Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l'analyse histopathologique localisée

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer l’évaluation de la sécurité des prothèses rétiniennes. Pour ce faire, il suffit d’abord de marquer la surface d’un œil énucléé fixé de manière optimale avec des colorants tissulaires pour indiquer la position d’une électrode implantée. Dans la deuxième étape, le réseau d’électrodes est retiré et le tissu oculaire est disséqué en bandelettes.

Ensuite, les bandelettes sont stabilisées dans de la gélose, puis noyées dans de la paraffine. Dans la dernière étape, les zones d’intérêt marquées sont sectionnées et collectées sur des lames pour la coloration. En fin de compte, la santé des zones implantées adjacentes à chaque électrode peut être évaluée par microscopie à fond clair et par immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique est que les artefacts et le délaminage liés à la fixation peuvent être minimisés, tandis que les régions tissulaires adjacentes aux électrodes peuvent être suivies avec précision dans de grands échantillons. Il peut également être utilisé pour évaluer l’innocuité de nouveaux implants pour d’autres maladies oculaires. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode la trouveront difficile car la rétine est sujette à la délamination et un haut niveau de dextérité est nécessaire pour manipuler les échantillons.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante car le marquage et la manipulation des tissus fragiles sont difficiles à apprendre. Avant cette étude, après l’implantation d’un réseau d’électrodes suprachoroïdiennes, les yeux étaient préalablement traités à l’aide d’une technique non optimale indiquée par l’étoile. Cette première image montre une coupe orthogonale représentative à travers la cavité du réseau d’électrodes.

Notez que la rétine est détachée du tissu externe de l’œil. Cela est particulièrement évident sous la région implantée, comme l’indique la pointe de la flèche. Notez également qu’il n’est pas possible de déterminer quelle partie de la rétine était adjacente à chaque électrode individuelle du réseau.

Dans ce grossissement plus élevé, il y a plusieurs artefacts réguliers basés sur la libération dans les couches rétiniennes, comme l’indiquent les pointes de flèches, ainsi qu’un détachement majeur de la couche de torpille, la couche réfléchissante dans l’œil félin. En amplifiant davantage, on peut observer que les segments externes des photorécepteurs, ainsi que l’épithélium pigmenté, restent intacts, ce qui suggère que les détachements précédemment observés ou les effets secondaires artificiels du traitement résultent plutôt que d’un traumatisme ou d’une pathologie in vivo. Ainsi, la technique suivante a été mise en œuvre pour minimiser ces artefacts liés à la fixation et au délaminage.

Après avoir nucléé et fixé les yeux, commencez par retirer un globe oculaire implanté de l’éthanol et coupez soigneusement l’excès de tissu, y compris la conjonctive et la capsule du tendon. Coupez le nerf optique à une longueur de deux à trois millimètres. Le réseau d’électrodes est visible à travers la sclérotique semi-translucide.

Ensuite, utilisez un pinceau à pointe fine pour appliquer soigneusement des colorants histologiques sur le tissu afin d’étiqueter les électrodes avec un code couleur prédéfini. En prenant soin de ne pas tacher le colorant. Un marquage supplémentaire peut être effectué pour définir les points d’intérêt ou aider à aligner les sections.

Ici, les électrodes stimulées au maximum ont été marquées en vert. Les autres électrodes actives ont été marquées en rouge. Les électrodes de retour de plus grand diamètre ont été colorées en jaune, et tous les guides ou marquages anatomiques supplémentaires ont été étiquetés avec un colorant bleu.

Après cinq minutes de séchage à l’air, remettez le globe dans l’éthanol à 70 % pour déshydrater le colorant. Ensuite, après avoir coupé l’excès de tissu du globe oculaire de contrôle non planté comme nous venons de le démontrer, utilisez les huit sutures en nylon fixées pendant l’étape de nucléation et de fixation pour aligner les yeux de contrôle et implantés comme une paire en miroir. Placez ensuite un gabarit en silicone des mêmes dimensions que le réseau d’électrodes sur un emplacement en miroir sur la commande I correspondant à l’emplacement du réseau dans l’œil implanté.

Ensuite, étiquetez le globe de contrôle comme nous venons de le démontrer afin que chaque site d’électrode implanté ait une paire de contrôle à un endroit anatomiquement comparable. Ensuite, retirez le réseau d’implants de l’œil, puis retirez l’avant de l’œil, y compris la cornée, l’iris et le cristallin. Ensuite, retirez le liquide vitré de l’œilleton restant.

Maintenant, disséquez l’œil implanté en plusieurs bandes de deux millimètres d’épaisseur. Chacun contenant un sous-ensemble des régions marquées par la puce. L’orientation des bandelettes doit être choisie pour aider à l’évaluation de divers aspects de la réponse tissulaire à l’implant, documenter soigneusement la position des marques de matrice sur les échantillons pour référence future.

Ensuite, placez la bande avec le côté à couper en premier, vers le bas, dans une mare peu profonde de gélose liquéfiée. Une fois que la gélose a pris, coupez autour de l’échantillon et placez-le dans une cassette de tissu soutenue par des inserts en mousse. Après avoir disséqué et intégré l’œil de contrôle, placez les cassettes dans de la formine tamponnée neutre et traitez-les pendant la nuit via une technique standard de traitement automatisé de la paraffine de 12 heures.

Le lendemain, enfoncez le tissu traité dans de la paraffine avec le côté à couper en premier vers le bas. Maintenant, coupez les blocs de paraffine en sections de cinq microns. Montez ensuite les sections de chacune des régions teintées sur des diapositives.

Afin de localiser la région Dy, vérifiez régulièrement les lames au microscope. Les régions immédiatement adjacentes à chaque point teint de la sclérotique seront celles qui étaient à proximité la plus proche de l’électrode correspondante du réseau. Enfin, colorez les sections comme vous le souhaitez.

Plage dynamique élevée. Des macrophotographies d’un œil félin énucléé avec un réseau d’électrodes suprachoroïdiennes in situ sont montrées après la fixation avec le fixateur de Davidson et avant le retrait du réseau. La sclère translucide permet de visualiser les électrodes individuelles dans le réseau.

Comme indiqué par la pointe de la flèche, les électrodes sont marquées d’un schéma de couleurs de colorant prédéfini. Ces marques de colorant placées avec un espacement régulier par rapport aux repères anatomiques sont utilisées pour maintenir la cohérence entre les expériences. Après le retrait du réseau d’électrodes, l’œil est disséqué à la main en bandes d’échantillonnage.

Les pointes de flèches indiquent deux des sites adjacents de l’électrode sur la sclérotique. La ligne pointillée indique le plan de coupe dans cette section représentative obtenue en coupant l’échantillon de la figure précédente, la forme grossière de la bande d’échantillon a été préservée avec un minimum d’artefacts tissulaires différentiels. Les deux marques de teinture sont encore visibles sur la sclérotique, comme l’indiquent les pointes de flèches.

Bien que le colorant vert soit plus résistant que le rouge, l’emplacement du colorant indique la position d’une électrode. Par conséquent, le tissu rétinien adjacent peut être évalué pour les dommages, le cas échéant, causés par la stimulation électrique, comme on le voit à ce grossissement, les couches rétiniennes adjacentes au colorant vert vu dans l’image précédente n’ont pas été détachées factuellement et la morphologie rétinienne a été préservée ici. Cette première image montre une coloration spéciale représentative et une immunohistochimie de coupes de tissus rétiniens traitées selon le protocole actuel.

L’hématine a coloré les noyaux cellulaires en bleu tandis que l’eoin a coloré le cytoplasme cellulaire, le collagène et les tissus de soutien, diverses nuances de rose Dans cette image, le bleu rapide luxal a coloré le bleu de la myéline. La contre-coloration violette crestal a été utilisée pour identifier les cellules ganglionnaires en colorant les corps des missiles dans le bleu périque et en mettant en évidence les cellules satellites environnantes. Dans cette section traitée en bleu trione de maçon, la solution de fusion d’acide écarlate BRIC a coloré les fibres musculaires en rouge tandis que le bleu de lin a coloré le collagène.

Dans ce cas, la sclérotique bleue de cette section colorée par l’acide périodique, les composants glycoprotéiques de la membrane basale et les composants du tissu conjonctif apparaissent violets tandis que les noyaux cellulaires de contre-coloration de l’hémat toin apparaissent bleus. La section sous-sclérale montrée sur cette image a été traitée avec du bleu de Prusse perlé au site de l’hémorragie. La formation d’hémosidérine à partir de globules rouges dégradés et la libération de complexes de fer ont produit une couleur violette.

L’ajout de rouge neutre a coloré les lysosomes en rouge dans cette image, les synthés anti-glutamine ont été colorés. Cette enzyme dégradant les neurotransmetteurs trouvée dans les cellules de Mueller en vert s’étend dans les deux sens avec les corps cellulaires de Mueller dans la couche nucléaire interne et l’alimentation finale des cellules de Mueller formant la membrane limitante interne pour la coloration de la protéine du neurofilament. Cette protéine cytosquelettique à chaîne lourde a été étiquetée verte dans le soma cellulaire et traite les liaisons croisées de la protéine du neurofilament avec d’autres neurofilaments pour maintenir la structure des neurones.

Les cellules ganglionnaires et leurs axones peuvent être observés dans les couches de cellules ganglionnaires et de fibres nerveuses, tandis que les axones des cellules horizontales situées à la limite externe de la couche nucléaire interne de la rétine féline apparaissent en vert. Dans cette image finale, on voit cette protéine cytosquelettique en rouge, prolifère dans les cellules de Mueller et les astrocytes pendant la gliose et on peut voir tapisser la couche de fibres nerveuses avec des cellules de Mueller formant de fines extensions à travers les couches rétiniennes internes vers les couches rétiniennes externes. La contre-coloration avec un DPI en bleu permet de visualiser les couches rétiniennes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de visualiser un flux de travail d’échantillons en trois dimensions et de tenir régulièrement compte de l’orientation des échantillons tout au long de la procédure. Suite à cette procédure, toutes les méthodes histologiques peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la sécurité après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en développement de l’œil bionique pour évaluer les niveaux de stimulation sûrs à long terme pour les patients aveugles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la sécurité d’un implant oculaire bionique.