Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

L’objectif global de cette procédure est de générer des macrophages humains en grande quantité et de haute qualité avec un équipement de laboratoire standard. Ceci est réalisé en centrifugeant d’abord le sang des couches leucocytaires sur un gradient d’appel FI pour collecter les BMCs P cs. Ensuite, sur un gradient par appel, les monocytes sont séparés des lymphocytes.

Ensuite, les monocytes sont ensemencés dans des sacs de culture cellulaire enrobés de téflon et différenciés. Après six ou sept jours, les macrophages sont récoltés et ensemencés pour des études ultérieures. Les cellules obtenues doivent exprimer les marqueurs typiques des macrophages matures et répondre à divers stimuli tels que la co-culture avec des cellules tumorales ou la stimulation avec LPS, Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le contre-courant, la centrifugation ou le tri cellulaire activé magnétique, est que les macrophages humains peuvent être générés avec un équipement labial standard sans avoir besoin de réactifs ou d’instruments coûteux.

Bien que cette méthode soit facile à mettre en œuvre, les personnes qui ne l’utilisent pas peuvent avoir du mal à visualiser et à séparer les différentes populations cellulaires dans les gradients de densité. Par conséquent, la démonstration visuelle de ces étapes aidera à surmonter ces difficultés. Ce protocole est effectué en double pour faciliter l’équilibrage des rotors.

Commencez par désinfecter deux sacs de la fraction de la couche de leucoplasme à partir de la couche de sang. Transférez ensuite les couches leucocytaires dans deux tubes de 50 millilitres pour chaque couche leucocytaire. Préparez trois tubes de 50 millilitres avec 15 millilitres de solution d’appel FI à température ambiante à 1,077 gramme par millilitre.

Maintenant, lentement et soigneusement, superposez 30 à 35 millilitres de manteau gonflé sur chaque tube d’appel FI. Les couches ne doivent pas se mélanger, centrifuger ces tubes sans casser à 400 G pendant une demi-heure. À température ambiante entre les deux phases, un anneau blanc de cellules mononucléées du sang périphérique se forme.

Retirez ces couches à l’aide d’une pipette en plastique. Combinez les couches des trois tubes de chaque donneur en deux tubes de 50 millilitres par donneur. Lavez les cellules collectées en ajoutant un millimolaire P-B-S-E-D-T-A jusqu’à la ligne de 40 millilitres, puis centrifugez-les à 300 G pendant 10 minutes sans les casser à température ambiante.

Maintenant, aspirez et jetez les surnageants. Puis répétez le lavage et P-B-S-C-D-T-A remettez en suspension et accumulez les granulés de chaque donneur et 20 millilitres de RPMI plus FCS sans rouge de phénol. Il devrait maintenant y avoir un tube de cellules par donneur.

Préparez maintenant le deuxième mélange de gradient de densité : 23,13 millilitres de solution à température ambiante par appel avec 1,87 millilitres de 10 XPBS dans un tube de 50 millilitres. Préparez un tube du mélange pour deux échantillons. Ensuite, transférez 23 millilitres du mélange dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Ajoutez ensuite 27 millilitres de RPMI plus FCS avec du rouge de phénol. Le résultat est une solution osmotique par appel à 46 % d’ISO. Maintenant, pour chaque transfert de donneur, 25 millilitres de la solution à 46 % dans un tube de 50 millilitres et superposez soigneusement le mélange de cellules.

Les deux phases doivent se distinguer par leurs couleurs sans interruption. Centrifugez les cellules pendant une demi-heure à température ambiante et à 550 G.Un anneau blanc de monocytes s’accumulera entre les deux faces. Collectez ces cellules dans un tube de 50 millilitres à l’aide d’une pipette en plastique.

Lavez les monocytes avec un millimolaire P-B-S-E-D-T-A, rempli à 50 millilitres. Ensuite, centrifugez-les à 400 G sans casser pendant 10 minutes à température ambiante, jetez le surnageant et remettez en suspension les monocytes granulés dans 20 millilitres de milieu. Passez ensuite à la section suivante.

Ce protocole utilise des sacs de culture recouverts de téflon FEP comme chambre de culture. Commencez par estimer le nombre de monocytes collectés. Les monocytes sont grands et souvent de forme irrégulière.

Ne comptez pas les lymphocytes plus petits. Si 100 à 150 millions de cellules d’un donneur sont disponibles, préparez 180 millilitres de RPMI supplémenté. S’il y a moins de cellules, préparez des volumes de 30 millilitres de milieu pour 30 à 50 millions de cellules.

Dans une aliquote de 20 millilitres, mélangez soigneusement les cellules dans les 180 millilitres de milieu préparé. Chargez ensuite le sac de culture avec les cellules à l’aide d’une seringue de parfum de 50 millilitres fixée au bouchon du sac de culture. Retirez la seringue, expulsez l’air restant et bouchez le bouchon avec un cône.

Maintenant, incubez les sacs pendant six à sept jours avec 5 % de dioxyde de carbone. Après six à sept jours d’incubation, transférez les sacs de culture dans de la glace pour récolter les cellules, immergez-les complètement dans la glace et laissez-les refroidir pendant une heure à trois heures pour détacher les cellules. Ensuite, tirez doucement les sacs sur un bord environ 10 fois.

Ensuite, désinfectez soigneusement l’extérieur des sacs. Remplacez le cône de la prise par une seringue de 50 millilitres. Ensuite, retirez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 50 millilitres.

Lorsque tous les tubes sont collectés, faites-les tourner à 400 G pendant 10 minutes À température ambiante, aspirez maintenant le surnageant et regroupez toutes les cellules dans 10 millilitres de RPMI plus FCS. Comptez ensuite les cellules comme précédemment. Ne comptez les macrophages que si des lymphocytes résiduels peuvent être présents.

Utilisez ensuite les cellules pour l’application d’intérêt pour réutiliser les sacs de culture. Lavez-les deux fois avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, remplissez-les de 50 millilitres d’éthanol à 70 % et incubez-les toute la nuit à température ambiante le lendemain, rincez les sacs trois fois avec du PBS stérile.

Ensuite, enveloppez-les dans du papier de stérilisation et autoclavez-les. Un sac peut facilement être réutilisé 10 fois le gradient de densité. Les centrifugations produisent une interface blanche contenant des lymphocytes et des monocytes.

Nous examinons ici le premier gradient de densité. May Grunwald. La coloration de ces cellules montre à la fois un rapport cytoplasmique du noyau élevé, typique des lymphocytes, et des noyaux en forme de haricot ou d’anneau, typique des monocytes.

Ces taches montrent les résultats du deuxième gradient. Chaque couche leucocytaire produit environ 150 millions de monocytes, qui peuvent être différenciés en environ 70 millions de macrophages. Dans 20 préparations, 47 % des monocytes sont devenus des macrophages.

Les macrophages purifiés peuvent être encore enrichis par l’adhérence aux surfaces plastiques, une caractéristique qui n’est pas partagée par les cellules contaminantes. Une fois plaqués, la plupart des macrophages présentent une morphologie d’œuf au plat tandis que d’autres ont un phénotype de fuseau étiré. Les cellules sont caractérisées par l’expression de plusieurs marqueurs.

Typique des macrophages matures. L’expression de CD 11 B plaide contre une différenciation dendritique, tout comme l’absence d’expression de CD 2 0 9. Après la différenciation, les cellules restent fonctionnellement et métaboliquement actives pendant cinq à sept jours.

La coloration calcique des cellules viables montre leur capacité à absorber les vésicules extracellulaires marquées en rouge éliminées des cellules tumorales. De plus, les macrophages peuvent être activés, par exemple, la stimulation avec des lipopolysaccharides entraîne l’expression de plusieurs gènes pro-inflammatoires. À la suite de cette procédure, les macrophages isolés peuvent être soumis à un large éventail de tests fonctionnels afin de répondre à des questions fondamentales sur la biologie des macrophages dans la santé et la maladie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un grand nombre de macrophages humains. Cependant, il est important de se rappeler que vous travaillez avec des échantillons de sang humain, qui peuvent être potentiellement infectieux.