Purification de Native Complexes pour l'étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

L'objectif général de ce protocole est de purifier un complexe macromoléculaire natif de qualité adéquate pour des études biophysiques. Ce protocole sert non seulement à purifier un complexe, mais également comme guide détaillé pour évaluer la qualité structurale de l'échantillon au cours de la purification. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet de purifier un assemblage natif dans des conditions proches des conditions physiologiques de manière simple et rapide, afin d'assurer une homogénéité compositionnelle.

Après centrifugation des cellules de S.cerevisiae et décantation du surnageant selon le protocole décrit, ajouter deux millilitres de tampon de lyse glacé et agiter doucement ou utiliser une pipette serologique de 10 millilitres pour resuspendre le culot. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres vide, maintenu sur glace. Ensuite, utiliser deux millilitres supplémentaires de tampon de lyse glacé pour rincer chaque flacon de centrifugeuse et ajouter la solution dans le tube de 50 millilitres.

Après avoir déterminé la masse humide du culot cellulaire, préparez un bain d'azote liquide autour d'un tube conique en polypropylène de 50 millilitres. Ensuite, aspirez les cellules en suspension dans une seringue de cinq millilitres et fixez une aiguille de calibre 16 à la seringue. Puis, congélez la suspension cellulaire en la faisant passer à travers la seringue et l'aiguille dans le bain, à un débit d'environ un millilitre par minute, afin de former des gouttelettes.

Pour lyser les cellules de levure, commencez par utiliser de l'azote liquide afin de refroidir préalablement un moulin à café. Ajoutez ensuite jusqu'à 40 grammes de cellules de levure et broyez pendant 25 secondes, en répétant le broyage huit ou neuf fois. Il est recommandé de ne pas purifier plus de 10 litres de culture cellulaire en une seule fois.

Cela réduit au minimum le temps de purification et garantit le maintien de l'intégrité structurale du complexe. Après chaque deux cycles de broyage, ajoutez une fine couche d'azote liquide au broyeur et laissez-le s'évaporer. Pour éviter l'agglomération des cellules, empêchez-les de dégeler en utilisant une spatule refroidie à l'azote liquide pour les remuer.

Après la lyse, les cellules doivent apparaître sous forme d'une fine poudre blanche. Après avoir vérifié la lyse cellulaire et préparé le tampon de lyse avec du PMSF, du DTT et des inhibiteurs de protéase selon le protocole indiqué, utilisez une spatule refroidie à l'azote liquide pour prélever progressivement la poudre congelée de cellules lysées et l'ajouter dans les tubes de 50 millilitres contenant le tampon préparé. À chaque ajout, faites tourner doucement les tubes de 50 millilitres à température ambiante afin de décongeler et de dissoudre les cellules, tout en évitant la formation de bulles.

À mesure que les cellules se dissolvent, ajoutez davantage de poudre cellulaire. Une fois toutes les cellules ajoutées, poursuivez le dégel et la dissolution jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de grumeaux cellulaires congelés visibles dans les tubes. Cette étape devrait prendre environ 50 minutes.

Ensuite, centrifuger le lysat cellulaire à 25 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois les cellules lysées et après la centrifugation, vous pouvez observer une fine couche sombre dans le culot insoluble. Transférez le surnageant dans des tubes en polycarbonate pour ultracentrifugeuse et ajoutez 10 microlitres de PMSF à 200 millimolaire à chaque tube complet.

Centrifuger les échantillons à 100 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant une heure. À la fin de la centrifugation, quatre couches doivent être visibles : un culot dur et transparent contenant principalement des complexes ribosomaux ; un culot mou riche en lipides ; une couche claire et jaunâtre de grande taille contenant la majorité des protéines et des complexes solubles de la cellule ; et une couche supérieure écailleuse constituée de lipides.

Dans une pièce froide à quatre degrés Celsius, utilisez une pipette d'un millilitre pour éliminer autant que possible la couche lipidique supérieure écailleuse et jetez-la. Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour récupérer la majeure partie de la couche jaune claire. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre afin de ne pas perturber les deux couches inférieures, récupérez les derniers millilitres de cette couche.

À partir de 40 grammes de culot cellulaire humide, environ 48 millilitres de la couche intermédiaire sont généralement récupérés. Après avoir préparé la sépharose IgG selon le protocole décrit, mélanger la résine IgG avec le surnageant de la phase intermédiaire et deux comprimés d'inhibiteur de protéase mini par 40 grammes de cellules. Incuber ensuite sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Ceci est la solution de lot d'IgG. Préparez deux colonnes Polyprep de 10 millilitres en coupant les extrémités des colonnes afin d'obtenir une ouverture plane. Versez 24 millilitres de la solution tampon de résine IgG en suspension ou de solution de lot dans chaque colonne, puis laissez sédimenter par gravité.

Cela correspond à 200 microlitres de résine IgG compactée. Si la sédimentation prend plus de 30 minutes, la phase intermédiaire pourrait être contaminée par des lipides. Une fois la sédimentation terminée, utilisez quatre volumes successifs de 10 millilitres de tampon IgG D150 pour laver la colonne compactée.

Pour effectuer le clivage par la protéase du virus de la mosaïque de la tomate (TEV) sur la colonne, obturer le bas de la colonne et ajouter un millilitre de tampon IgG D150 ainsi que 100 microlitres de protéase TEV. Fermer le haut de la colonne et, à l’aide d’un mélangeur thermique à 750 tr/min et à 18 degrés Celsius, mélanger pendant 20 minutes. Résuspendre la résine et mélanger à nouveau pendant 20 minutes.

Ensuite, re-suspendre et répéter le mélange de 20 minutes une troisième fois. Replacer la colonne à quatre degrés Celsius et utiliser la gravité pour éluer le complexe protéique. Puis, ajouter 200 microlitres d'IgG D150 pour éluer le volume mort.

Après avoir préparé la résine d'affinité à la calmoduline selon le protocole décrit, ajoutez le tampon de liaison à la calmoduline et l'échantillon à la résine, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure à l'aide d'un rotateur de tube. Préparez une colonne Polyprep de deux millilitres par 100 microlitres de suspension de calmoduline en coupant l'extrémité de la colonne afin de créer une ouverture plane. Le protocole précise les volumes spécifiques de tampon et de résidence choisis de manière à maintenir le complexe concentré et à minimiser son temps de séjour sur la résine.

Si le volume de culture est modifié, il est recommandé d'ajuster en conséquence les volumes de résine et de tampon des colonnes à gravité. Remplissez la colonne avec pas plus de 100 microlitres de suspension de calmoduline et, par gravité, utilisez 5 millilitres de tampon de liaison à la calmoduline pour laver la résine trois fois. À l’aide de 200 microlitres de tampon d’élution de la calmoduline, éluerez la protéine trois fois.

Ensuite, obturez le bas de la colonne et ajoutez 20 microlitres de tampon d'élution. Incubez pendant 2,5 minutes avant de retirer l'obturation et de laisser le protéine s'éluer par gravité. Obturer à nouveau le bas de la colonne et ajouter 200 microlitres de tampon d'élution avant d'incuber pendant cinq minutes. Ensuite, retirez l'obturation du bas de la colonne et éluerez la solution.

Pour la sixième et dernière élution, fermez le bas de la colonne et incubez avec le tampon d'élution pendant 10 minutes. Ensuite, débouchez et effectuez l'élution. Réalisez l'analyse post-purification et conservez les échantillons conformément au protocole décrit.

Comme illustré ici, une purification initiale par TAP du complexe, réalisée selon un protocole publié, a produit un complexe qui migrait sous forme de trois bandes sur un gel coloré à l'argent. Plusieurs cycles d'optimisation de la méthode TAP nous ont permis d'obtenir un complexe qui migre sous forme d'une seule bande sur un gel natif, ce qui indique un assemblage plus homogène. En accord avec le résultat obtenu sur gel natif, un immunoblot réalisé à l'aide d'un anticorps anti-TAP dirigé contre le complexe, purifié selon le protocole publié, a révélé une protéolyse de la protéine marquée TAP, SNU-71.

Les modifications de la méthode TAP ont considérablement réduit la quantité de protéolyse, puisque presque toutes les 17 protéines du complexe U1 snRNP ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE et identifiées positivement par spectrométrie de masse en tandem. La microscopie électronique en contraste négatif révèle des particules monodispersées provenant d'une purification réussie après les première et deuxième étapes de la méthode TAP. En revanche, aucune particule de la taille correcte n'est observée lorsque la purification échoue.

La qualité finale du complexe a été évaluée sur une pellicule de particules purifiées, illustrée ici, qui apparaissent monodispersées sur l'image brute de microscopie électronique en coloration négative. De plus, les moyennes de classe des particules révèlent des caractéristiques distinctes indiquant que l'échantillon pourrait être approprié pour une étude structurale. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en 10 à 12 heures après décongélation de la poudre de cellules lysées congelée.

Lors du suivi de ce protocole, il est important de s'assurer que toutes les solutions sont exemptes de protéases et de nucléases, ainsi que de travailler rapidement afin d'éviter l'agrégation ou la dissociation du complexe. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment purifier un complexe natif de qualité adéquate pour une étude structurale, ainsi que la manière d'évaluer si cet objectif a été atteint.