Name: Purification de Native Complexes pour létude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Apprenez la purification de complexes macromoléculaires natifs par TAP pour la biologie structurale utilisant S. cerevisiae. Cette méthode assure l'homogénéité compositionnelle et l'intégrité structurale pour les études biophysiques.

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Les auteurs sont reconnaissants du soutien et des conseils de Nikolaus Grigorieff. Nous remercions Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu et Mike Rigney pour leurs discussions utiles et leurs conseils en matière de gestion des situations d’urgence. Ce travail a été financé par la National Science Foundation, prix n° 1157892. L’installation Brandeis EM est soutenue par la subvention P01 GM62580 des National Institutes of Health.

Remarque: Le protocole suivant a été mis au point pour la purification d&#39;un complexe de 4 litres de culture de cellules, environ 40 g de poids humide de cellules. Une fois préparé, tous les tampons doivent être conservés à 4 ° C et utilisés dans le mois de leur préparation. les inhibiteurs de la protéase et l&#39;agent réducteurs ne sont ajoutés aux tampons juste avant d&#39;utiliser. 1. Préparation de l&#39;extrait de cellules entières pour Tandem Affinity Purification <ol><li> La croissance de S. cellules cerevisiae <ol><li> Streak TAP désiré marqué S. cerevisiae souche de stockage (-80 ° C) sur une peptone dextrose de levure (YPD) de la plaque. Incuber pendant 3 - 5 jours (30 ° C), jusqu&#39;à ce que les cellules de levure apparaissent en blanc et mousseux. </li><li> Inoculer une série d&#39;environ 2 mm 2 des cellules fraîches de la plaque dans 10 ml de milieu YPD dans un polypropylène tube à centrifuger conique de 50 ml. Agiter le tube à 180 tours par minute (rpm) pendant la nuit (30m ° C). </li><li> Inoculer 2 ml de plusculture de nuit et par litre de milieu YPD dans un 2 L Erlenmeyer ou fiole conique. Agiter à 180 tours par minute (30 ° C). Surveiller la croissance des cellules à une densité optique de 600 nm (DO 600) jusqu&#39;à la phase logarithmique tardive, DO600 de 1,8 à 2, typiquement de 20 à 24 heures. </li></ol></li><li> Récolte S. cellules cerevisiae <ol><li> récolte des cellules par centrifugation à 5 400 xg pendant 15 min (4 ° C). </li><li> décanter rapidement le surnageant et maintenir les cellules à 4 ° C ou sur la glace. </li><li> Suspendre chaque litre de culot de cellules avec 2 ml réfrigéré tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 300 mM, KCl 10 mM, EDTA 0,2 mM, pH 8,0; mM d&#39;imidazole 5, pH 8,0; 10% de glycerol; 0,1% v NP-40 / v). Suspendre les cellules par tourbillonnement et / ou répétition pipetage utilisant un 10 ml pipettes sérologiques. Note: L&#39;importance de NP-40 en ce qui concerne la qualité complexe et l&#39;analyse post-purification est discuté ci-dessous. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un vide de 50 ml polypropylène tube à centrifuger conique kept sur la glace. Laver chaque flacon de centrifugeuse avec une 2 ml supplémentaires de tampon de lyse refroidi et ajouter à la suspension cellulaire dans le tube de 50 ml. </li><li> Déterminer le poids humide du culot cellulaire en pesant le tube et en soustrayant le poids du tube vide, ainsi que le tampon de lyse ajouté. Note: Un litre de culture cellulaire ayant une DO 600 de 1,8 est d&#39; environ 10 g. </li><li> Créer un bain d&#39;azote liquide dans un cône de polypropylène tube de centrifugeuse de 50 ml. Dessinez cellules en suspension dans une seringue de 5 ml. Branchez une aiguille G 16 à la seringue. Congeler la suspension cellulaire en le faisant passer à travers la seringue / aiguille pour générer des cellules &quot;gouttelettes&quot;. Taux de congélation devrait être d&#39;environ 1 min / ml. </li><li> Stocker des gouttelettes de cellules congelées (-80 ° C) ou procéder à une lyse. </li></ol></li><li> Lyser des cellules et clarification Lysat <ol><li> Lyse les Les cellules de levure en utilisant un moulin à café. cellules Lyse huit à neuf fois avec 25 sec de broyage rafales, tout en agitant le cmeuleuse Offee. Avant utilisation, pré-refroidir le moulin à café avec de l&#39;azote liquide. Tous les deux tours de broyage, ajouter une couche superficielle de l&#39;azote liquide à la meuleuse et laisser évaporer. </li><li> Remuer avec une spatule azote liquide refroidi au besoin pour garder les cellules de l&#39;agglutination. Prendre des précautions pour éviter la décongélation des cellules, ce qui peut entraîner une agglutination cellulaire. Les cellules doivent apparaître comme une fine poudre blanche après la lyse. Un culot cellulaire maximale de 4 litres de culture de levure (~ 40 g) peut être broyé à la fois. Note: Les observations concernant la méthode de lyse sont discutés ci-dessous. </li><li> Évaluer le degré de lyse des cellules en utilisant un hémocytomètre ou autre méthode de comptage des cellules. Pour fournir une analyse adéquate, prendre les échantillons suivants: (1) avant la lyse; (2) après quatre cycles de lyse; et (3) après la lyse. Pour vérifier ces échantillons, prendre une petite quantité de cellules avec une spatule réfrigérée azote liquide et dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Une fois que les cellules sont décongelées, pipette 5 pi de celluleset mélanger avec 495 pi d&#39;eau. Si 40 - 60% de lyse des cellules est observée, passez à l&#39;étape suivante dans le protocole. Note: Observations concernant l&#39;effet des longues périodes de lyse sont discutés ci-dessous. </li><li> , les cellules de magasin lysées Une fois la lyse adéquate est observée (-80 ° C) ou passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Préparer deux 50 ml polypropylene tubes de centrifugation coniques de 15 ml chacune avec un tampon de lyse, notamment 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), 1 mM de dithiothréitol (DTT), et un cocktail disponible dans le commerce d&#39;inhibiteurs de la protéase. Remarque: Si protéolyse significative est observée, envisager l&#39;utilisation d&#39;une souche déficiente de la protéase. </li><li> Utilisez un azote liquide spatule réfrigérée pour ramasser la poudre congelée de cellules lysées dans les préparations tubes de 50 ml. Ajouter la poudre cellulaire / solide de façon incrémentielle à la mémoire tampon de lyse contenant à la fois un agent réducteur et d&#39;inhibiteur (s) de protéase. </li><li> Faire tourner les tubes de 50 ml doucement à la température ambiante de manière à fondre / dissoudre les cellules, mais aussi pour éviter la formation de bulles. UNEs la poudre cellulaire / solide se dissout, ajouter cellule supplémentaire solide / poudre. </li><li> Remplir chacun des deux tubes de 50 ml jusqu&#39;à ce que chacun a environ 20 g de cellules ou de toutes les cellules ajoutées. Continuer la décongélation / dissolution jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y a pas amas de cellules congelées observées dans les tubes de 50 ml. Cela devrait prendre environ 50 min. </li><li> Centrifuger le lysat de cellules en suspension pendant 20 min à 25 000 x g (4 ° C). cellules bien-lysées peuvent présenter une petite quantité de précipité noir. </li><li> Transférer les 50 ml de surnageant au polycarbonate tubes ultra-centrifugeuse (26,3 ml tubes utilisés) et ajouter 10 ul mM PMSF 200 à chaque tube plein. </li><li> Centrifugeuse pendant 1 heure à 100.000 xg (4 ° C). Quatre couches doivent être visibles, de bas en haut: (1) une pastille dure claire, contenant des complexes de ribosomes; (2) une pastille riche en lipides douce; (3) une grande couche jaunâtre clair contenant la plupart des protéines et des complexes solubles de la cellule; et (4) un «écailleuse» couche supérieure constituée de lipides. </li><li> Effectuer toutes les subsequent étapes dans une chambre froide (4 ° C). Retirez autant de la «écailleuse» couche supérieure lipidique que possible en utilisant un 1 ml pipette et le jeter. Utilisez 10 ml pipettes sérologiques pour récupérer la majeure partie de la couche jaune clair. </li><li> Récupérer les dernières ml de cette couche à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml pour éviter de perturber les deux couches inférieures. De 40 g cellule humide culot, environ 48 ml de la couche du milieu est généralement récupéré et 8 ml de la couche lipidique enlevés / mis au rebut. Note: Le débit de la colonne de purification est fortement entravée par la présence de lipides, ce qui peut également nuire à la qualité du complexe décrit ci-dessous. </li></ol></li></ol> 2. La colonne de purification étape 1: IgG Chromatographie <ol><li> Résine équilibration et reliure <ol><li> Préparer un 300 ul d&#39;IgG Sepharose suspension pour 40 g de culot cellulaire. Coupez l&#39;extrémité d&#39;une pointe de pipette 1 ml pour faciliter le pipetage la suspension. Laver / équilibrer la résine IgG trois fois, chaque fois avec 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 150; 1 mM de MgCl2; mM d&#39; imidazole 5, pH 8, 0,1% v / v de NP-40, 1 mM de DTT, un comprimé d&#39;inhibiteur de protease par 50 volume en ml). <ol><li> Spin à culot à 160 xg (4 ° C) entre les lavages et retirer le surnageant. </li></ol></li><li> Faire tourner la résine IgG avec le surnageant de la phase médiane, et deux mini-comprimés d&#39;inhibiteur de protease par 40 g de cellules, en utilisant un dispositif de rotation approprié, pendant 2 heures (4 ° C). Ceci est la solution du lot d&#39;IgG. </li><li> Préparer deux 10 ml colonnes poly-prep pour une utilisation en coupant l&#39;extrémité de la colonne pour produire une coupe à plat. Afin d&#39;accélérer l&#39;emballage et le lavage de la colonne par écoulement par gravité, charger un maximum de 200 ul de résine IgG ou tassé ~ 25 ml de la solution du lot d&#39;IgG par colonne de 10 ml. </li><li> Verser la solution de traitement par lots d&#39;IgG dans la colonne et laisser sédimenter par gravité. Si la sédimentation prend plus de 30 minutes, il était plus probable contamination lipidique lors de la récupération de la phase intermédiaire de la centrifugeuse tubes. </li><li> Laver la colonne garnie de quatre successives de 10 ml volumes de IgGD150 Buffer. </li></ol></li><li> Sur la colonne TEV Décolleté <ol><li> Sceller le fond de la colonne et ajouter 1 ml de IgGD150 Buffer et 100 pi de TEV protéase (0,6 mg / stock ml, variante mutante S219V de TEV produit en interne). Sceller le haut de la colonne et mélanger pendant 20 min (18 ° C) en utilisant un mélangeur thermique, en agitant à 750 tours par minute. résine Resuspendre et mélanger à nouveau pendant 20 minutes, répéter une fois de plus pour un total de 1 heure d&#39;incubation. Note: Il est essentiel de garder le temps d&#39;incubation à un minimum. </li><li> Retourner la colonne à 4 ° C et à éluer la protéine / le complexe par gravité. Eluer le volume mort avec un 200 pi supplémentaires de IgGD150 Buffer. </li></ol></li></ol> 3. Colonne Purification Etape 2: calmoduline Chromatographie d&#39;affinité <ol><li> Résine équilibration et reliure <ol><li> Préparer 200 pi de résine d&#39;affinité pour la calmoduline 40 g de cellulespastille. Laver la résine à trois reprises, chaque fois avec 5 ml de calmoduline tampon de liaison (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM, 5 mM d&#39; imidazole, pH 8, 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40, 10 mM de β-mercaptoéthanol), centrifuger à 160 x g (4 ° C) et un culot pour chaque lavage. </li><li> Pour chaque 1 ml IgG éluat, ajouter 3 volumes de calmoduline Binding Buffer. Pour maintenir constant le niveau de calcium, ajouter CaCl 2 et β-mercaptoéthanol pour tenir compte de l&#39;absence de ces constituants dans l&#39;élution IgG. Les concentrations finales doivent être CaCl2 2 mM et 10 mM β-mercaptoéthanol. </li><li> Ajouter l&#39;échantillon à la résine de calmoduline et de se lier pendant 1 h (4 ° C) en utilisant un dispositif de rotation du tube. </li></ol></li><li> Emballage et élution de calmoduline Résine <ol><li> Préparer une colonne de poly-prep 2 ml par 100 ul de suspension de calmoduline en coupant l&#39;extrémité de la colonne pour créer une ouverture plane. Charger pas plus de 100 pi de calmoduline suspension par colonne pour réduire au minimum la quantité de résine de l&#39;échantillon entre en contact au cours de l&#39;élution. </li><li> Emballez la colonne par gravité et laver la résine dans la colonne trois fois avec 5 ml de calmoduline Binding Buffer. </li><li> Éluer la protéine avec addition de 200 ul calmoduline de tampon d&#39; élution (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM; mM d&#39; imidazole 5, pH 8,0, 4 mM d&#39; EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40, 10 mM de β-mercaptoéthanol). Répéter six fois l&#39;addition de 200 ul de tampon d&#39;élution calmoduline. </li><li> Pour élutions 1 à 3, appliquer le volume à la colonne et recueillir l&#39;éluat immédiatement. Pour l&#39;élution 4, sceller le fond de la colonne et on incube avec un tampon d&#39;élution pendant 2,5 min, puis desceller et laisser éluer par gravité. Pour l&#39;élution 5, incuber pendant 5 min, puis desceller et éluer. Pour l&#39;élution 6, incuber pendant 10 min, puis desceller et éluer. Remarque: L&#39;intégrité du complexe peut varier entre élutions / fractions (voir la section des résultats représentatifs) &lt;./ Li&gt; <li> Dialyser élutions 2 à 6, individuellement pendant une nuit en utilisant une méthode de dialyse de micro approprié. Dialyser les fractions de dialyse contre un tampon (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM, 5 mM d&#39; imidazole, pH 8, 10 mM de β-mercaptoéthanol). Remarque: NP-40 ne passe pas de façon appréciable, le cas échéant, à travers la membrane de dialyse. </li></ol></li></ol> 4. Post-purification Analyses pour évaluer la qualité Complex <ol><li> Gel natif et Silver Staining <ol><li> Préparer un 4 - gel natif de 16% préfabriqué pour l&#39;analyse du complexe selon les instructions du fabricant. Utiliser une protéine étalon de masse moléculaire appropriée et la charge 15 pi de chacune des calmoduline / élution des fractions dialysées sur le gel. </li><li> L&#39;électrophorèse du gel à 150 V pendant environ 3 heures (4 ° C). </li><li> Coloration à l&#39;argent du gel pour évaluer la qualité de chacun des six élutions. Vous pouvez également utiliser la même sensibilité commercialecolorant fluorescent (s). A ce stade, la concentration du complexe est très probablement au-dessous du niveau de détection pour la coloration au bleu de Coomassie. </li></ol></li><li> D&#39; autres méthodes d&#39; analyse Gel <ol><li> Pour détecter la protéine par Western blot, résoudre le complexe par SDS ou PAGE native puis sonder le gel pour l&#39;épitope calmoduline Reliure Peptide (CBP) en utilisant un anticorps TAP d&#39;étiquette selon les instructions du fabricant. </li><li> Au moyen d&#39;un colorant fluorescent spécifique (s), confirmer la présence et l&#39;intégrité de la protéine et / ou de l&#39;acide nucléique dans un complexe TAP purifié. Veillez à ce que pas de chevauchement spectral est détecté entre ces taches. </li></ol></li><li> Négatif Visualisation Stain Electron Microscopy <ol><li> Utiliser des grilles de carbone continues lueur déchargée à -15 mA pendant 30 secondes, à moins de 30 min d&#39;application complexe. </li><li> Appliquer 3 ul de complexe de robinet purifiée (typiquement à une concentration de 1 nM) sur la grille. Incuber pendant une minute. blot felon le côté de la grille pour éliminer l&#39;excès de tampon. </li><li> Laver deux fois avec 20 ul de gouttes d&#39;eau déminéralisée. blot latérale entre les lavages. </li><li> Appliquer la grille à un négatif chute de tache de 50 pi et incuber pendant une min. Coloration avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle (2%) ou le formiate d&#39;uranyle (0,75%) est recommandée. Attention: les sels et les solutions uranyle sont faiblement radioactifs et contiennent des métaux lourds. Ceux-ci doivent être manipulés avec soin et tout le matériel qui entre en contact avec ces solutions doivent être éliminés conformément aux directives de déchets recommandées institutionnels. </li><li> Appliquer la grille à un 50 pi coloration négative goutte frais, sans buvard. Incuber pendant une minute, puis côté blot, et enfin sécher à l&#39;air et de visualiser. </li></ol></li><li> Cryo Electron Microscopy (cryo-EM) Visualisation <ol><li> Effectuer cryo-EM avec un complexe TAP purifié, bien que l&#39;optimisation peut être nécessaire, selon le protocole du fabricant. Remarque: La présence de détergent à des concentrations élevées may entravent le progrès et est discuté ci-dessous. </li></ol></li></ol> 5. Complexe de stockage <ol><li> Préparation complexe pour le stockage <ol><li> Concentrer le complexe, le cas échéant, à l&#39;aide d&#39;un filtre centrifuge ayant un poids moléculaire de coupure appropriée pour le complexe. Spin à 14.000 xg pendant incréments de 1 min jusqu&#39;à ce que la concentration désirée soit atteinte. Remarque: la concentration de NP-40 augmente la concentration au cours de la concentration, car elle ne passe pas à travers la membrane filtrante, ni dialyse. </li><li> gel flash complexe en 30 aliquotes dans l&#39;azote liquide ou de la glace sèche refroidi bain d&#39;éthanol puis stocker à -80 ° C. </li></ol></li><li> Post-Purification en option Suppression de détergent </li></ol> Remarque: La présence d&#39;un détergent tel que le NP-40 et à une concentration supérieure à celle de sa concentration micellaire critique peut gêner ou inhiber la progression pour certaines applications. Les conséquences de son retrait de la protocol ainsi que le remplacement avec d&#39;autres additifs ou co-solvants sont discutés ci-dessous. En l&#39;absence de NP-40 est souhaitée, une solution consiste à utiliser une application commerciale pour l&#39;enlèvement, par exemple Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pré-Amener les disponibles dans le commerce absorbant détergentes perles dans Dialyse Buffer. Mélanger cinq perles par 30 pi de complexe (habituellement à une concentration de 10 nM). </li><li> Incuber perles équilibrées de l&#39;étape 5.2.1 avec TAP complexe purifié pendant 15 minutes sur la glace. Utilisez complexe en quelques heures après le retrait de détergent. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode TAP utilise deux balises qui équilibrent un besoin pour la liaison rigoureuse et sélective à une résine d&#39;affinité avec un désir de maintenir près des conditions de solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l&#39;interaction stable (s) de la protéine marquée avec l&#39;interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. En outre, la TAP individuelle étiqueté ORFs sont disponibles à partir d&#39;une source commerciale, de sorte que l&#39;on peut obtenir toute souche de lev...

De nombreux processus cellulaires majeurs sont réalisées par grandes protéines et protéines complexes ARN-1. Un goulot d&#39; étranglement important pour la réalisation d&#39; études biophysiques et structurelles de ces complexes est leur obtention d&#39;une qualité appropriée (c. -à- homogénéité) et à une concentration appropriée. Isoler un complexe à partir d&#39;une source naturelle présente de nombreux avantages, notamment en conservant les modifications post-transcriptionnel et / ou traductionnelles pertinentes des sous-unités et assurer l&#39;assemblage complexe approprié. Cependant, de grands complexes cellulaires sont souvent présents dans une cellule à un faible nombre de copies et la purification doivent être hautement efficace et se produire dans des conditions physiologiques proches pour assurer l&#39;intégrité complexe est maintenue. Purifier un complexe d&#39;une source eucaryote est particulièrement difficile et peut être financièrement prohibitif. Ainsi, les stratégies ou les méthodes qui sont efficaces et donnent un complexe homogène sont très recherchés. Une stratégie qui a étésuccès dans la purification des complexes natifs à partir de cellules eucaryotes pour leur caractérisation initiale est la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. La méthode TAP a été initialement conçu pour purifier une protéine native de la levure bourgeonnante (S. cerevisiae) dans un complexe avec l&#39; interaction facteur (s) 2. Le procédé utilisé TAP deux étiquettes, chaque étiquette fusionnée en tandem à la même séquence de gène codant pour la protéine. Les étiquettes ont été choisies de manière à équilibrer le besoin pour une liaison étanche et sélective sur une résine d&#39;affinité avec un désir de maintenir des conditions proches de la solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l&#39;interaction stable (s) de la protéine marquée avec l&#39;interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. L&#39;étiquette TAP génomiquement intégré est placé à l&#39;extrémité (C-terminale) d&#39;un gène codant pour une protéine et est composée d&#39;une séquence codant pour un calmoduline de liaison du peptide (PFC), suivie par la protéine A - une addition d&#39;un peu plus de 20 kDa à la tagged protéine. CBP est courte, 26 acides aminés, et reconnues par la protéine de 17 kDa ~ calmoduline (CaM) , en présence de calcium avec un Kd de l&#39;ordre de 10 -9 M 4. La balise protéine A est plus grand, composé de deux répétitions de 58 résidus avec un court lieur entre les répétitions. Chaque répétition d&#39;acides aminés 58 est reconnu par l&#39; immunoglobuline G (IgG) avec un Kd ~ 10 ~ 8 M 5. Entre ces deux balises a été incorporé un site de reconnaissance pour la protéase TEV, une endopeptidase du virus Tobacco Etch 6,7. Comme cela est illustré sur la figure 1, dans la première étape d&#39;affinité du procédé TAP protéine marquée est liée à une résine d&#39; IgG via la protéine A. La protéine marquée est éluée par sur une colonne de clivage lors de l&#39;addition de la protéase TEV, spécifique au site de clivage entre les deux balises. Ceci est une étape nécessaire que l&#39;interaction de l&#39;IgG et la protéine A est très forte et ne peut être perturbée de manière adéquate sous des conditions de dénaturation de la solution. Faute d&#39;un PrUne étiquette otein, la protéine est liée à la résine CaM en présence de calcium et on l&#39; élue de cette résine avec addition de l&#39;EGTA chélateur d&#39;ions métalliques (éthylène glycol d&#39;acide tétra - acétique) (figure 1). Peu après l&#39;introduction de la méthode TAP, il a été utilisé dans une étude à grande échelle pour générer une «carte» des interactions complexes dans S. 8 cerevisiae. Il est important, comme une conséquence de cet effort tout un cadre de levure TAP Tagged lecture ouvert (ORF) bibliothèque ainsi que TAP individuels marqués ORFs 9 sont disponibles à partir d&#39; une source commerciale. Ainsi, on peut obtenir toute souche de levure avec une protéine étiquetée pour chaque complexe de levure. La méthode TAP a également stimulé des modifications ou des variations de la balise TAP, y compris: son utilisation pour la purification des complexes provenant d&#39; autres eucaryotes, ainsi que des cellules bactériennes 10,11; la conception d&#39;un &quot;tag diviser&quot;, dans lequel la protéine A et CBP sont placés sur différentes protéines 12; et tags changés, de manière à tenir compte de la nécessité de l&#39;enquêteur, telles que la sensibilité du complexe Ca2 + EGTA ou 13. Les progrès récents dans les deux instruments et la méthodologie ont permis des avancées significatives dans l&#39;application de la microscopie électronique (EM) pour la détermination de la structure, qui ont conduit à haute, près des images de résolution atomiques des complexes macromoléculaires 14. La résolution obtenue d&#39;un complexe par EM, cependant, reste subordonnée à la qualité du complexe à l&#39;étude. Cette étude a utilisé l&#39;approche TAP tag pour purifier de S. cerevisiae U1 snRNP, un 18 sous-unité (~ 0,8 MDa) complexe ribonucléoprotéine faible nombre de copies qui fait partie de l&#39;épissage 15,16. Un certain nombre de mesures ont été prises pour purifier ce complexe de telle sorte qu&#39;il est homogène et d&#39;une concentration adéquate. Les problèmes potentiels rencontrés à diverses étapes de la purification sont décrits et les stratégies prises pour surmonter challenges mis en évidence. Par soigneusement évaluer et d&#39;optimiser les étapes de la purification, l&#39;U1 snRNP purifié est d&#39;une qualité et à une quantité appropriée pour coloration négative et électronique cryo microscopie études (cryo-EM). Un optimisé TAP méthode protocole pour la purification des complexes natifs pour des études structurales est décrit ici.

<table><tbody><tr><td>Souche de S. cerevisiae marquée TAP</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Il s’agit de la souche de levure primaire utilisée pour développer le protocole TAP. Son origine est S288C : ATCC 201388 : MATa, his3&Delta ; 1, leu2 et Delta ; 0, met15 et Delta ; 0, ura3 et Delta ; 0, SNU71 ::TAP ::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Moulin à café</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Utilisé pour la lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Hémocytomètre, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Utilisé pour évaluer la lyse cellulaire</td></tr><tr><td>JA 9.100 rotor de centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilisé pour récolter les cellules de levure</td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse à angle fixe JA 20</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilisé pour éliminer l’extrait cellulaire non soluble du rotor de</td></tr><tr><td>centrifugeuse à angle fixe Ti 60</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilisé pour clarifier davantage l’extrait cellulaire soluble</td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Agitateur à température contrôlée</td></tr><tr><td>Système de gel Novex</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Résine IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td> Résine Calmoduline <td>à flux rapide Sepharose 6</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Résine Affinity Cocktail d’inhibiteurs</td></tr><tr>de<td>protéase, mini comprimés</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra sans EDTA</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase, grands comprimés</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra sans EDTA</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissous dans de l’isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratoires, Inc.</td><td>7326008</td><td>Utilisé pour emballer et laver la résine Calmodulin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep</td><td>colonne Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Utilisé pour emballer et laver la résine IgG</td></tr><tr><td>Gels natifs PAGE Bis-Tris préfabriqués</td> Life <td>Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16 % gels polyacrylamides préfabriqués Étalon de</td></tr><tr><td>protéines NativeMark Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Étalon de protéines non colorées utilisé pour PAGE natif. Charge 7,5 &mu ; l pour un gel teinté d’argent et 5 &mu ; l pour un gel SYPRO Rubis coloré</td></tr><tr><td>Préfabriqué SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12 % gels préfabriqués de polyacrylamide&nbsp ;</td></tr><tr><td>Étalon protéique PageRuler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Étalon protéique non coloré utilisé pour le</td></tr><tr><td>tampon de fonctionnement SDS</td> de transfert Western Life <td>Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS</td></tr><tr><td>Buffer TAP</td><td>anticorps Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Anticorps primaire contre l’étiquette CBP</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Chèvre anti-phosphatase alcaline de lapin conjuguée</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tétrazolium&nbsp ;</td></tr><tr><td>Unités de dialyse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Mini unités de dialyse Slide-A-Lyzer</td></tr><tr><td>Unités de filtration centrifuges, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Unité de filtration centrifuge avec membrane Ultracel-100</td></tr><tr><td>Billes absorbant les détergents</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bille SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Colorant fluorescent pour la coloration des acides nucléiques, lors de la détection avec SYPRO Ruby présent, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 532 nm</td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>SYPRO Ruby</td><td>S-12000</td><td>Colorant fluorescent pour la coloration des protéines, lors de la détection avec SYBR Green II présent, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 457 nm et une longueur d’onde d’émission de 670 nm</td></tr><tr><td>Grilles de cuivre</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification de native complexes pour l&#39;étude structurale utilisant une méthode de tag tandem affinity

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

approches de purification d&#39;affinité ont réussi à isoler des complexes indigènes pour la caractérisation protéomique. hétérogénéité structurelle et un degré d&#39;hétérogénéité de la composition d&#39;un complexe ne gênent généralement pas les progrès accomplis dans la réalisation de telles études. En revanche, un complexe destiné à la caractérisation structurale doit être purifié dans un état qui est à la fois de composition et de structure homogène ainsi qu&#39;à une concentration plus élevée que celle requise pour la protéomique. Récemment, il y a eu des avancées significatives dans l&#39;application de la microscopie électronique pour la détermination de structure de grands complexes macromoléculaires. Cela a accru l&#39;intérêt dans les approches pour purifier des complexes indigènes de qualité et en quantité suffisante pour la détermination structurale par microscopie électronique. La méthode Tandem Affinity Purification (TAP) a été optimisé pour extraire et purifier une 18 sous-unité, ~ 0,8 MDa ribonucléoprotéine ensemble de levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; approprié pour coloration négative et la microscopie cryo électronique. Ici est détaillée les modifications apportées à la méthode TAP, la justification de ces changements, et les approches adoptées pour doser un complexe de composition et de structure homogène.

Procédé TAP modifié a été utilisé pour purifier à partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un complexe de ribonucléoprotéine 18 sous-unité. Une purification TAP initiale du complexe suivant le protocole publié 2,3- a abouti à un complexe qui est apparu hétérogène, la migration en trois bandes sur un gel coloré à l&#39; argent de Polyacrylamide natif (Figure 2A). Plusieurs tours d&#39;optimisation de la méthode TAP, on a obtenu un complexe qui a migré comme é...

La méthode de purification par affinité en tandem (TAP) a été largement utilisée pour isoler des complexes natifs à partir d’extraits cellulaires, principalement eucaryotes, pour la protéomique. Ici, nous présentons un protocole de méthode TAP optimisé pour la purification de complexes natifs pour des études structurales.

Purification de Native Complexes pour l&#39;étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

L'objectif général de ce protocole est de purifier un complexe macromoléculaire natif de qualité adéquate pour des études biophysiques. Ce protocole sert non seulement à purifier un complexe, mais également comme guide détaillé pour évaluer la qualité structurale de l'échantillon au cours de la purification. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet de purifier un assemblage natif dans des conditions proches des conditions physiologiques de manière simple et rapide, afin d'assurer une homogénéité compositionnelle.Après centrifugation des cellules de S.cerevisiae et décantation du surnageant selon le protocole décrit, ajouter deux millilitres de tampon de lyse glacé et agiter doucement ou utiliser une pipette serologique de 10 millilitres pour resuspendre le culot. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres vide, maintenu sur glace. Ensuite, utiliser deux millilitres supplémentaires de tampon de lyse glacé pour rincer chaque flacon de centrifugeuse et ajouter la solution dans le tube de 50 millilitres.Après avoir déterminé la masse humide du culot cellulaire, préparez un bain d'azote liquide autour d'un tube conique en polypropylène de 50 millilitres. Ensuite, aspirez les cellules en suspension dans une seringue de cinq millilitres et fixez une aiguille de calibre 16 à la seringue. Puis, congélez la suspension cellulaire en la faisant passer à travers la seringue et l'aiguille dans le bain, à un débit d'environ un millilitre par minute, afin de former des gouttelettes.Pour lyser les cellules de levure, commencez par utiliser de l'azote liquide afin de refroidir préalablement un moulin à café. Ajoutez ensuite jusqu'à 40 grammes de cellules de levure et broyez pendant 25 secondes, en répétant le broyage huit ou neuf fois. Il est recommandé de ne pas purifier plus de 10 litres de culture cellulaire en une seule fois.Cela réduit au minimum le temps de purification et garantit le maintien de l'intégrité structurale du complexe. Après chaque deux cycles de broyage, ajoutez une fine couche d'azote liquide au broyeur et laissez-le s'évaporer. Pour éviter l'agglomération des cellules, empêchez-les de dégeler en utilisant une spatule refroidie à l'azote liquide pour les remuer.Après la lyse, les cellules doivent apparaître sous forme d'une fine poudre blanche. Après avoir vérifié la lyse cellulaire et préparé le tampon de lyse avec du PMSF, du DTT et des inhibiteurs de protéase selon le protocole indiqué, utilisez une spatule refroidie à l'azote liquide pour prélever progressivement la poudre congelée de cellules lysées et l'ajouter dans les tubes de 50 millilitres contenant le tampon préparé. À chaque ajout, faites tourner doucement les tubes de 50 millilitres à température ambiante afin de décongeler et de dissoudre les cellules, tout en évitant la formation de bulles.À mesure que les cellules se dissolvent, ajoutez davantage de poudre cellulaire. Une fois toutes les cellules ajoutées, poursuivez le dégel et la dissolution jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de grumeaux cellulaires congelés visibles dans les tubes. Cette étape devrait prendre environ 50 minutes.Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire à 25 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois les cellules lysées et après la centrifugation, vous pouvez observer une fine couche sombre dans le culot insoluble. Transférez le surnageant dans des tubes en polycarbonate pour ultracentrifugeuse et ajoutez 10 microlitres de PMSF à 200 millimolaire à chaque tube complet.Centrifuger les échantillons à 100 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant une heure. À la fin de la centrifugation, quatre couches doivent être visibles : un culot dur et transparent contenant principalement des complexes ribosomaux ; un culot mou riche en lipides ; une couche claire et jaunâtre de grande taille contenant la majorité des protéines et des complexes solubles de la cellule ; et une couche supérieure écailleuse constituée de lipides.Dans une pièce froide à quatre degrés Celsius, utilisez une pipette d'un millilitre pour éliminer autant que possible la couche lipidique supérieure écailleuse et jetez-la. Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour récupérer la majeure partie de la couche jaune claire. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre afin de ne pas perturber les deux couches inférieures, récupérez les derniers millilitres de cette couche.À partir de 40 grammes de culot cellulaire humide, environ 48 millilitres de la couche intermédiaire sont généralement récupérés. Après avoir préparé la sépharose IgG selon le protocole décrit, mélanger la résine IgG avec le surnageant de la phase intermédiaire et deux comprimés d'inhibiteur de protéase mini par 40 grammes de cellules. Incuber ensuite sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant deux heures.Ceci est la solution de lot d'IgG. Préparez deux colonnes Polyprep de 10 millilitres en coupant les extrémités des colonnes afin d'obtenir une ouverture plane. Versez 24 millilitres de la solution tampon de résine IgG en suspension ou de solution de lot dans chaque colonne, puis laissez sédimenter par gravité.Cela correspond à 200 microlitres de résine IgG compactée. Si la sédimentation prend plus de 30 minutes, la phase intermédiaire pourrait être contaminée par des lipides. Une fois la sédimentation terminée, utilisez quatre volumes successifs de 10 millilitres de tampon IgG D150 pour laver la colonne compactée.Pour effectuer le clivage par la protéase du virus de la mosaïque de la tomate (TEV) sur la colonne, obturer le bas de la colonne et ajouter un millilitre de tampon IgG D150 ainsi que 100 microlitres de protéase TEV. Fermer le haut de la colonne et, à l’aide d’un mélangeur thermique à 750 tr/min et à 18 degrés Celsius, mélanger pendant 20 minutes. Résuspendre la résine et mélanger à nouveau pendant 20 minutes.Ensuite, re-suspendre et répéter le mélange de 20 minutes une troisième fois. Replacer la colonne à quatre degrés Celsius et utiliser la gravité pour éluer le complexe protéique. Puis, ajouter 200 microlitres d'IgG D150 pour éluer le volume mort.Après avoir préparé la résine d'affinité à la calmoduline selon le protocole décrit, ajoutez le tampon de liaison à la calmoduline et l'échantillon à la résine, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure à l'aide d'un rotateur de tube. Préparez une colonne Polyprep de deux millilitres par 100 microlitres de suspension de calmoduline en coupant l'extrémité de la colonne afin de créer une ouverture plane. Le protocole précise les volumes spécifiques de tampon et de résidence choisis de manière à maintenir le complexe concentré et à minimiser son temps de séjour sur la résine.Si le volume de culture est modifié, il est recommandé d'ajuster en conséquence les volumes de résine et de tampon des colonnes à gravité. Remplissez la colonne avec pas plus de 100 microlitres de suspension de calmoduline et, par gravité, utilisez 5 millilitres de tampon de liaison à la calmoduline pour laver la résine trois fois. À l’aide de 200 microlitres de tampon d’élution de la calmoduline, éluerez la protéine trois fois.Ensuite, obturez le bas de la colonne et ajoutez 20 microlitres de tampon d'élution. Incubez pendant 2,5 minutes avant de retirer l'obturation et de laisser le protéine s'éluer par gravité. Obturer à nouveau le bas de la colonne et ajouter 200 microlitres de tampon d'élution avant d'incuber pendant cinq minutes. Ensuite, retirez l'obturation du bas de la colonne et éluerez la solution.Pour la sixième et dernière élution, fermez le bas de la colonne et incubez avec le tampon d'élution pendant 10 minutes. Ensuite, débouchez et effectuez l'élution. Réalisez l'analyse post-purification et conservez les échantillons conformément au protocole décrit.Comme illustré ici, une purification initiale par TAP du complexe, réalisée selon un protocole publié, a produit un complexe qui migrait sous forme de trois bandes sur un gel coloré à l'argent. Plusieurs cycles d'optimisation de la méthode TAP nous ont permis d'obtenir un complexe qui migre sous forme d'une seule bande sur un gel natif, ce qui indique un assemblage plus homogène. En accord avec le résultat obtenu sur gel natif, un immunoblot réalisé à l'aide d'un anticorps anti-TAP dirigé contre le complexe, purifié selon le protocole publié, a révélé une protéolyse de la protéine marquée TAP, SNU-71.Les modifications de la méthode TAP ont considérablement réduit la quantité de protéolyse, puisque presque toutes les 17 protéines du complexe U1 snRNP ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE et identifiées positivement par spectrométrie de masse en tandem. La microscopie électronique en contraste négatif révèle des particules monodispersées provenant d'une purification réussie après les première et deuxième étapes de la méthode TAP. En revanche, aucune particule de la taille correcte n'est observée lorsque la purification échoue.La qualité finale du complexe a été évaluée sur une pellicule de particules purifiées, illustrée ici, qui apparaissent monodispersées sur l'image brute de microscopie électronique en coloration négative. De plus, les moyennes de classe des particules révèlent des caractéristiques distinctes indiquant que l'échantillon pourrait être approprié pour une étude structurale. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en 10 à 12 heures après décongélation de la poudre de cellules lysées congelée.Lors du suivi de ce protocole, il est important de s'assurer que toutes les solutions sont exemptes de protéases et de nucléases, ainsi que de travailler rapidement afin d'éviter l'agrégation ou la dissociation du complexe. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment purifier un complexe natif de qualité adéquate pour une étude structurale, ainsi que la manière d'évaluer si cet objectif a été atteint.

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