Purification de Native Complexes pour l'étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

L’objectif global de ce protocole est de purifier un complexe macromoléculaire natif de qualité appropriée pour les études biophysiques. Ce protocole sert non seulement de moyen de purification d’un complexe, mais aussi de guide détaillé pour évaluer la qualité structurelle de l’échantillon pendant la purification. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet de purifier un assemblage natif dans des conditions tampons proches de celles physiologiques de manière simple et rapide, afin d’assurer l’homogénéité de la composition.

Après centrifugation des cellules de S. cerevisiae et décantation du surnageant conformément au protocole de texte, ajouter deux millilitres de tampon de lyse réfrigéré, puis agiter et/ou utiliser une pipette séréologique de 10 millilitres pour suspendre la pastille. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique vide en polypropylène de 50 millilitres maintenu sur de la glace. Ensuite, utilisez deux millilitres supplémentaires de tampon de lyse réfrigéré pour laver chaque flacon de centrifugation et ajoutez la solution dans le tube de 50 millilitres.

Après avoir déterminé le poids humide de la pastille de cellule, créez un bain d’azote liquide dans et autour d’un tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 millilitres. Ensuite, aspirez des cellules suspendues dans une seringue de cinq millilitres et connectez une aiguille de calibre 16 à la seringue. Ensuite, congelez la suspension cellulaire en la faisant passer dans la seringue et l’aiguille dans le bain à un rythme d’environ un millilitre par minute pour générer des gouttelettes.

Pour lyser les cellules de levure, commencez par utiliser de l’azote liquide pour pré-refroidir un moulin à café. Ajoutez ensuite jusqu’à 40 grammes de cellules de levure et broyez pendant 25 secondes, en répétant le broyage huit ou neuf fois. Il est recommandé de ne pas purifier plus de 10 litres de culture cellulaire à la fois.

Cela minimise le temps de purification et garantit le maintien de l’intégrité structurelle du complexe. Après deux cycles de broyage, ajoutez une couche peu profonde d’azote liquide dans le broyeur et laissez-la s’évaporer. Pour empêcher les cellules de s’agglutiner, empêchez les cellules de dégeler en utilisant une spatule réfrigérée à l’azote liquide pour remuer les cellules.

Après la lyse, les cellules doivent apparaître sous la forme d’une fine poudre blanche. Après avoir vérifié la lyse cellulaire et préparé le tampon de lyse avec des inhibiteurs de PMSF, de DTT et de protéase conformément au protocole de texte, utilisez une spatule réfrigérée à l’azote liquide pour prélever progressivement la poudre de cellules lysées congelée dans les tubes de 50 millilitres préparés du tampon. À chaque incrément ajouté, faites pivoter doucement les tubes de 50 millilitres à température ambiante afin de décongeler et de dissoudre les cellules et d’éviter la formation de bulles.

Au fur et à mesure que les cellules se dissolvent, ajoutez plus de poudre cellulaire. Une fois que toutes les cellules ont été ajoutées, continuez à décongeler et à dissoudre les cellules jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas de cellules congelées observées dans les tubes. Cela devrait prendre environ 50 minutes.

Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 25 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois les cellules lysées et après la centrifugation, vous pouvez observer une petite couche sombre dans la pastille insoluble. Transférez le surnageant dans des tubes ultracentrifuges en polycarbonate et ajoutez 10 microlitres de PMSF de 200 millimolaires à chaque tube plein.

Centrifugez les échantillons à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’essorage, quatre couches doivent être visibles. Une pastille dure et claire contenant principalement des complexes ribosomiques ; une pastille molle riche en lipides ; une grande couche claire et teintée de jaune contenant la plupart des protéines et des complexes solubles de la cellule ; et une couche supérieure squameuse composée de lipides.

Dans une chambre froide à quatre degrés Celsius, utilisez une pipette d’un millilitre pour retirer la plus grande partie possible de la couche lipidique squameuse supérieure et jetez-la. Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour récupérer la majeure partie de la couche jaune clair. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour éviter de déranger les deux couches inférieures, récupérez les derniers millilitres de cette couche.

À partir de 40 grammes de granulés de cellules humides, environ 48 millilitres de la couche intermédiaire sont généralement récupérés. Après avoir préparé l’IgG sépharose selon le protocole textuel, combinez la résine IGG avec le surnageant de phase intermédiaire et deux mini-comprimés inhibiteurs de protéase pour 40 grammes de cellules. Placez ensuite sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Il s’agit de la solution IgG par lots. Préparez deux colonnes de polyprep de 10 millilitres en coupant les extrémités des colonnes pour produire une ouverture plate. Versez les 24 millilitres de suspension de résine IgG ou de solution discontinue dans chaque colonne, et laissez sédimenter par gravité.

Cela correspond à 200 microlitres de résine IgG emballée. Si la sédimentation dure plus de 30 minutes, la phase intermédiaire peut avoir été contaminée par des lipides. Lorsque la sédimentation est terminée, utilisez quatre volumes successifs de 10 millilitres de tampon IgG D150 pour laver la colonne garnie.

Pour effectuer le clivage du virus de la gravure du tabac ou de la protéase TEV sur la colonne, scellez le bas de la colonne et ajoutez un millilitre de tampon IgG D150 et 100 microlitres de protéase TEV. Scellez le haut de la colonne et à l’aide d’un mélangeur thermique à 750 tr/min et 18 degrés Celsius, mélangez pendant 20 minutes. Remettez la résine en suspension et mélangez à nouveau pendant 20 minutes.

Ensuite, suspendez à nouveau et répétez une troisième fois le mélange de 20 minutes. Ramenez la colonne à quatre degrés Celsius et utilisez la gravité pour éluer le complexe protéique. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’IgG D150 pour éluer le volume mort.

Après avoir préparé la résine d’affinité à la calmoduline selon le protocole de texte, ajoutez le tampon de liaison à la calmoduline et l’échantillon à la résine, et utilisez un rotateur de tube pour incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure. Préparez une colonne de polyprep de deux millilitres pour 100 microlitres de boue de calmoduline en coupant l’extrémité de la colonne pour créer une ouverture plate. Le protocole détaille les volumes spécifiques de tampon et de résidence choisis de manière à maintenir la concentration du complexe et à minimiser son temps de séjour de résine.

Si le volume culturel est modifié, il est recommandé de modifier les volumes de résine et de tampon des colonnes de gravité pour tenir compte du changement. Emballez la colonne avec pas plus de 100 microlitres de boue de calmoduline et, par gravité, utilisez 5 millilitres de tampon de liaison de calmoduline pour laver la résine trois fois. À l’aide de 200 microlitres de tampon d’élution de calmoduline, éluez la protéine trois fois.

Ensuite, scellez le fond de la colonne et ajoutez 20 microlitres de tampon d’élution et incubez pendant 2,5 minutes avant de libérer le joint et de permettre à la protéine d’éluer par gravité. Fermez à nouveau le fond de la colonne et ajoutez 200 microlitres de tampon d’élution avant d’incuber pendant cinq minutes. Ensuite, descellez le bas de la colonne et éluez la solution.

Pour la sixième et dernière élution, scellez le fond de la colonne et incubez avec un tampon d’élution pendant 10 minutes. Ensuite, descellez et éluez. Effectuer l’analyse post-purification et stocker les échantillons conformément au protocole texte.

Comme le montre ici, une purification initiale du complexe par TAP selon un protocole publié a produit un complexe qui a migré en trois bandes sur un gel coloré à l’argent. Plusieurs cycles d’optimisation de la méthode TAP nous donnent un complexe qui a migré comme une seule bande sur un gel natif, ce qui indique un assemblage plus homogène. Conformément au résultat du gel natif, le western blot utilisant un anticorps TAP contre le complexe, purifié selon le protocole publié, a détecté une protéolyse de la protéine marquée TAP, SNU-71.

Les modifications apportées à la méthode TAP ont considérablement réduit la quantité de protéolyse, car presque toutes les 17 protéines du complexe U1 snRNP ont été résolues par SDS-PAGE et identifiées positivement par spectrométrie multimasse. La microscopie électronique à coloration négative montre des particules monodispersées provenant d’une purification réussie après la première et la deuxième étape du TAP. En revanche, aucune particule de la bonne taille n’est observée lorsque la purification n’est pas réussie.

La qualité finale du complexe a été évaluée sur une pelouse de particules purifiées, montrées ici, qui apparaissent monodispersées dans l’image brute EM de coloration négative. De plus, les moyennes de classe des particules révèlent des caractéristiques distinctes indiquant que l’échantillon peut convenir à une étude structurale. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété dans les 10 à 12 heures suivant la décongélation de la poudre de cellules lysées congelées.

Tout en suivant ce protocole, il est important de s’assurer que toutes les solutions sont exemptes de protéases et de nucléases, ainsi que d’agir rapidement pour empêcher l’agrégation ou la dissociation du complexe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment purifier un complexe natif de qualité appropriée pour l’étude structurelle, ainsi que comment évaluer que cela a été réalisé.