Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

Générer des macrophages dérivés de la moelle osseuse pour l’analyse de polarisation. Les os du fémur et du tibia sont isolés chez la souris et les cellules de la moelle osseuse sont prélevées. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu contenant des facteurs de croissance pour induire la formation de macrophages.

Après sept jours de culture, les macrophages dérivés de la moelle osseuse sont traités avec divers stimuli et des macrophages polarisés. Les réponses d’activation sont analysées par cytométrie en flux, PCR en temps réel et les résultats de l’analyse des blos de Western sont obtenus qui montrent une grande pureté des macrophages dérivés de la moelle osseuse avec des réponses d’activation polarisées à M1 ou M deux. Les stimuli mentent.

L’implication de cette technique est pour le traitement ou le diagnostic des maladies associées à la diversité, y compris la résistance à l’insuline et les CRO, car les macrophages infiltrant T sont un acteur majeur dans ce contexte, la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’accélération de la cellule de la moelle osseuse est quelque peu difficile et le rendement est critique pour obtenir une préparation cellulaire suffisante pour induire la formation de macrophages Fonctionner dans un capot stérile. Commencez ce protocole avec des os du fémur et du tibia isolés de souris âgées de six à huit semaines dans une boîte de culture tissulaire. Rincez les os dans du PBS puis utilisez des ciseaux pour ouvrir les deux extrémités des os, en prenant soin de ne pas trop en retirer tout en tenant l’os avec une pince.

Insérez une aiguille de calibre 21 sur 23 avec une seringue de 10 millilitres contenant du PBS froid avec 2 % de FBS activé par chauffage dans une extrémité de l’os. Appuyez sur le piston pour rincer la moelle dans une nouvelle boîte de culture tissulaire. Ensuite, passez la moelle dans la même aiguille quatre à six fois pour dissocier les cellules.

Versez ensuite les cellules dans une passoire cellulaire de 70 microns pour éliminer les amas de cellules, les os, les cheveux et d’autres cellules ou tissus. Recueillir le débit dans un tube conique de 50 millilitres. Une fois que la solution est passée à travers le filtre, ajoutez trois volumes de chlorure d’ammonium à 0,8 % au flux et incubez sur de la glace pendant 10 minutes.

Pour éliminer les globules rouges après l’incubation, faites tourner les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 à 50 millilitres de PBS froid avec 2 % FBS. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Faites tourner les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes de quatre degrés Celsius. Après avoir versé le supinate. Procéder à l’induction de la formation de BMDM comme décrit dans la section suivante du protocole Pour induire la formation de BMDM Resus, suspendre les cellules isolées de la moelle osseuse dans le milieu de croissance de la BMDM à une concentration de deux fois.

Centrez les six cellules par millilitre en grainant une à deux fois 10 dans les six cellules de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de six ou 12 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius. L’ensemencement à cette concentration facilitera le détachement pour la cytométrie en flux après trois jours. Passer à un milieu de croissance BMDM frais le septième jour.

La formation de la DMBO mature est évaluée à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux et d’anticorps conjugués au fluorole pour détecter les cellules exprimant les CD 11 B et F quatre 80. Après avoir vérifié la formation d’une BMDM mature, passer au milieu d’écho modifié de l’anse avec 10 % FBS et LPS ou LPS et interféron gamma pour l’activation de M1 ou IL quatre ou IL 13 pour l’activation de M deux. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius après 24 heures.

Récupérez les MDM stimulés en les détachant de la parabole. Pour ce faire, retirez le milieu des cellules et lavez-le avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ajoutez ensuite de la trypsine tiède à 0,05 % contenant 0,48 millimolaire, incubez l’EDTA à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes maximum pour éviter la perte de protéines de surface due à une digestion excessive.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS contenant 10 % de FBS et transférez-les dans des tubes d’échantillon de 1,2 millilitre. Utilisez des anticorps pour détecter l’expression d’antigènes de surface cellulaire, y compris CD 11 BF quatre 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 ou CD 86 à divers points temporels. Utilisation de procédures de coloration par cytométrie en flux standard par PCR quantitative.

Déterminer les niveaux d’expression d’IL un bêta TNF alpha et d’IL six pour évaluer l’activation de M1 ou d’IL 10, d’IL 13, d’arginase un et de PPAR gamma pour évaluer l’activation de M deux. Enfin, effectuez un western blot pour évaluer l’activation des voies de signalisation cellulaire impliquées dans l’activation des macrophages M1 ou M, deux macrophages, afin d’évaluer la pureté de la DMO mature. Après l’induction, une analyse cytométrique en flux a été réalisée à l’aide d’anticorps contre les CD 11 BF quatre 80, CD 11 C et CD 2 0 6 B.Les MDM ont d’abord été contrôlés par FSC et SSC pour éliminer les ANREF et les conjugués.

Les MDM matures b ont été définies comme CD 11 B positif F quatre sous-populations 80 positives, qui sont observées dans le coin supérieur droit de ce graphique et ont compromis 95 à 99 % de la population fermée pour évaluer la polarisation des macrophages. Une analyse plus approfondie a été effectuée. Le premier gating a été effectué pour identifier les macrophages infiltrés dans les tissus, qui sont des cellules CD 11 B positives F quatre 80 positives.

Parmi ces macrophages M1, qui sont CD 11 C positif et CD 2 0 6 négatif, apparaissent dans le quadrant deux, tandis que les macrophages M deux, qui sont CD 11 C négatif et CD 2 0 6 positif, apparaissent dans le quadrant quatre. Pour évaluer l’activation des macrophages, les cellules ont été incubées soit avec du LPS pour induire l’activation de M1, soit avec de l’IL quatre pour l’activation de M deux. Lors de l’activation, la taille des macrophages a augmenté, comme en témoigne le décalage du FSCA des macrophages M1 ou M deux 24 heures après la stimulation par rapport à M zéro non traité.

Les marqueurs de surface liés à l’activation des macrophages ont également été analysés après stimulation. Les marqueurs de réponse précoce CD 69 ont été évalués cinq ou 24 heures après la stimulation, les marqueurs CD 80 et CD 86 ont été analysés 48 heures après la stimulation. Comme le montre ici, une abondance accrue de CD 69, CD 80 et CD 86 de surface a été observée dans les macrophages stimulés pour évaluer l’activation classique et alternative des macrophages.

Ceux stimulés avec du LPS ou de l’IL quatre pendant 24 heures ont été collectés et l’ARN total a été extrait pour analyse par PCR quantitative en temps réel, comme indiqué ici. Une expression élevée de l’arginase un et de l’expression gamma de PPAR a été détectée dans les macrophages M deux par rapport à l’expression de cytokines pro-inflammatoires dans les macrophages non traités. L’augmentation de l’interleukine un bêta TNF alpha dans les macrophages M1 pour évaluer l’activation de la voie NF kappa B par les anticorps LPS contre P 65 et P 65 lié au phospho a été utilisé dans l’analyse par transfert Western, comme le montre ici.

Une bande plus forte contre le P 65 phosphorylé est observée avec le traitement LPS pris. Ensemble, ces données indiquent des macrophages dérivés de la moelle osseuse avec des réponses d’activation polarisées à des stimuli M1 ou M deux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des macrophages dérivés de la moelle osseuse, suivis d’une analyse d’activation polarisée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’évaluer la pureté des macrophages différenciés avant de tester leur réponse. À la suite de cette procédure, une méthode telle que la transfection transitoire des gènes ou SHRA peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que, comment les gènes sont-ils impliqués dans la régulation de l’activation des macrophages ?