A Novel haute résolution

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des images haute résolution de cellules uniques issues de cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse, en suivant leurs schémas de recrutement vers la vascularisation cérébrale normale et celle associée aux tumeurs cérébrales au fil du temps. Cela est réalisé en prélevant le tibia et le fémur de souris donneuses afin d'obtenir des cellules progénitrices de la moelle osseuse fluorescentes, puis en injectant ces cellules dans des souris receveuses irradiées. La deuxième étape consiste à générer des xénogreffes intracrâniennes de GBM chez les souris chimériques à l'intérieur d'une chambre à fenêtre crânienne.

Ensuite, les souris subissent divers régimes de traitement, notamment une irradiation guidée par stéréotaxie. La dernière étape consiste à imager les souris au microscope confocal à deux photons. En définitive, cette méthodologie peut être utilisée pour étudier dynamiquement les mécanismes de vascularisation intracrânienne dans divers modèles.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'histopathologie de tissus ex vivo, est que nous pouvons étudier des informations dynamiques essentielles relatives à la formation des vaisseaux dans le cerveau. Ainsi, nous pouvons répondre à des questions fondamentales concernant les mécanismes de la néovascularisation intracrânienne. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour obtenir des informations sur la néovascularisation intracrânienne, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes et processus pathologiques dans le cerveau, tels que l'ischémie intracrânienne ou l'accident vasculaire cérébral, les maladies neurodégénératives et les mécanismes de métastases des cellules tumorales vers le cerveau.

Pour la réalisation de cette vidéo, nous n'avons pas pu respecter scrupuleusement la technique aseptique. Ainsi, la hotte de biosécurité possède une ouverture supérieure à 12 pouces et les animaux ne sont pas recouverts d'un champ opératoire, ce qui permet au spectateur d'obtenir une image plus claire et un meilleur accès pour comprendre les procédures expérimentales. La technique aseptique doit être strictement respectée.

Commencez cette procédure en vérifiant l'expression de la fluorescence chez la souris donneur GFP, puis euthanasiez-la conformément aux directives du comité institutionnel de soins aux animaux. Ensuite, nettoyez les deux membres postérieurs et retirez le tibia et le fémur en travaillant dans des conditions aseptiques. Retirez tous les tissus excédentaires des os.

Ensuite, retirez les plaques terminales des deux extrémités des quatre os extraits. Rincez-les à l’aide d’une aiguille de calibre 22 et d’un millilitre de PBS stérile. Ils deviendront transparents une fois que toute la moelle osseuse aura été éliminée.

Ensuite, mélangez la suspension de moelle osseuse extraite. Elle doit contenir environ 20 millions de cellules, ce qui est suffisant pour la reconstitution de trois souris hôtes. Préparez ensuite 3 aiguilles tuberculiniques de calibre 27 et aspirez 300 microlitres de la suspension de moelle osseuse dans chacune d’elles.

Tandis que la souris est positionnée dans le dispositif de contention, marquez la surface dorsale de la queue pour vous orienter. Ensuite, injectez la suspension dans la veine latérale de la queue de trois souris préalablement irradiées.

Nod skid mice dans cette procédure en travaillant dans des conditions aseptiques. Anesthésiez les souris nod skid à moelle osseuse chimérique et administrez une analgésie préemptive approuvée par l'IACUC. Appliquez un gel lacrymal pour prévenir la déshydratation cornéenne.

Nettoyez d'abord la tête avec une solution de bétadine, puis avec de l'alcool, et retirez les poils excédents. Nettoyez ensuite davantage le cuir chevelu sous-jacent avec de l'alcool. Pratiquez une incision allant du point médian des oreilles jusqu'au-dessus des yeux.

Retirer le cuir chevelu de chaque côté de la première incision afin d'exposer environ cinq millimètres du crâne sous-jacent. Ensuite, identifier les repères anatomiques de la surface du crâne. Puis identifier et soulever le périoste en injectant une solution de lidocaïne à 2 % avec de l'épinéphrine.

Ensuite, disséquer le périoste à partir de la surface du crâne à l’aide d’un instrument pointu. Puis utiliser un foret TR de 2,7 millimètres pour fragiliser un lambeau osseux circulaire de 2,7 millimètres sur l’hémisphère droit du crâne, à égale distance de Lambda et de bgma. Ne pas percer l’os avec le foret afin de protéger la dure-mère et les tissus sous-jacents.

Maintenant, retirez le lambeau osseux affaibli à l’aide du dissecteur, de la pince et du crochet dentaire, en appliquant une force délibérée mais contrôlée. Ensuite, chargez une seringue Hamilton de calibre 30 avec 10 microlitres de suspension cellulaire et fixez l’aiguille sur le cadre stéréotaxique. Puis placez la souris sur le cadre stéréotaxique.

Alignez l'aiguille sur le point central de la fenêtre générée ensuite, puis abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche la surface corticale. Réinitialisez alors les coordonnées numériques. Abaissez maintenant l'aiguille de 3,2 millimètres dans le tissu cortical.

Ensuite, rétracter de 0,2 millimètre et injecter à trois millimètres. L'injection en profondeur doit être effectuée à un débit de 10 microlitres par minute. Une fois l'injection terminée, laisser l'aiguille en place pendant une minute avant de la retirer lentement.

Ensuite, retirez la souris du cadre. Par la suite, maintenez la surface du cerveau hydratée à l’aide de gouttes de PBS stérile.

Placer une lame de verre de trois millimètres sur la surface du cerveau afin de sceller la fenêtre de 2,7 millimètres. Ensuite, sécher l'os du crâne environnant. Puis, appliquer du vet bond pour coller le tissu du cuir chevelu à l'os du crâne et maintenir la lame de verre en place.

Ne pas en appliquer trop, car cela risquerait de s'infiltrer sous le verre et de réduire la qualité d'imagerie. Ensuite, mélanger la poudre et la solution acryliques dentaires fraîches sous la hotte et appliquer le mélange sur le vet bond à l'aide d'une aiguille de calibre 22. Pour garantir un scellement étanche, appliquer l'acrylique de manière à ce qu'il chevauche légèrement le bord du couvre-objet en verre, sans toutefois recouvrir entièrement ce dernier.

Dans cette étape, placer une souris anesthésiée dans un dispositif personnalisé de contention de la tête à l'intérieur de l'irradiateur stéréotaxique XAD 2 25 conçu pour cet usage. Réaliser un scanner CT en cône à 360 degrés avec le tube à rayons X fonctionnant à 40 kilovolts crête et 0,05 milliampères à travers un filtre en aluminium de deux millimètres. Utiliser l'image pour positionner la platine de manière à ce que le centre ISO du rayonnement soit dirigé vers l'hémisphère droit et soit centré dans la direction dorso-ventrale.

Il existe une grande variété de collimateurs permettant de cibler le rayonnement, ce qui démontre l'adaptabilité du modèle. Dans ce cas, nous utilisons un collimateur de huit millimètres sur 11 millimètres pour une irradiation hémisphérique. Insérez le collimateur hémisphérique dans l'irradiateur stéréotaxique X RAD 2 25.

Obtenez les images orthogonales uniques de CT provenant à la fois du haut et du bas à travers le collimateur afin de garantir un positionnement correct de la tête en localisant les structures osseuses anatomiques et en ajustant manuellement la position de la platine sur l'écran. Remplacez le filtre en aluminium XAD 2 25 IRRADIATOR par un filtre thérapeutique en cuivre de 0,93 millimètre. Exécutez ensuite le programme du tube à rayons X à une tension maximale de 225 kilovolts et à 13 milliampères, puis administrez la moitié de la dose de rayonnement depuis le haut, dans une direction AP.

Revenir à la position inférieure et administrer la seconde moitié de la dose de rayonnement par le bas, dans une direction PA. Dans cette procédure, anesthésier la souris munie d'une fenêtre intracrânienne préalablement générée et nettoyer la fenêtre à l'aide d'un spray d'alcool. Configurer les canaux sur le microscope confocal selon les fluorochromes intégrés dans la souris chimérique générée.

En alternative, réutilisez les paramètres précédents afin de réduire les variations entre les séances d'imagerie. Injectez par voie intraveineuse dans la queue les marqueurs nécessaires à l'imagerie, dans ce cas du dextran pour la vascularisation. Placez la souris sur le dos dans un support crânien sur mesure, en la soutenant avec de la pâte à modeler malléable, en veillant à ce que la tête soit perpendiculaire au laser et à plat, puis placez le support sur la platine mobile du microscope.

Activez le laser du premier canal et positionnez-le au centre de la fenêtre intracrânienne en observant directement le point d'intersection du faisceau laser sur la fenêtre de la chambre. Prenez une image de chaque canal pour l'ensemble de la fenêtre avec un objectif 5 x et utilisez-la comme carte pour d'autres images à plus haute résolution prises avec des objectifs longue portée 10 x et 20 x. Ce schéma met en évidence les erreurs techniques associées au processus chirurgical et illustre l'effet de chacune sur les images obtenues.

L'air piégé sous la fenêtre sera visible sous forme de bulles sur les images. L'accumulation d'acrylique sur le verre est autofluorescente dans le canal du rouge éloigné et masquera une partie du champ de vision. De même, la saleté présente sur la fenêtre pendant l'acquisition apparaît comme des taches autofluorescentes sur les images.

Même la fenêtre intracrânienne parfaite peut rencontrer des problèmes une fois placée sous le microscope. Les artefacts liés à la respiration produisent des images striées, tandis qu'un mauvais positionnement de la souris sur le support entraîne une image segmentée. Étant donné que le laser traverse uniquement une partie du tissu, une post-traitement de l'image permet d'ajouter un canal supplémentaire pour les cellules marquées avec CFP, en soustrayant les images GFP des images CFP afin de révéler le signal CFP réel.

En outre, en exploitant la caractéristique d'autofluorescence de génération du deuxième harmonique des fibres de collagène IV, nous sommes en mesure d'imaginer la membrane basale du réseau vasculaire. La disponibilité de cinq canaux fluorescents offre à l'utilisateur une grande souplesse et adaptabilité du modèle novateur de réflexion décrit dans cet article. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit les produits dangereux utilisés pendant les interventions chirurgicales.

Il est également essentiel d'être méticuleux et de porter une attention particulière aux détails afin de garantir que le tissu cérébral reste intact tout au long de l'imagerie à long terme. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer une souris chimérique comportant des cellules progénitrices fluorescentes, et par conséquent être en mesure d'obtenir des images en temps réel à haute résolution de la vascularisation intracrânienne après l'implantation de cellules tumorales, avec ou sans intervention thérapeutique.