L'analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

L'objectif général de cette procédure est de purifier l'ARN à partir de prélèvements chirurgicaux rétiniens humains en vue d'une analyse du transcriptome dans le cas de détachement de la rétine. Pour ce faire, les réactifs et matériaux nécessaires à la collecte du prélèvement chirurgical sont préparés au laboratoire puis envoyés à l'hôpital. Pendant l'intervention chirurgicale, le prélèvement est recueilli et renvoyé au laboratoire.

L'ARN est ensuite purifié à l'aide d'une procédure standardisée de gradient de chlorure de césium, et la qualité de l'ARN purifié est évaluée. En fin de compte, l'analyse de l'expression des ARNm montre que l'inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs sont toutes deux impliquées dans le décollement de la rétine, comme en témoignent les modifications de l'expression de gènes clés. Dans ces processus identifiés par analyse transcriptomique, le principal avantage de la méthode par rapport aux méthodes existantes de purification d'ARN, telles que GTIN chlor provenant de l'extraction, également connue sous le nom d'ole, est que les ARN obtenus ne sont pas contaminés par de l'ADN.

L'application de cette technique s'étend aux thérapies du détachement rétinien, car elle fournit les moyens techniques pour développer de nouvelles thérapies adjuvantes. Pour chaque échantillon à recueillir, utilisez une pipette exempte d'ARN pour remplir un tube stérile en polyéthylène à fond rond de cinq millilitres avec 2,4 millilitre d'une solution de chlorure de guanidine exempte d'ARN à six molaire. Utilisez du gaz argon pour remplir la partie supérieure des tubes.

Ensuite, placez rapidement le bouchon en appuyant fermement pour vous assurer qu'il est bien scellé. Cela empêchera l'oxydation du chlorure de guinée pendant plusieurs années de stockage dans l'armoire chirurgicale. Puis, placez chacun des tubes de cinq millilitres dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres, à fond conique.

Après avoir ajouté le tissu et vissé le bouchon, placer les tubes de 50 millilitres dans un support en polystyrène. Ensuite, placer le support ainsi que les enveloppes préparées et les formulaires d'expédition complétés dans un carton à l'hôpital. Apporter le carton depuis le placard chirurgical jusqu'à la salle d'opération.

Pendant la chirurgie, placez l'échantillon rétinien dans un tube rempli de solution de quantité et de chlorure. Fermez hermétiquement le tube. Mélangez brièvement le tube.

Ensuite, placer le tube sur le berceau pour tubes sanguins pendant 10 minutes. Remplir le formulaire d'échantillon accompagnant avec les informations d'identification du patient, la date de l'intervention chirurgicale et toutes remarques supplémentaires. Puis inscrire le numéro d'identification sur le tube correspondant de 50 millilitres numéroté.

Ensuite, placer le tube de cinq millilitres contenant l'échantillon chirurgical dans le tube de 50 millilitres. Remplacer le papier absorbant et refermer le tube. Puis placer le tube de 50 millilitres et le formulaire de prise en charge de l'échantillon dans l'enveloppe rembourrée appropriée et la sceller.

Une fois l'échantillon reçu au laboratoire, homogénéisez le spécimen dans son tube de cinq millilitres à l'aide d'un homogénéisateur Polytron™ en réglant au maximum pendant une minute, tout en déplaçant le tube vers le haut et vers le bas. Une fois l'homogénéisation terminée, ajoutez 270 microlitres d'acétate de potassium deux molaire pour extraire les polysaccharides, puis placez le tube sur un agitateur en position horizontale. Agitez vigoureusement pendant 10 minutes, puis centrifugez pendant 10 minutes à 6 500 ×g à 20 degrés Celsius.

Après la centrifugation, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement la fraction soluble sans perturber le culot. Transférez le surnageant dans un tube stérile de 14 millilitres exempt d'ARNases. Ajoutez ensuite au surnageant 5,3 millilitres de 1 % de lauryl sarcosine dans 100 millimolaire de Tris et 3,2 grammes de chlorure de césium.

La sarcosine solubilisera la membrane et le chlorure de césium est utilisé pour générer un gradient. Mélanger le tube par vortexage pendant une minute. Ajouter 1,8 millilitre de chlorure de césium EDTA dans un tube à centrifuger stérile en polymère de 11 millilitres.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 10 millilitres, superposez la solution d’ARN sur la solution de chlorure de césium et d’EDTA en la laissant couler le long de la paroi interne du tube. Placez les tubes dans une centrifugeuse. Utilisez, si nécessaire, un second tube contenant les tampons sans rétine comme contrepoids, et centrifugez pendant 24 heures à 225 000 ×g et à 20 degrés Celsius.

Le lendemain. Après la centrifugation, une couche lipidique se sera formée en haut du tube. L'ADN se trouvera au milieu et l'ARN sera en culot au fond du tube.

Utilisez une pipette Pasteur stérile pour retirer soigneusement la couche lipidique supérieure à l’aide d’une deuxième pipette Pasteur stérile et la jeter. Retirez progressivement la solution jusqu’à ce que l’ADN visqueux soit aspiré. Jetez la solution et l’ADN.

Ensuite, à l’aide d’une troisième pipette Pasteur stérile, retirez et jetez la solution restante, en prenant soin de ne pas perturber le culot d’ARN. Puis, à l’aide d’un scalpel stérilisé à la flamme, coupez le tube comme indiqué ici et jetez la partie supérieure.

Placer la partie restante à l’envers sur une compresse stérile. Inverser le tube et utiliser une pipette pour le rincer délicatement avec 160 microlitres de chlorure de guinée. Laisser sécher le culot pendant 10 minutes.

Une fois que le culot est sec, le resuspendre dans 150 microlitres de tris, E-D-T-A-S-D-S. Ensuite, ajouter 150 microlitres de tris, EDTA et 30 microlitres d'acétate de sodium à 3 M, puis vortexer pour précipiter l'ARN. Ajouter 900 microlitres d'éthanol glacé à 100 %.

Vortexez le tube et placez-le sur de la glace fondante pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant 30 minutes à 18 000 G à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, un petit culot blanc peut être visible ou non.

Que le culot soit visible ou non, aspirez délicatement le surnageant et jetez-le. Ensuite, pour éliminer l'excès de sel, ajoutez 500 microlitres d'éthanol à 70 % à température ambiante et vortexez. Centrifugez le tube pendant 20 minutes à 18 000 ×g à quatre degrés Celsius. Après avoir répété le lavage avec l'éthanol à 70 % et la centrifugation, utilisez une pipette P200 pour éliminer tout éthanol résiduel.

Laisser sécher le culot à l'air pendant 10 minutes. Resuspendre le culot dans 50 microlitres d'eau déionisée en mélangeant vigoureusement au vortex pendant deux minutes. Puis placer l'échantillon dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pour resuspendre complètement l'ARN. Déterminer enfin la concentration en ARN par mesure de l'absorbance à 260 nanomètres et analyser l'ARN par électrophorèse sur gel selon le protocole. Dans le document accompagnant, pour examiner le transcriptome du détachement de la rétine, la procédure publiée dans la revue a été utilisée pour extraire et analyser l'ARN rétinien de 18 patients présentant un détachement de la rétine et de 18 témoins appariés par âge, préparés à partir de rétines post-mortem.

L'ARN a ensuite été purifié et analysé par électrophorèse sur gel et base rettino comme décrit dans ce rapport. Ci-dessous sont présentés des graphiques radars représentant l'expression du gène chimiotactique des monocytes MCP-1, CCL2. La partie droite de la figure, étiquetée RD, correspond à l'ARN provenant de patients présentant un détachement de la rétine, tandis que la partie gauche, étiquetée N, correspond à l'ARN des témoins, comme on peut le voir ici. Le détachement de la rétine entraîne une surexpression de CCL2, indiquée par les valeurs élevées de C dans la plupart des échantillons RD à droite par rapport à ceux des témoins à gauche.

Cet accroissement indique une inflammation chez les patients présentant un détachement de la rétine, comme on peut le voir ici. L'expression du gène transducine des photorécepteurs en bâtonnets GNAT1 était diminuée, contrairement à celle de CCL2 ; les valeurs sont faibles pour les échantillons de RD à droite, une diminution de l'expression de l'opsine des cônes sensibles aux courtes longueurs d'onde OPN1SW, et une diminution de l'expression du gène homeobox CRX a également été observée, suggérant une dégénérescence des photorécepteurs, tant des bâtonnets que des cônes, chez les patients présentant un détachement de la rétine. Cette méthode permet d'obtenir des informations sur les modifications de l'expression génique suite à un détachement de la rétine. Elle peut également être appliquée à d'autres pathologies rétiniennes dans des modèles animaux, telles que les dégénérescences rétiniennes héréditaires.

Les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés car elle exige des connaissances en acides nucléiques. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle en tant que remise en état, car la manipulation de l'ARN après la certification est délicate.