Purification de nanoparticules de protéines auto-assemblées à l’aide de la chromatographie d’affinité

Prenez une suspension de bactéries modifiées exprimant des nanoparticules de protéines recombinantes auto-assemblées avec des marqueurs de polyhistidine.

Sonicate pour libérer les composants intracellulaires.

Centrifugeuse pour recueillir le surnageant contenant des nanoparticules de protéines. Diluez-le avec un tampon sans imidazole.

Prenez une colonne de chromatographie d’affinité contenant des billes d’agarose avec des cations nickel immobilisés.

Ajouter un tampon à faible concentration d’imidazole pour l’équilibrage de la colonne.

Ajoutez le lysat bactérien sur la colonne.

Au cours de l’exploitation, la polyhistidine sur les nanoparticules de protéines se lie fortement aux cations nickel.

Pendant ce temps, les contaminants tels que les lipopolysaccharides bactériens et d’autres protéines se lient faiblement à la colonne.

Laver avec un tampon contenant une faible concentration d’imidazole pour éliminer les protéines faiblement liées.

Introduisez de l’isopropanol pour éliminer les lipopolysaccharides, puis lavez.

Ensuite, introduisez un tampon avec une concentration intermédiaire d’imidazole. L’imidazole entre en compétition avec l’histidine pour se lier au cation nickel, libérant ainsi des nanoparticules de protéines liées.

Ensuite, ajoutez un tampon contenant une concentration élevée d’imidazole pour éluer complètement les nanoparticules de protéines.

Collectez les nanoparticules de protéines purifiées pour une application ultérieure.

Pour la lyse d’E. coli récolté exprimant le faisceau de six hélices SAPN, utilisez une sonde avec une sonication de sortie de 150 watts, avec quatre secondes de sonication et six secondes de repos pour soniquer les pastilles bactériennes remises en suspension dans 40 millilitres de tampon sans imidazole sur de la glace pendant cinq minutes.

Centrifugez le lysat cellulaire pour générer un surnageant clarifié et transférez le surnageant dans une fiole stérile de 150 millilitres. Ensuite, amenez l’échantillon à un volume final de 100 millilitres avec un tampon frais sans imidazole.

Pour isoler la protéine d’intérêt, ouvrez le logiciel FPLC et cliquez sur l’option Nouvelle méthode. Dans le menu Paramètres de méthode, ouvrez le menu déroulant Position de la colonne et sélectionnez C1 Port 3. Dans le menu déroulant Montré par la technique, sélectionnez Affinité. Dans le menu déroulant Type de colonne, sélectionnez Autres, HisTrap HP et cinq millilitres. Le volume de la colonne et les boîtes de pression seront automatiquement réglés sur les valeurs appropriées.

Cliquez sur Plan de méthode et faites glisser les boutons Équilibrage et Application d’échantillons, trois boutons Lavage de colonne et le bouton Élution depuis le menu local Bibliothèque de phases en regard de la flèche, avant de fermer le menu Bibliothèque de phases. Cliquez sur Equilibration (Equilibration) et définissez les valeurs répertoriées dans le tableau sur Tampon initial B (4 %), Tampon final B (4 %) et Volume de colonne (5).

Cliquez sur Exemple d’application. Dans la zone Chargement de l’échantillon, cliquez sur la case d’option Injecter l’échantillon sur la colonne avec la pompe d’échantillonnage et vérifiez que la case à côté de Utiliser le débit à partir des paramètres de méthode est cochée dans l’injection d’échantillon avec système Pump Box. Définissez la valeur de la zone Volume sur 100 millilitres et le Schéma de collecte des fractions sur Activer.

Décochez la case Utiliser la taille de fraction dans les paramètres de méthode et modifiez la taille de la fraction à quatre millilitres. Cliquez sur le premier bouton Lavage de colonne. Définissez les valeurs répertoriées dans le tableau sur Tampon initial B, 4 %, Tampon final B, 4 % et Volume de colonne, 10. Cochez la case Activer le schéma de collecte de fractions et décochez l’option Utiliser la taille de fraction pour les paramètres de méthode. Changez la taille de la fraction à quatre millilitres et cliquez sur le deuxième bouton Lavage de colonne.

Définissez les valeurs de la table sur Tampon initial B, 0 %, Tampon final B, 0 % et Volume de colonne, 5. Cochez la case Activer le schéma de collecte de fractions et décochez l’option Utiliser la taille de fraction dans les paramètres de méthode. Changez la taille de la fraction à 4 millilitres et cliquez sur le bouton Lavage de la troisième colonne. Définissez les valeurs de la table sur Tampon initial B, 0 %, Tampon final B, 0 % et Volume de colonne, 10. Cliquez sur le bouton Activer le schéma de collecte de fractions et décochez la case Utiliser la taille de fraction pour les paramètres de méthode. Ensuite, changez la taille de la fraction à 4 millilitres.

Cliquez sur le bouton Elution et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les informations dans le tableau. Dans le menu contextuel, cliquez sur Supprimer l’étape et faites glisser le bouton Dégradé isocratique sur la table deux fois pour qu’il y ait deux entrées. Définissez la valeur de la première entrée sur Tampon initial B, 30 %, Tampon final B, 30 % et Volume de colonne, 10.

Définissez la valeur de la deuxième entrée sur Tampon initial B, 100 %, Tampon final B, 100 % et Volume de colonne, 10. Cliquez sur le bouton Activer le schéma de collecte de fractions, puis sur la zone Utiliser la taille de fraction pour les paramètres de méthode. Ensuite, cliquez sur Enregistrer sous et nommez le fichier, Purification.

Placez le tube de la pompe A du FPLC dans le tampon de lavage sans imidazole et le tube de la pompe B dans le tampon imidazole de 500 millimolaires. Placez le tube de la pompe d’échantillonnage dans l’échantillon de 100 millilitres et lancez le programme de purification. Lorsque le lavage à 60 % d’isopropanol est nécessaire, mettez le programme en pause, déplacez le tube de la pompe du lavage sans imidazole au lavage à 60 % d’isopropanol et redémarrez le programme. À la fin du lavage, mettez à nouveau le programme en pause, remettez le tube de la pompe A dans le tampon de lavage sans imidazole et redémarrez le programme de purification.