A Novel haute résolution In vivo Technique d'imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des images unicellulaires à haute résolution de cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse suivant leurs schémas de recrutement dans le cerveau normal et le système vasculaire associé aux tumeurs cérébrales avec le temps. Pour ce faire, on retire le tibia et le fémur de souris donneuses afin d’obtenir des cellules progénitrices fluorescentes de la moelle osseuse, puis on injecte ces cellules dans des souris receveuses irradiées. La deuxième étape consiste à générer des xénogreffes intracrâniennes GB M chez les souris chimériques à l’intérieur d’une chambre de fenêtre crânienne.

Ensuite, les souris subissent une variété de régimes de traitement, y compris un rayonnement stéréotaxique. La dernière étape consiste à imager les souris sur un microscope confocal à deux photons. En fin de compte, cette méthodologie peut être utilisée pour étudier dynamiquement les mécanismes de vascularisation intracrânienne dans une variété de modèles.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’histopathologie des tissus ex vivo, est que nous pouvons étudier des informations dynamiques critiques liées à la formation des vaisseaux dans le cerveau. En tant que tel, nous pouvons répondre à des questions clés entourant les mécanismes de la néovascularisation intercrânienne. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour fournir des informations sur la néovascularisation intracrânienne, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes et processus pathologiques dans le cerveau, tels que l’ischémie intracrânienne ou l’accident vasculaire cérébral, les maladies neurodégénératives et les mécanismes des métastases des cellules tumorales au cerveau.

Pour les besoins de cette vidéo, nous n’avons pas été en mesure de suivre une technique d’asepsie stricte. En tant que tel, le capot de biosécurité est une ouverture de plus de 12 pouces et les animaux ne sont pas drapés, ce qui permet au spectateur d’avoir une image plus claire et un meilleur accès pour orienter les procédures pour le travail expérimental. La technique aseptique doit être strictement suivie.

Commencez cette procédure en confirmant l’expression de la fluorescence de la souris donneuse de GFP et euthanasiez-la conformément aux directives du comité de protection des animaux de l’établissement. Ensuite, nettoyez les deux membres postérieurs et retirez le tibia et le fémur lorsque vous travaillez dans des conditions aseptiques. Retirez tout l’excès de tissu des os.

Retirez ensuite les plaques d’extrémité des deux extrémités des quatre os extraits. Rincez-les avec une aiguille de calibre 22 et un millilitre de PBS stérile. Ils deviendront clairs une fois que toute la moelle osseuse aura été évacuée.

Ensuite, mélangez la suspension de moelle osseuse extraite. Eh bien, il devrait contenir environ 20 millions de cellules, ce qui est suffisant pour trois reconstitutions de souris hôtes. Ensuite, préparez 3 aiguilles à tuberculine de calibre 27 et aspirez 300 microlitres de suspension de moelle osseuse dans chacune d’elles.

Tandis que la souris est positionnée dans la retenue. Marquez la surface dorsale de la queue pour vous orienter. Injectez ensuite la suspension dans la veine latérale de la queue de trois préalablement irradiés.

Des souris à glissement hochant la tête dans cette procédure travaillant dans des conditions aseptiques. Anesthésie les souris chimériques de la moelle osseuse et administre une analgésie préventive approuvée par l’iaucic. Appliquez du gel lacrymal pour prévenir la déshydratation de la cornée.

Nettoyez d’abord la tête avec une solution de bétadine, puis avec de l’alcool et retirez l’excès de cheveux. Nettoyez ensuite le cuir chevelu sous-jacent avec de l’alcool. Faites une incision du milieu des oreilles jusqu’à juste au-dessus des yeux.

Retirez le cuir chevelu de chaque côté de la première incision pour exposer environ cinq millimètres du crâne sous-jacent. Identifiez ensuite les repères anatomiques de la surface du crâne. Ensuite, identifiez et soulevez le périoste en injectant 2 % de lidocaïne avec une solution d’épinéphrine.

Ensuite, disséquez le périoste loin de la surface du crâne avec un instrument tranchant. Ensuite, utilisez une perceuse de raffinement TR de 2,7 millimètres pour affaiblir un lambeau osseux circulaire de 2,7 millimètres sur l’hémisphère droit du crâne, à égale distance de Lambda et de bgma. Ne pénétrez pas l’os avec la perceuse afin de protéger la dure-mère et les tissus sous-jacents.

Maintenant, retirez le lambeau osseux affaibli à l’aide de la dissection, de la pince à épiler et du crochet dentaire avec une force délibérée mais contrôlée. Ensuite, chargez une seringue Hamilton de calibre 30 avec 10 microlitres de suspension cellulaire et placez l’aiguille sur le cadre stéréotaxique. Placez ensuite la souris sur le cadre stéréotaxique.

Alignez l’aiguille sur le point central de la fenêtre générée par la suite, abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche la surface corticale. Réinitialisez ensuite les coordonnées numériques. Abaissez maintenant l’aiguille de 3,2 millimètres dans le tissu cortical.

Ensuite, rétractez 0,2 millimètre et injectez à trois millimètres. L’injection en profondeur doit être effectuée à un débit de 10 microlitres par minute. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille en place pendant une minute avant de la rétracter lentement.

Retirez ensuite la souris du cadre. Par la suite, gardez la surface du cerveau hydratée. À l’aide de gouttes de PBS stérile.

Placez une lamelle de trois millimètres sur la surface du cerveau pour sceller la fenêtre de 2,7 millimètres. Séchez ensuite l’os du crâne environnant. Ensuite, appliquez un lien vétérinaire pour coller le tissu du cuir chevelu à l’os du crâne et maintenez la lamelle en place.

N’en appliquez pas trop car il fuira sous le verre et diminuera le potentiel d’imagerie. Ensuite, mélangez la poudre acrylique dentaire fraîche et la solution dans la cagoule et appliquez le mélange sur le lien vétérinaire à l’aide d’une aiguille de calibre 22. Pour assurer une étanchéité étanche, appliquez l’acrylique de manière à ce qu’il chevauche légèrement le bord de la lamelle de verre, mais pas pour couvrir la lamelle de verre.

Dans cette étape, placez une souris anesthésiée dans un dispositif de contention de tête personnalisé à l’intérieur de l’irradiateur stéréotaxique XAD 2 25 conçu par la maison. Obtenez une tomodensitométrie à faisceau conique à 360 degrés avec le tube à rayons X fonctionnant à une tension de crête de 40 kilowatts et à 0,05 milliampères à travers un filtre en aluminium de deux millimètres. Utilisez l’image pour positionner la platine de telle sorte que le centre ISO du rayonnement soit dirigé vers l’hémisphère droit et soit central dans la direction ventrale dorsale.

Il existe une grande variété de collimateurs disponibles pour cibler le rayonnement, ce qui démontre l’adaptabilité du modèle. Dans ce cas, nous utilisons huit millimètres sur 11 millimètres pour l’irradiation hémisphérique. Insérez le collimateur hémisphérique dans l’irradiateur stéréotaxique X RAD 2 25.

Obtenez les images orthogonales uniques de la tomodensitométrie du haut et du bas à travers le collimateur pour assurer un positionnement correct de la tête en localisant les structures osseuses anatomiques et en ajustant manuellement la position de la platine sur le moniteur. Remplacez le filtre en aluminium XAD 2 25 IRRADIATOR par un filtre de traitement au cuivre de 0,93 millimètre. Ensuite, exécutez le programme de tube à rayons X à une tension illa de crête de 225 et 13 milliampères et administrez la moitié de la dose de rayonnement par le haut dans une direction AP.

Remettez le portique en position basse et administrez la seconde moitié de la dose de rayonnement par le bas dans une direction PA. Dans cette procédure, anesthésez la souris de fenêtre intracrânienne précédemment générée et nettoyez la fenêtre à l’aide d’un spray alcoolisé. Configurez les canaux sur le microscope confocal tels que déterminés par les fluorochromes intégrés dans la souris chimérique générée.

Vous pouvez également réutiliser les paramètres précédents pour réduire la variabilité entre les sessions d’imagerie. Injectez toutes les étiquettes nécessaires à l’imagerie dans la veine latérale de la queue dans ce cas, du dextran pour la vascularisation. Retournez la souris sur la souris sur la tête de retenue sur mesure, en la soutenant avec de la pâte à modeler moulable, en veillant à ce que la tête soit perpendiculaire au laser et chargez à plat la souris sur la platine de microscope mobile.

Allumez le laser à premier canal et positionnez-le au centre de la fenêtre intracrânienne en regardant directement le point d’intersection du faisceau laser sur la fenêtre de la chambre. Prenez une image de chaque canal pour toute la fenêtre avec un objectif cinq x et utilisez-la comme carte pour d’autres images de résolution plus élevée avec des objectifs longue portée 10 x et 20 x. Ce schéma met en évidence les erreurs techniques associées au processus chirurgical et démontre l’effet que chacune aura sur les images produites.

L’air emprisonné sous la fenêtre sera visible sous forme de bulles sur les images. L’accumulation d’acrylique sur le verre est autofluorescente dans le canal rouge lointain et bloquera une partie du champ de vision. De même, la saleté sur la fenêtre pendant l’imagerie apparaît sous forme de flexion autofluorescente dans les images.

Même la fenêtre intracrânienne parfaite peut rencontrer des problèmes une fois qu’elle est sous le microscope. Les artefacts de respiration donnent des images alignées tandis qu’un mauvais positionnement de la souris sur le cadre entraîne une image segmentée. Comme le laser ne traverse qu’une partie du tissu avec le traitement post-image, il est possible d’ajouter un canal supplémentaire pour les cellules marquées CFP où les images GFP peuvent être soustraites des images CFP pour révéler le véritable signal CFP.

De plus, en utilisant l’autofluorescence de génération de seconde harmonique caractéristique des quatre fibres de collagène, nous sommes en mesure d’imager la membrane basale du système vasculaire. La disponibilité de cinq canaux fluorescents permet à l’utilisateur une grande flexibilité et adaptabilité du nouveau modèle de miroir décrit dans cet article. Lors de cette procédure, il est important de garder à l’esprit les produits dangereux utilisés lors des interventions chirurgicales.

Il est également essentiel d’être méticuleux et d’accorder une attention particulière aux détails pour s’assurer que le tissu cérébral reste intact tout au long de l’imagerie à long terme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une souris chimérique avec des cellules progénitrices fluorescentes, et à votre tour être capable de capturer des images haute résolution en temps réel du système vasculaire intracrânien après l’implantation de cellules tumorales avec ou sans intervention thérapeutique.