Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l'analyse histopathologique localisée

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer l'évaluation de la sécurité d'une prothèse rétinienne. Cela est réalisé en marquant d'abord la surface d'un œil énucléé correctement fixé à l'aide de colorants tissulaires afin d'indiquer la position d'une électrode implantée. Dans la deuxième étape, le réseau d'électrodes est retiré et le tissu oculaire est découpé en bandes.

Ensuite, les lamelles sont stabilisées dans de l'agar puis incluses dans de la paraffine. Dans la dernière étape, les zones d'intérêt marquées sont découpées en sections et récupérées sur des lames pour coloration. En fin de compte, l'état des zones implantées adjacentes à chaque électrode peut être évalué par microscopie en champ clair et par microscopie d'immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de minimiser les artefacts liés à la fixation ainsi que le délaminage, tout en assurant un suivi précis des régions tissulaires adjacentes à l'électrode dans de grands échantillons. Elle peut également être utilisée pour évaluer la sécurité de nouveaux implants destinés à d'autres maladies oculaires. En général, les personnes novices dans cette méthode la trouveront difficile, car une rétine est sujette au délaminage et un haut niveau de dextérité est requis pour manipuler les échantillons.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante car le marquage et la manipulation du tissu fragile sont difficiles à apprendre. Avant cette étude, après l'implantation d'un réseau d'électrodes suprachoroïdal, les yeux étaient précédemment traités selon une technique non optimale, indiquée par l'étoile. Cette première image montre une section orthogonale représentative à travers la cavité du réseau d'électrodes.

Remarquez que la rétine est détachée du tissu externe de l'œil. Ceci est particulièrement évident sous la région implantée, comme indiqué par la flèche. Remarquez également qu'il n'est pas possible de déterminer quelle portion de la rétine était adjacente à chaque électrode individuelle du réseau.

Dans cet agrandissement plus élevé, plusieurs artéfacts liés à la libération régulière sont présents dans les couches rétiniennes, comme indiqué par les flèches, ainsi qu'une importante détachement de la couche torpille, la couche réfléchissante de l'œil félin. En augmentant davantage l'agrandissement, on observe que les segments externes des photorécepteurs, ainsi que l'épithélium pigmenté, restent toutefois intacts, suggérant que les détachements précédemment observés ou les effets secondaires artéfactuels liés au traitement ne proviennent pas d'un traumatisme ou d'une pathologie in vivo. Ainsi, la technique suivante a été mise en œuvre afin de minimiser ces artéfacts liés à la fixation et la délaminage.

Après la nucléation et la fixation, commencez par retirer le globe oculaire implanté de l'éthanol et découpez soigneusement les tissus excédentaires, notamment la conjonctive et la capsule tendineuse. Taillez le nerf optique à une longueur de deux à trois millimètres. Le réseau d'électrodes est visible à travers la sclérotique semi-translucide.

Ensuite, utilisez un pinceau fin pour appliquer soigneusement des colorants histologiques sur le tissu afin de marquer les électrodes selon un code couleur prédéfini, en prenant soin de ne pas brouiller le colorant. Des marques supplémentaires de colorant peuvent être ajoutées pour définir des points d'intérêt ou faciliter l'alignement des sections.

Ici, les électrodes maximales stimulées ont été marquées en vert. Les autres électrodes actives ont été marquées en rouge. Les électrodes de retour de plus grand diamètre ont été colorées en jaune, et tous les repères supplémentaires ou marquages anatomiques ont été étiquetés avec un colorant bleu.

Après cinq minutes de séchage à l'air, replacer le globe dans l'éthanol à 70 % afin de déshydrater le colorant. Ensuite, après avoir retiré les tissus excédentaires du globe oculaire témoin non implanté comme vient de l'être démontré, utiliser les huit sutures en nylon fixées lors de l'étape de nucléation et de fixation pour aligner les yeux témoin et implanté en paire symétrique. Puis placer un modèle en silicone ayant les mêmes dimensions que le réseau d'électrodes à un emplacement symétrique sur le témoin I, correspondant à la position du réseau dans l'œil implanté.

Ensuite, étiquetez le globe témoin comme vient de l'être afin que chaque site d'électrode implanté ait une paire témoin dans un emplacement anatomiquement comparable. Ensuite, retirez le réseau d'implants de l'œil, puis retirez la partie antérieure de l'œil, y compris la cornée, l'iris et le cristallin. Ensuite, retirez le liquide vitré du culot oculaire restant.

Dissez maintenant l’œil implanté en plusieurs bandes de deux millimètres d'épaisseur, chacune contenant un sous-ensemble des régions marquées au colorant. L'orientation des bandes doit être choisie de manière à faciliter l'évaluation des différents aspects de la réponse tissulaire à l'implant. Documentez soigneusement la position des marques de colorant sur les échantillons pour référence ultérieure.

Ensuite, placez la bande avec le côté à couper en premier orienté vers le bas dans une fine couche d'agar liquéfié. Une fois que l'agar a pris, découpez autour de l'échantillon et placez-le dans une cassette à tissus soutenue par des inserts en mousse. Après avoir disséqué et inclus l'œil témoin, placez les cassettes dans du formol tamponné neutre et traitez-les toute la nuit selon une technique standard de traitement à la paraffine automatisée de 12 heures.

Le lendemain, inclure le tissu traité dans du paraffine en plaçant la face à couper en premier vers le bas. Découper ensuite les blocs de paraffine en sections de cinq micromètres d'épaisseur. Puis monter les sections provenant de chacune des régions colorées sur des lames.

Pour localiser la région DY, examinez régulièrement les lames au microscope. Les régions situées immédiatement à côté de chaque point coloré de la sclérotique seront celles qui étaient en plus grande proximité avec l'électrode correspondante de la matrice. Enfin, coloriez les sections selon les besoins.

Haut contraste dynamique. Des photographies macro d’un œil de félin énucléé avec un réseau d’électrodes suprachoroïdal en place sont présentées après fixation avec le fixateur de Davidson et avant le retrait du réseau. La sclérotique translucide permet de visualiser les électrodes individuelles du réseau.

Telles qu'indiquées par la flèche, les électrodes sont marquées selon un schéma prédéfini de couleurs de colorant. Ces marques de colorant, placées à intervalles réguliers par rapport à des repères anatomiques, permettent de garantir la cohérence entre les expériences. Après le retrait du réseau d'électrodes, l'œil est disséqué manuellement en bandes d'échantillons.

Les flèches indiquent deux des sites adjacents à l'électrode sur la sclérotique. La ligne pointillée indique le plan de sectionnement dans cette coupe représentative obtenue en découpant l'échantillon de la figure précédente ; la forme générale de la bande d'échantillon a été préservée avec un minimum d'artéfacts tissulaires différentiels. Les deux marquages au colorant sont encore visibles sur la sclérotique, comme indiqué par les flèches.

Bien que le colorant vert ait été plus résistant que le rouge, l'emplacement du colorant indique la position d'une électrode. Par conséquent, on peut évaluer, s'il y en a, les lésions du tissu rétinien adjacent causées par la stimulation électrique ; comme on le voit à cet agrandissement, les couches rétiniennes adjacentes au colorant vert visibles sur l'image précédente n'étaient pas effectivement détachées, et la morphologie rétinienne était préservée ici. Cette première image montre des colorations spéciales et une immunohistochimie représentatives de sections de tissu rétinien traitées selon le protocole actuel.

L'hématine colore les noyaux cellulaires en bleu, tandis que l'éosine colore le cytoplasme cellulaire, le collagène et les tissus de soutien en différentes nuances de rose. Dans cette image, le bleu luxal rapide colore la myéline en bleu. La contre-coloration au violet crête est utilisée pour identifier les cellules ganglionnaires en colorant les corps cellulaires situés dans le péri-cytoplasme en bleu et en mettant en évidence les cellules satellites environnantes. Dans cette coupe traitée au trichrome bleu de Masson, la solution de fusion acide BRIC Scarlet colore les fibres musculaires en rouge, tandis que le bleu lin colore le collagène.

Dans ce cas, la sclérotique apparaît bleue dans cette section colorée à l'aide de la réaction de la PAS (acide périodique de Schiff), qui met en évidence les composants glycoprotéiques de la membrane basale et les composants du tissu conjonctif en pourpre, tandis que les noyaux cellulaires, contre-colorés à l'hématéine, apparaissent en bleu. La section sous-sclérale illustrée sur cette image a été traitée au bleu de Prusse de Perls au niveau du site d'hémorragie. La formation d'hémosidérine à partir des globules rouges dégradés et la libération de complexes ferreux ont produit une coloration violette.

L'ajout de rouge neutre a coloré en rouge les lysosomes sur cette image, tandis que l'anticorps anti-glutamine synthétase a été marqué. Cette enzyme dégradant les neurotransmetteurs, présente dans les cellules de Müller, apparaît en vert et s'étend dans les deux directions, les corps cellulaires des cellules de Müller se situant dans la couche nucléaire interne, et leurs prolongements terminaux formant la membrane limitante interne. Cette protéine cytosquelettique de la chaîne lourde, marquée en vert, se localise dans le corps cellulaire et les prolongements ; la protéine neurofilament s'associe à d'autres neurofilaments afin de maintenir la structure des neurones.

Les cellules ganglionnaires et leurs axones peuvent être observés dans les couches des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses, tandis que les axones des cellules horizontales situés à la bordure externe de la couche nucléaire interne de la rétine féline apparaissent en vert. Dans cette image finale, la protéine acide fibrillaire gliale, une protéine cytosquelettique montrée en rouge, se multiplie dans les cellules de Mueller et les astrocytes au cours de la gliose et peut être observée bordant la couche des fibres nerveuses, les cellules de Mueller formant de fines prolongations traversant les couches rétiniennes internes vers les couches externes. Une contre-coloration avec un DPI en bleu permet la visualisation des couches rétiniennes.

Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se représenter un exemple de flux opératoire en trois dimensions et de prendre régulièrement en compte l'orientation des échantillons tout au long de la procédure. Après sa mise au point, toutes les méthodes histologiques peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la sécurité. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement de l'œil bionique pour évaluer à long terme les niveaux de stimulation sûrs chez les patients aveugles.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer la sécurité d'un implant oculaire bionique.