L'analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

L’objectif global de cette procédure est de purifier l’ARN d’échantillons chirurgicaux de la rétine humaine pour l’analyse du transcriptome dans le décollement de la rétine. Pour ce faire, à l’aide d’un journal, les réactifs et le matériel nécessaires au prélèvement de l’échantillon chirurgical sont préparés en laboratoire et envoyés à l’hôpital. Au cours de l’intervention chirurgicale, l’échantillon est prélevé et renvoyé au laboratoire.

L’ARN est ensuite purifié à l’aide d’une procédure normalisée de gradient de chlorure de césium et la qualité de l’ARN purifié est évaluée. Finalement. L’analyse de l’expression de l’ARNm montre que l’inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs sont impliquées dans le décollement de la rétine indiqué par des changements dans l’expression de gènes clés. Dans ces processus identifiés par l’analyse transcriptomique, le principal avantage de la purification par journal par rapport à la purification existante de l’orna telle que le chlore GTIN de l’extraction, également connu sous le nom d’ole, est le résultat de l’orna ne sont pas contaminés par l’ADN.

L’application de cette technique s’étend aux thérapies du décollement de la rétine car elle fournit des moyens techniques pour développer de nouvelles thérapies adjuvantes. Pour chaque échantillon à prélever, utilisez une pipette sans ARN pour remplir un tube à fond rond en polyéthylène stérile de cinq millilitres avec 2,4 millilitres d’une solution de chlorure de guine libre de six ARN molaires. Utilisez du gaz argon pour remplir la partie supérieure des tubes.

Ensuite, placez rapidement le capuchon en appuyant fermement pour vous assurer qu’il est scellé. Cela permettra d’éviter l’oxydation du chlorure de guine sur plusieurs années de stockage dans le cabinet chirurgical. Ensuite, placez chacun des tubes de cinq millilitres dans un tube à fond conique en polypropylène stérile de 50 millilitres.

Après avoir ajouté du mouchoir et vissé le bouchon, placez les tubes de 50 millilitres dans un support en polystyrène. Placez ensuite le support et les enveloppes préparées ainsi que les formulaires d’expédition préparés dans une boîte en carton à l’hôpital. Apportez la boîte en carton de l’armoire chirurgicale à la salle d’opération.

Pendant la chirurgie, placez l’échantillon rétinien dans un tube rempli de quantité et de solution de chlorure. Fermez bien le tube. Mélangez brièvement le tube.

Placez ensuite le tube sur la bascule du tube sanguin pendant 10 minutes. Remplissez le formulaire d’exemple ci-joint avec l’identification du patient, la date de l’intervention et toute remarque supplémentaire. Écrivez ensuite le numéro d’identification sur le tube numéroté de 50 millilitres correspondant.

Placez ensuite le tube de cinq millilitres avec l’échantillon chirurgical dans le tube de 50 millilitres. Remplacez le mouchoir en papier et bouchez le tube. Placez ensuite le tube de 50 millilitres et le formulaire de prélèvement d’échantillon dans l’enveloppe rembourrée appropriée et scellez-le.

Une fois l’échantillon reçu en laboratoire, homogénéisez l’échantillon dans son tube de cinq millilitres avec un homogénéisateur polytron TM au réglage maximum pendant une minute tout en déplaçant le tube de haut en bas. Une fois l’échantillon homogénéisé, pour extraire les polysaccharides, ajoutez 270 microlitres d’acétate de potassium à deux molaires et placez le tube sur un agitateur en position horizontale. Agiter vigoureusement pendant 10 minutes, puis centrifuger pendant 10 minutes à 6, 500 G à 20 degrés Celsius.

Après l’essorage, à l’aide d’une pipette, aspirer soigneusement la fraction soluble sans perturber la pastille. Transférez le surnageant dans un tube libre d’ARN stérile de 14 millilitres. À côté du surnageant, ajoutez 5,3 millilitres de 1 % et de Sarcosine de Laurier dans 100, du tri millimolaire et 3,2 grammes de chlorure de césium.

Le sarcosine va solubiliser la membrane et le chlorure de césium est utilisé pour générer un gradient. Mélangez le tube en tourbillonnant pendant une minute. Ajoutez 1,8 millilitre de chlorure de césium EDTA dans un tube à centrifuger stérile en polymère de 11 millilitres.

Ensuite, à l’aide d’une pipette pasteure stérile de 10 millilitres, superposez la solution d’ARN sur une solution de chlorure de césium EDTA en la laissant couler sur la surface intérieure du tube. Placez les tubes dans une centrifugeuse. Utilisez un deuxième tube contenant les tampons sans rétine comme balance si nécessaire, et tournez pendant 24 heures à 225 000 G à 20 degrés Celsius.

Le lendemain. Suite à l’essorage, une couche lipidique se sera formée au sommet du tube. L’ADN sera au milieu et l’ARN sera granulé au fond du tube.

À l’aide d’une pipette à pâte stérile, retirez et jetez soigneusement la couche lipidique supérieure à l’aide d’une deuxième pipette à pâte stérile. Retirez progressivement la solution jusqu’à ce que l’ADN visqueux soit aspiré. Jetez la solution et l’ADN.

Ensuite, à l’aide d’une troisième pipette pasteure stérile, retirez et jetez la solution restante. En prenant soin de ne pas perturber la pastille d’ARN. Maintenant, à l’aide d’un scalpel stérilisé à la flamme, coupez le tube comme indiqué ici et jetez la partie supérieure.

Placez la partie restante à l’envers sur de la gaze stérile. Retournez le tube et rincez-le délicatement à l’aide d’une pipette avec 160 microlitres de chlorure de guine. Laissez sécher le granulé pendant 10 minutes.

Une fois le granulé sec, remis en suspension dans 150 microlitres de tris, E-D-T-A-S-D-S. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tris, EDTA et 30 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires, puis faites un vortex pour précipiter l’ARN. Ajoutez 900 microlitres de glace froide, 100 % éthanol.

Vortex le tube et placez-le sur de la glace fondante pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez le tube 30 minutes à 18 000 G à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, une minuscule pastille blanche peut être visible ou non.

Que l’on puisse ou non voir la pastille, aspirez délicatement le surnageant et jetez-le. Ensuite, pour éliminer l’excès de sel, ajoutez 500 microlitres de température ambiante, 70 % d’éthanol et de vortex, le tube centrifuge, le tube pendant 20 minutes à 18 000 G à quatre degrés Celsius. Après avoir répété le lavage et l’essorage à 70 % d’éthanol, utilisez une pipette P 200 pour retirer tout éthanol restant.

Laissez sécher le granulé à l’air libre pendant 10 minutes. Remettez le granulé en suspension dans 50 microlitres d’eau traitée en mélangeant vigoureusement en tourbillonnant pendant deux minutes. Placez ensuite l’échantillon dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pour remettre complètement l’ARN en suspension. Enfin, déterminer la concentration d’ARN par absorbance à 260 nanomètres et analyser l’ARN par électrophorèse sur gel selon le protocole. Dans le document d’accompagnement, Pour examiner le transcriptome du décollement de la rétine, la procédure du journal a été utilisée pour récupérer et analyser l’ARN rétinien de 18 patients atteints de décollement de la rétine et de 18 témoins appariés selon l’âge préparés à l’aide de rétines post-mortem.

L’ARN a ensuite été purifié et analysé à l’aide de l’électrophorèse sur gel et de la base de retino, comme décrit dans ce rapport, montré ici des graphiques radar représentant l’expression du monocyte chimiotactique M, CP un, gène CCL deux. La partie droite de la figure étiquetée RD correspond à l’ARN des patients atteints de décollement de la rétine, tandis que la partie gauche étiquetée N est l’ARN des témoins comme on peut le voir ici. Le décollement de la rétine entraîne la régulation positive de la LCC deux, comme l’indiquent les valeurs C élevées dans la plupart des échantillons de DR à droite par rapport à ceux des témoins à gauche.

Cette augmentation indique une inflammation chez les patients atteints de décollement de la rétine, comme on peut le voir ici. L’expression du gène transducteur du photorécepteur des bâtonnets GNAT un a été diminuée contrairement à CCL deux, les valeurs sont faibles pour les échantillons RD à droite, une diminution de l’expression du cône à ondes courtes opsine O PN un SW, et le gène homéo CRX a également été observée, suggérant une dégénérescence des photorécepteurs des bâtonnets et des cônes chez les patients atteints de décollement de la rétine. Il peut également être appliqué à d’autres pathologies rétiniennes dans des modèles animaux tels que les dégénérescences rétiniennes héréditaires.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car elle nécessite une connaissance de l’acide nucléique. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle en tant que reconditionnement, dont l’ARN après la certification est délicat.