 14. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récupérer une énergie hautement embellie. Protéine combinée Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée dans les 12 heures suivant la dégénérescence de l’acide soluble si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement et strictement à quatre degrés Celsius pour éviter la dégradation des protéines Suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que le codage des tests de précipitation ou la spectrométrie de masse, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de partenaires protéiques ou la modification post-traductionnelle de la protéine d’intérêt.

Bien que nous utilisions cette méthode pour l’ADN, les protéines de réparation pourraient être modifiées pour étudier la fonction des protéines dans d’autres domaines de recherche.