Une approche de dépistage des matériaux guidée pour le développement quantitatives des puces à protéines dérivées Sol-gel

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de nouveaux matériaux à base de gel d’âme pour la fabrication de microréseaux et de les utiliser pour des tests enzymatiques de nanovolume. Pour ce faire, il faut d’abord identifier les matériaux qui ont des temps d’utilisation suffisamment longs pour éviter la gélification dans la goupille d’impression de la puce pendant le processus d’impression. La deuxième étape consiste à évaluer les matériaux avec de longs temps d’impression pour leur capacité à imprimer sous forme de microréseaux, leur reproductibilité, leur résistance à la fissuration, leur qualité d’adhérence, leur séparation de phase indésirable et, finalement, leur activité élevée pour les enzymes piégées.

Ensuite, l’enzyme d’intérêt est imprimée sous forme de microréseau à l’aide des matériaux optimaux et sa capacité à sur-repérer la solution de test et à générer une réponse enzymatique mesurable est testée. La dernière étape consiste à évaluer la capacité des matériaux à fournir des dosages hautement reproductibles à l’aide de l’enzyme d’intérêt et à générer des données quantitatives. Le matériau final pour la fabrication du réseau est ensuite choisi.

En fin de compte, les microréseaux de protéines dérivés du gel d’âme sont utilisés pour identifier les petites molécules qui réduisent l’activité enzymatique. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes telles que le criblage sur plaque est qu’elle permet de cribler un grand nombre de matériaux de manière systématique et très rapidement en utilisant de faibles volumes de réactifs. En général, les personnes novices dans cette technique auront du mal car il est possible d’avoir des matériaux gélifiés dans les broches d’impression.

Si ceux-ci sont ensuite nettoyés correctement, il en résultera des endroits manqués qui peuvent être interprétés comme des matériaux non imprimables. Pour commencer, préparez les nombreuses solutions additives décrites dans le protocole de texte d’accompagnement. De nombreuses solutions peuvent être préfabriquées et stockées jusqu’à un mois ou plus dans les bonnes conditions, mais certaines doivent être fabriquées le jour de l’expérience.

Mélangez les scies à base de silicate de sodium immédiatement avant de les utiliser et assurez-vous de les garder sur de la glace. Le SOS doit être utilisé dans l’heure suivant l’ajout de l’eau, car des périodes d’attente plus longues entraînent des temps de DATION réduits et irréguliers. Ensuite, préparez diverses combinaisons de tampons, de polymères de salans et de voies d’organes comme indiqué dans le protocole de texte d’accompagnement afin d’identifier les combinaisons qui peuvent être utilisées comme matériel imprimable avec des temps de dilatation supérieurs à 2,5 heures.

Une fois qu’un certain nombre de combinaisons ont été identifiées, réglez l’humidité à l’intérieur de la chambre d’impression à 80 à 90 % Une humidité inférieure à 80 % peut entraîner une évaporation de l’échantillon et des incohérences d’impression en raison des petits volumes de dépôt avec l’imprimante. Maintenant prêt, organisez les motifs de matrice à imprimer à l’aide du programme Chip Writer Pro. Réglez la course dans la direction XY à 10 millimètres par seconde et la vitesse d’approche de l’échantillon dans la direction Z à deux millimètres par seconde avec le temps de chargement de l’échantillon de 2,5 secondes à l’aide des combinaisons de gel de scie identifiées précédemment.

Préparez 25 microlitres de matériaux de base en combinant des polymères correspondants, des organo-voies et des additifs à petites molécules identifiés par le processus de présélection. Utilisation de tas de 50 millimolaires avec un pH de 8,0 dans des puits individuels d’une plaque de microtitration de 384 puits. Ensuite, sonicez jusqu’à quatre broches de gaine fendues de 100 microns de diamètre dans de l’eau distillée doublement.

Après 15 minutes, essayez-les sous un jet d’azote. Ensuite, utilisez un cure-pipe pour éliminer l’humidité résiduelle de l’intérieur du porte-goupille et placez soigneusement la goupille dans la tête d’impression du robot d’impression de goupilles de contact. Le fait de ne pas éliminer l’humidité résiduelle peut empêcher la goupille de se déplacer librement avec le support, ce qui entraîne des points manqués.

Ajoutez ensuite 25 microlitres de l’AS respectif dans le puits juste avant l’impression. Mélanger la solution à l’aide d’un mouvement de pipetage de haut en bas Répété 50 fois lors du mélange à la pipette. Minimisez la quantité d’air incorporée dans la solution.

Les bulles d’air empêchent le chargement complet de l’échantillon à l’intérieur de la broche. Ensuite, chargez la goupille en l’abaissant dans l’échantillon. Une fois les broches chargées, commencez le processus d’impression et imprimez l’échantillon sur une surface de lame.

Interrompez le processus d’impression avant d’ajouter du sel à la plaque source suivante. Eh bien, avec le processus en pause, retirez la goupille d’impression à l’aide d’un aimant et placez un cure-pipe dans la tête d’impression pour éviter l’accumulation d’humidité dans la tête d’impression. Rincez ensuite la goupille d’impression avec de l’eau double distillée et faites-la soniser dans de l’eau propre et double distillée pendant 30 secondes.

Ensuite, séchez la goupille d’impression sous un jet d’azote, puis replacez-la dans la tête d’impression. Poursuivez le mélange, l’impression et le nettoyage de tous les échantillons restant à l’intérieur de la plaque source, jusqu’à 12 000 points de 100 microns de diamètre peuvent être déposés sur une seule lame. Une fois l’impression terminée, faites vieillir la matrice pendant au moins 30 minutes et jusqu’à 24 heures dans la chambre d’impression à 80 à 90 % d’humidité.

Préparez 50 microlitres de contrôle positif juste avant l’utilisation en combinant 25 microlitres d’un millimolaire, l’iodure d’acétylcholine, et 0,14 microlitre de cinq millimolaires de bodi pi, de cystéine FIL et de 25 millimolaires tris à pH 7,0 avec 4 % de glycérol dans le puits d’une plaque de microtitration de 384 puits, pipetez lentement la solution de haut en bas pour mélanger sans créer de bulles. Ensuite, préparez les contrôles négatifs juste avant l’utilisation en combinant 0,14 microlitres de cystéine boai PI FIL de cinq millimolaires à 49,86 microlitres de triss de 25 millimolaires à pH 7,0 avec 4 % de glycérol dans un autre puits d’une plaque de micro-titrage de 384 puits et mélangez-les doucement sur imprimez les contrôles sur les microréseaux vieillis en utilisant les mêmes processus décrits dans la section précédente. Cependant, au lieu des broches de 100 microns de diamètre, vous avez inséré des broches principales d’un diamètre de 235 microns.

Cela permet de s’assurer que les solutions recouvrent complètement les endroits précédemment déposés. Les spots font vieillir les matrices dans un taux d’humidité de 80 à 90 % pendant une heure à température ambiante en raison de l’auto-hydrolyse de l’acétylcholine. Des temps d’incubation plus longs peuvent entraîner des faux positifs en raison de l’activité enzymatique accrue.

Assurez-vous que l’imageur à réseau novo alpha innotech est allumé et équipé d’une excitation de plus ou moins 17 nanomètres et d’un filtre d’émission de 538 plus ou moins 21 nanomètres pour la mesure des microréseaux d’acétylcholine estérase. Placez ensuite la diapositive dans le support de diapositive avec les points vers le haut. Réglez le nombre de sections d’aperçu de sorte qu’au moins une de chaque côté de la lame de microscope soit prévisualisée avec une résolution minimale de quatre micromètres à l’aide de l’exposition automatique.

Une fois que les paramètres sont jugés acceptables, acquérez une image de diapositive et enregistrez-la en tant que fichier TIFF. Ensuite, ouvrez l’image de la diapositive acquise dans l’image J 64. Cliquez sur l’outil de sélection ovale et sélectionnez chaque endroit.

Sélectionnez une région légèrement plus grande que le point observé et assurez-vous d’utiliser une taille cohérente entre les points pour réduire la subjectivité de l’image J. Mesurez ensuite l’intensité du signal de chaque point à l’aide de l’option de mesure. Sous l’onglet Analyser. Faites la moyenne de l’intensité de 25 points de contrôle positif similaires et divisez par l’intensité moyenne de 25 points de contrôle négatif similaires pour obtenir des rapports de contrôle positif par rapport au contrôle négatif pour les compositions de matériaux individuelles.

Voici un exemple de la plage dynamique des microréseaux résultants préparés à l’aide de ces méthodes. Les contrôles élevés ont donné des régions vert vif, tandis que les contrôles faibles ont entraîné des taches beaucoup plus sombres. L’intensité mesurée par l’image J 64 montre que les témoins supérieurs étaient en moyenne d’environ 22 000 unités fluorescentes relatives, et que les témoins faibles étaient en moyenne proches de 8 000.

Les lignes pointillées représentent trois écarts-types par rapport à la moyenne. Voici des exemples de microréseaux pour un criblage de réseaux d’honneur d’analogues synthétiques d’alcaloïdes de sier améraux identifiés comme le composé un et le composé deux. Les deux axes représentent le pourcentage d’enzyme déterminé par le signal fluorescent.

En double, la proximité des points par rapport à la diagonale représente une reproductibilité élevée de l’essai. Les tracés IC 50 de deux inhibiteurs potentiels différents sont présentés ici. Le premier composé a donné un niveau IC 50 de 16 micromolaires, tandis que le CI 50 du composé deux était de 21 micromolaires Des taches représentatives sont affichées ci-dessus pour illustrer les différences de signal proportionnelles aux concentrations d’inhibiteurs.

Le réseau présenté ici a été imprimé avec quatre kinases différentes, la kinase de carte P 38, l’EGFR et le GSK, et a été surimprimé avec un tampon seul contenant A TP et un tampon contenant A TP et starro sporin, un inhibiteur de l’activité enzymatique. Les résultats montrent un effet significatif de l’inhibiteur de kinase starro sporin sur la base des intensités de fluorescence résultantes, comme décrit ici. La plus grande différence observée à la concentration de stor sporin utilisée ici provenait des taches P 38.

Ici, des taches représentatives d’une puce à ADN de P 30 à 8h00 BP sont montrées, qui ont été sur-tachetées avec des concentrations variables de stor sporin. Comme indiqué, l’IC 50 de cette molécule a été déterminé comme étant une micromolaire et est représenté sur le graphique de droite Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est effectuée correctement Suite à cette procédure.

D’autres méthodes, telles que les immunoessais ou les tests d’interaction protéique, peuvent également être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires liées au diagnostic ou à la découverte de petites molécules.