Name: Une approche de dépistage des matériaux guidée pour le développement quantitatives des puces à protéines dérivées Sol-gel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez une approche de dépistage guidée des matériaux sol-gel pour développer des microarrays de protéines dopées, utilisant l'impression par pinces pour le criblage de petites molécules avec l'acétylcholinestérase et les multikinases.

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Les auteurs remercient Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge et Laura Lautens de l&#39;aide dans le développement de puces à protéines. Les auteurs remercient également en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) pour le financement de ces travaux. Les auteurs remercient également la Fondation canadienne pour l&#39;innovation et le Fonds d&#39;innovation de l&#39;Ontario pour le soutien de ce travail. JDB titulaire de la Chaire de recherche du Canada en chimie bioanalytique et Biointerfaces.

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<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li>
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<li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST+slides%3A+a+novel+surface+for+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li>
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<li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+biologicals+within+silicate%2C+siloxane%2C+and+hybrid+sol-gel+polymers%3A+An+efficient+and+generic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sol-gel+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li>
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<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthodologie décrite ici a été choisi comme le plus approprié pour l&#39;identification imprimables matériaux issus sol-gel avec une imprimante de contact, produisant une fois et procédure rentable pour identifier rapidement les matériaux optimaux sans avoir à filtrer un grand nombre de matériaux. Sur un total de ~ 20.000 matériaux potentiels, il a été possible d&#39;identifier environ 200 documents qui ont été adaptés pour l&#39;impression sur la base du temps de gélification seul. Cela a considérablement réduit le nombre de matériaux nécessaires pour être prêt pour les essais d&#39;impression ultérieurs. Ces matériaux imprimables sont ensuite imprimées sur 4 surfaces de glissement pour un total de 768 combinaisons matériau-diaporamas. En moyenne, 50 points / répétitions d&#39;un matériau peuvent être imprimés en ~ 3 min, y compris le chargement des échantillons, le dépôt au comptant et le nettoyage des broches. Parmi eux, 155 matériaux, soit environ 20%, a permis pour l&#39;impression du nombre maximum de points par l&#39;absorption de la solution et produire tailles de spot reproductibles. Il convient de noter que le 4 slide surfaces testées, les documents imprimés mieux dans l&#39;ordre: amine&gt; époxy&gt; aldéhyde&gt; PMMA, PMMA diapositives n&#39;ont pas produit des tableaux utiles pour toutes les matières. Ceci a été probablement attribuable à la polarité du revêtement de surface. En comparant les surfaces de glissement précitées, l&#39;amine plus polaire et époxy sont mieux adaptés pour les sols aqueux par rapport aux glissières de PMMA. En outre, des surfaces testées, les lames recouvertes amine offrent une surface chargée positivement potentiel pour le dépôt sol anionique à caution. Nous pensons, la silice des nanoparticules à l&#39;interface entre le coulisseau et le sol d&#39;interagir long de la surface. Tant l&#39;époxy et les surfaces de glissement des aldéhydes n&#39;ont pas la même interaction charge initiale basée. Pour assurer un dépôt au comptant optimale, il est fortement recommandé d&#39;utiliser des diapositives pré-enduites d&#39;un fournisseur comme Arrayit. Revêtement interne produit des surfaces incohérentes qui mènent à la mauvaise place reproductibilité 13 et, dans certains cas, peut conduire à des problèmes de quantificationblèmes. 18 de la même importance, la température et l&#39;humidité affectent la &quot;imprimabilité&quot; des matériaux. Bien qu&#39;aucune des études détaillées sur les effets liés à la température ont été effectuées, l&#39;impression est toujours réalisée à température ambiante (23 ± 3 ° C). Humidité (supérieure à 80%) a également été contrôlé à l&#39;intérieur de la chambre d&#39;impression pour empêcher le dépôt de forme irrégulière en raison des faibles volumes de dépôt (0,7-2,3 nl) et de l&#39;évaporation. Lorsque l&#39;écran de matériau a été guidé vers l&#39;identification des matériaux issus sol-gel optimales spécifiquement pour l&#39;impression de l&#39;acétylcholinestérase et les kinases, une petite série de documents ont été identifiés qui ont travaillé pour les deux types de protéines. En effet, à la fois des matériaux qui ont été identifiés pour la kinase microarray fabrication étaient fondées sur SS + PVA + glycérol, et les deux matériaux ont également été identifiés au cours des 26 matériaux choisis pour microarrays mal. Ces matériaux «optimales» peuvent offrir un point de départ générique pour développer protedans dopées puces à base de sol-gel, et les petits écrans centrées autour de ces compositions peuvent identifier encore meilleurs matériaux pour la fabrication de biopuces. Un second point à noter est l&#39;importance de l&#39;enzyme utilisée. Dans le cas de l&#39;acétylcholinestérase (une enzyme plutôt robuste), 26 (soit environ 40%) des 66 matériaux d&#39;origine identifiés comme test compatible conservé l&#39;activité de l&#39;acétylcholinestérase piégé. Toutefois, pour les kinases plus délicates, seulement 2 des compositions dosage compatibles 69, soit environ 3% des matériaux, ont été en mesure de conserver l&#39;activité de tous les kinases. Alors que nombre suffisant de différentes enzymes n&#39;ont pas été étudiées de faire des déclarations concluantes, il semble que la fabrication de la matrice d&#39;optimisation des enzymes relativement instables peuvent mener à l&#39;identification de matériaux qui peuvent piéger un large éventail de protéines pour permettre mutliplexed microarray fabrication. Indépendamment de la protéine choisie, le principal facteur de coupure pour identifier les matériaux imprimables était la nécessité d&#39;une longuetemps de gélification matérielles (&gt; 2,5 h). Lors du développement de matériaux à base de sol-gel SS, il est très important de veiller à ce que, suite à un échange d&#39;ions et filtration, le sol est à un pH d&#39;environ 4. Sols avec un pH initial inférieur peuvent entraîner des matériaux ayant un pH inférieur à la neutralité, ce qui peut affecter l&#39;activité enzymatique. 19 ajustant la quantité de Dowex (résine échangeuse d&#39;ions) de SS peut modifier le pH final du sol. Quand un nouveau lot de la résine est préparé le rapport de la résine de SS doit être ajusté de façon à produire des sols à pH d&#39;environ 4 suivant la procédure de l&#39;article 2 du protocole. De même, la préparation de la DGS cristallin est souvent une source d&#39;erreur associée à l&#39;insuffisance de matériel lors de l&#39;utilisation des sols DGS base pour le piégeage de biomolécules. Bien que n&#39;étant pas signalés ici en détail, un grand soin doit être pris lors de la synthèse de DGS cristallins, en particulier la nécessité d&#39;éviter la présence d&#39;eau au cours de la synthèse, qui peut produire de la silice polyglyceratedtes plutôt que DGS monomères. En outre, en raison de la nature hygroscopique du DGS, l&#39;échantillon cristallin doit être stocké desséché et utilisé dans les 6 mois après la synthèse. DGS cristallines de plus de 6 mois peut ne pas dissoudre complètement (en raison partiellement condensé silicate polyglyceryl) même avec des ultrasons dans un milieu acide. DGS incomplète dissolution produit sols à forte teneur en silice inconnu et incontrôlable et par conséquent, moins de matières solides. Un point important à noter avec tirage par contact, c&#39;est la qualité des broches. Broches endommagées ou mal (figure 9) ne seront jamais produire des réseaux reproductibles indépendants du matériel en cours d&#39;impression. Il est recommandé de vérifier la qualité de l&#39;axe à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection pour assurer cassées ou obstrué ne sont pas utilisés. Une manipulation soigneuse assure une longue durée de vie pour les broches. La libre circulation de l&#39;axe est également important. Dans le cas où l&#39;humidité est piégée dans la tête d&#39;impression entre la tête et la broche, la brochene sera pas le siège correctement et donc ne fera pas un bon contact avec la surface, ce qui entraîne un manque de dépôt de matière. En conclusion, nous avons fourni une approche de dépistage détaillée, plusieurs étapes pour développer protéines dopés puces pin-imprimés à haute densité. Le dépistage implique l&#39;optimisation des propriétés des matériaux (temps de gélification et d&#39;imprimabilité) afin de permettre l&#39;impression de documents, suivi par un dépistage plus ciblé pour identifier les matériaux qui sont compatibles avec un dosage donné et en mesure de conserver l&#39;activité enzymatique. Cette approche de dépistage du matériau guidée peut être appliqué à des formats de puces à ADN supplémentaires pour réduire le temps et les coûts associés à la production efficaces puces à haute densité.

Microarrays ont gagné en popularité au sein de la communauté scientifique comme une méthode pour augmenter le débit de dosage. Depuis le développement de la technologie des microréseaux d&#39;évaluer l&#39;expression des gènes 1 au milieu des années 1990, les puces ont trouvé une utilisation dans le développement de tests à haut débit pour identifier les interactions des molécules protéine-protéine et protéine-petits, et de trouver de nouveaux matériaux aux propriétés uniques. 2-5 Plus récemment, les puces ont été développées dans lequel des matériaux spécifiques sont utilisés pour immobiliser des protéines fonctionnelles, fabrication d&#39;un élément de puces à ADN en trois dimensions à l&#39;intérieur de laquelle les protéines sont piégées, ce qui permet de mesure aisée de l&#39;activité enzymatique et à l&#39;inhibition de la puce elle-même en utilisant une fluorescence approprié analyse qui est couplé au chiffre d&#39;affaires du substrat. 5-10 Surtout, ces puces peuvent être conçus pour inclure tous les éléments nécessaires pour analyser des échantillons et des contrôles ainsi que d&#39;une manière très parallèle. 5,8 &lt;/ P&gt; Les premiers exemples de biopuces de protéines sont généralement préparés en utilisant des procédés standard pour l&#39;immobilisation des protéines sur des supports solides tels que la fixation covalente, 11 affinité capture 3 et l&#39;adsorption physique. 12 Bien que ces procédés de bio-immobilisation permettent une augmentation de la concentration de l&#39;échantillon et de la cinétique de réaction accélérée requis pour miniaturisation d&#39;essai, chacune d&#39;elles présentent des inconvénients. En général, toutes entraîner une diminution de la fonctionnalité native de biomolécules en raison de la modification chimique de la surface, entravé l&#39;accès à des sites actifs, ou l&#39;orientation inadéquate due à l&#39;immobilisation non spécifique. Ainsi, toutes les méthodes conduisent à la sensibilité du dosage inférieur en dépit d&#39;une augmentation des dépôts de biomolécules, une réponse qui se pose probablement en raison de la nécessité de lier artificiellement biomolécules sur une surface. Une nouvelle approche pour la production de puces à biomolécules fonctionnelles à travers pin-impression de protéines dopésols de silice sur des supports solides, qui sont généralement des lames de verre soit fonctionnalisés ou des puits individuels de microplaques. Le procédé sol-gel lui-même a lieu dans un milieu aqueux à la température ambiante, et il est le précurseur liquide qui est imprimée et ensuite les gels de biomolécules de piéger à l&#39;intérieur de la matrice 3D, permettant une haute teneur en protéines de chargement 13, ainsi que le piégeage de composants multiples à l&#39;intérieur de le même élément de microréseau. 13,14 couture du matériau dérivé sol-gel peut être fait par une sélection soigneuse de différents précurseurs de silice, ainsi que par modification de la composante aqueuse grâce à l&#39;utilisation de différents tampons (pH, force ionique), et l&#39;inclusion d&#39; divers additifs (polymères, de petites molécules) afin de réaliser un matériau optimal, la spécificité dépend de la biomolécule qui est piégé. 10 Une limitation potentielle associée à l&#39;élaboration des puces à protéines dérivées sol-gel par pin-impressionla nécessité d&#39;identifier les matériaux composites à base de sol-gel qui peuvent être imprimés sans gélifiant dans l&#39;axe ou présentant des propriétés indésirables (tailles reproductibles sur place, la fissuration, mauvaise adhérence, incompatibilité avec les composants d&#39;analyse, l&#39;activité de protéines pauvres), une fois imprimées sur une surface. 5 simultanée l&#39;optimisation de l&#39;ensemble de ces paramètres exclut une approche dans laquelle les matériaux peuvent être conçus de novo, ou examiné lentement d&#39;une manière sérielle. D&#39;autre part, le dépistage aléatoire de plusieurs milliers ou dizaines de milliers de documents n&#39;est ni le temps, ni rentable. Dans cet article, nous décrivons une approche de dépistage réalisé qui permet l&#39;identification rapide des matériaux appropriés pour la production de puces à protéines, sans la nécessité de dépister de façon aléatoire un grand nombre de matériaux. En utilisant une approche guidée, matériaux appropriés pour l&#39;impression microarray sont d&#39;abord identifiés, suivie par une série d&#39;écrans de petite échelle afin d&#39;identifier optimal sol-gel dérivé matériauxcombinaisons al qui peuvent être imprimées de manière reproductible, sans se fissurer et sont compatibles avec un dosage donné. Enfin, les matériaux optimaux sont identifiés en fonction de la rétention de l&#39;activité enzymatique et la performance dans une épreuve finale de dépistage à petite molécule. De cette façon, les matériaux optimaux peuvent être identifiés à partir de plusieurs milliers de candidats à l&#39;aide de seulement quelques centaines de marches d&#39;essai. Nous démontrons cette approche pour la fabrication de deux acétylcholinestérase haute densité et puces de kinases multiples et l&#39;utilisation de ces puces pour le dépistage à petite molécule.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td><fort>réactif/matériau</fort></td></tr><tr><td>poly(alcool vinylique) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>hydrolozyé à 80 %, Mw 600</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333&</td><td>nbsp ;</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>solution à 50 % en poids dans l’eau</td></tr><tr><td>Carboxyéthylsilanetriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>25 % dans l’eau</td></tr><tr><td>N-(3-triéthoxysilylpropyl) gluconamide (GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>50 % dans l’éthanol</td></tr><tr><td>bis[(3-méthyldiméthoxysilyl)propyl]oxyde de polypropylène (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Méthyltriméthoxysilane (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bis(triéthoxysiyly)éthane (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0&</td><td>nbsp ;</td></tr><tr><td>3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>D-(+)-tréhalose dihydraté</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>N&epsilon ; -Acétyl-L-lysine</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, 1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, 1,0 N/0,1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Diglycérolsilane (DGS)</td><td></td><td></td><td>Préparé en laboratoire</td></tr><tr><td>Solution de silicate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 ion exchance résine</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Iodure d’acétylthiocholine</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acétylcholinestérase de Electrophorus electricus (anguille électrique)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystine</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de teinture pour microréseau de phosphoprotéine/phosphopeptide Pro-Q</td><td>Diamond Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Adénosine 5'triphosphate disodique (ATP) solution</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>p38&alpha ;/SAPK2a (T106M), EMD actif</td><td>Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Donné par Millipore</td></tr><tr><td>Glycogen synthase kinase 3&beta ; (GSK-3&beta ;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Protéine basique de myéline (MBP)</td><td>Substrat EMD Millipore</td><td></td><td>pour MAPK2 et p38&alpha ;, Don de Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Substrat Millipore</td><td>12-533</td><td>pour GSK-3&beta ;</td></tr><tr><td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>Substrat pour</td></tr><tr><td>EGFR Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Goupille furtive</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames revêtues</td><td>d’amines ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames revêtues d’aldéhyde</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames à revêtement exposé</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames revêtues de poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA)</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,2-&mu ; Filtre à seringue</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Virtek Contact Printer</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Imageur de lames de fluorescence Novaray</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de bureau pour microréseaux</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Utilisé pour filtrer toute l’eau nécessaire aux expériences</td></tr></tbody></table>

une approche de dépistage des matériaux guidée pour le développement quantitatives des puces à protéines dérivées sol-gel

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays ont trouvé une utilisation dans le développement de tests à haut débit pour les nouveaux matériaux et la découverte de pistes de médicaments à petites molécules. Ici, nous décrivons une approche de dépistage du matériau guidée pour identifier les matériaux à base de sol-gel qui sont aptes à produire des puces à protéines en trois dimensions. L&#39;approche identifie d&#39;abord les matériaux qui peuvent être imprimés comme des puces, se réduit le nombre de matériaux en identifiant ceux qui sont compatibles avec un dosage de l&#39;enzyme donnée, puis en pierre sur les matériaux optimaux sur la base rétention de l&#39;activité enzymatique maximale. Cette approche est appliquée pour développer des puces pouvant accueillir deux dosages enzymatiques différentes, l&#39;une utilisant l&#39;acétylcholinestérase et l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;un ensemble de quatre kinases clés impliquées dans le cancer. Dans chaque cas, il a été possible de produire des puces qui pourraient être utilisés pour des essais de criblage de petites molécules quantitatifs et la production de courbes de réponse inhibiteur dose-dépendants. Surtout, la capacité de dépister beaucoup compagnonrials produites informations sur les types de matériaux qui conviennent le mieux à la fois la production de puces à ADN et la rétention de l&#39;activité enzymatique. Les données sur les matériaux donnent un aperçu des besoins en matériaux de base nécessaires à l&#39;adaptation optimales, puces dérivées sol-gel à haute densité.

En effectuant une analyse factorielle guidée de l&#39;écran de matériel, nous avons réussi à réduire le nombre de matériaux testés à partir de ~ 20.000 à quelques centaines qui a eu temps de gélification appropriés pour l&#39;impression. En appliquant une directive exigeant du temps de gélification du matériau stricte de 2,5 heures ou plus, les matériaux susceptibles d&#39;obstruer les aiguilles d&#39;impression ou de produire des tableaux reproductibles n&#39;ont jamais été imprimé. Les matériaux imprimables identifiés avoir suffisante (&gt; 2,5 h) temps de gélification ont été imprimés sur 4 surfaces de glissement de verre fonctionnalisés différents. Pour être considéré comme &quot;imprimable&quot;, le nombre maximum de points pour un volume d&#39;absorption de la broche a dû être imprimé (SMP3 = 200). Spots ont également été évalués pour la première place morphologie afin de s&#39;assurer qu&#39;aucune séparation de phase fissuration ou indésirables s&#39;était produite en utilisant la microscopie en fond clair simples comme le montre la figure 2. A partir de ce stade de matériaux imprimables identifiés, les puces ont été produites à l&#39;AChE etkinases incorporées dans le composant aqueux tamponné. Les matériaux qui sont compatibles avec la procédure de test (y compris surimpression potentiel et le lavage ou la coloration étapes) ont été identifiés par l&#39;observation de la rétention des taches microarray (pas de fissure, la perte de points ou de motifs de fluorescence inhabituels) et un contrôle positif (PC) à un contrôle négatif (CN ) ratio supérieur à 1, comme observé à travers l&#39;image. Comme il s&#39;agissait d&#39;environ 50% des matières, un ratio de PC / NC plus de 3 a été utilisé pour définir les matériaux optimaux avec maintien de l&#39;activité de la protéine. Grâce à cette méthode, 26 matériaux sol-gel dérivés contenant des matières Ache et 2 contenant des kinases satisfait aux critères&gt; 3 PC / NC. Figures 3 et 4 montrent une répartition graphique des 5 étapes à l&#39;écran matériels guidées pour l&#39;identification de l&#39;acétylcholinestérase et kinase optimale microarrays, respectivement. Les tests pourraient également être validés par la génération de marquer un Z &#39;17. </sup&gt; Cela a été fait en utilisant le matériau qui a produit le rapport PC / NC élevé. Figure 5 montre parcelle Z &#39;obtenue en comparant le signal généré à partir de 200 places, 100 PC et 100 NC après surimpression le colorant indicateur et le substrat sur ​​le tableau AChE. La douleur et les tableaux de kinases ont donné lieu à des scores Z &#39;respectifs de 0,60 et 0,67, indiquant une excellente analyse. Toutefois, il convient de noter que, avant la validation des essais, les concentrations enzyme, un colorant, le substrat et le cofacteur sur-array ont dû être optimisé par surimpression une gamme de concentrations de chaque composant et en sélectionnant la concentration qui produit le signal le plus élevé, comme décrit en détail ailleurs 5. Pour valider les analyses, les données quantitatives d&#39;inhibition ont été obtenus en utilisant des inhibiteurs de l&#39;AChE connus et inconnus, avec des résultats réalisés en double et utilisé pour produire des tracés en double (figure 6A) et les courbes d&#39;inhibition (figures 6B et 6C). &lt;strong&gt; Spots ont d&#39;abord été surchargés avec des mélanges d&#39;inhibiteurs à petite molécule biologiquement actives connues puis avec de la teinture et du substrat, et les mélanges de contrôle contenant soit des inhibiteurs connus ou pas d&#39;inhibiteur ont été inclus. Parcelles en double ont été réalisées pour évaluer l&#39;activité enzymatique, et les mélanges qui ont abouti à l&#39;activité de l&#39;enzyme moins de 25% ont été considérés comme positifs pour l&#39;inhibition. Composés individuels de ces mélanges ont ensuite été testés en double à identifier la petite molécule spécifique (s) responsable de l&#39;inhibition. Une fois identifiés, ces petites molécules ont été utilisés pour générer des courbes d&#39;inhibition quantitatives pour déterminer les valeurs IC50 et les constantes d&#39;inhibition. Résultats qualitatifs similaires ont été obtenus en utilisant le tableau de kinases avec un inhibiteur de la kinase commun, staurosporine. Figure 7A et 7B montrent l&#39;image des puces et indiquent que les intensités du signal après la surimpression et la coloration du multikinaseréseau sont comme prévu pour un contrôle négatif (- ATP), contrôle positif (+ ATP) et inhibiteur connu (+ ATP + INH). Pour démontrer sa capacité à obtenir des données quantitatives d&#39;inhibition des microarrays, un test d&#39;inhibition dépendante de la concentration a été fait pour une seule kinase. Comme le montrent les figures 8A et 8B, l&#39;intensité du signal diminue à mesure que la concentration d&#39;inhibiteur augmente, et la réponse suit la courbe d&#39;inhibition dépendante de la concentration attendue pour le système p38α/MBP kinase / substrat. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma général de la démarche de dépistage des matériaux guidée. Chaque bloc représente une étape de l&#39;écran dans un ordre séquentiel. Chiffres à gauche représentent le nombre total de matières préparées pour l&#39;analyse. L&#39;utilisation d&#39;un temps de gélification supérieur à 2,5 h (matériaux avec des temps de gélification de moins de 2,5 h are indiquée par l&#39;barré), le nombre de matériaux qui passaient chaque étape et reportées au cours de l&#39;écran du matériau sont indiquées par le numéro sur la droite. * Représente matériaux ayant moins de séparation de phase optimale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figure 2. Les images optiques montrent différents modes de défaillance des matériaux à l&#39;étape de l&#39;imprimabilité de l&#39;écran. Une image d&#39;un «bon» matériel (deuxième rangée, troisième colonne) sont également présentés pour comparaison. Reproduit avec la permission de la référence 8, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figure 3. Une approche de dépistage du matériau réalisé pour l&#39;identification des meilleurs matériaux pour la fabrication de dérivés de sol-gel microarrays mal. Reproduit avec la permission de référence 5, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figure 4. Une approche de criblage des matériaux réalisé pour l&#39;identification des meilleurs matériaux pour la fabrication de puces sol-gel dérivés kinase. Reproduit avec la permission de la référence 8, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figure 5. (A) Une section de microarray AChE montrant HC (vert clair) et LC (vert clair) points (une palette noir-vert a été appliquée comme pseudocouleur pour la clarté de la présentation), (B) une vue agrandie de la zone encadrée pour mettre en évidence endroit morphologie et l&#39;alignement;. et (C) une parcelle Z &#39;lignes pleines indiquent la moyenne de la<html> répétitions, tandis que les lignes pointillées correspondent à 3SD. Reproduit avec la permission de la référence 5, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figure 6. (A) en double complot pour le dépistage en série d&#39;analogues synthétiques des alcaloïdes de l&#39;Amaryllidaceae; (B) IC 50 parcelles d&#39;inhibiteurs potentiels identifiés marqués comme composés 1 et (C) composé 2, avec des barres d&#39;erreur représentent un écart type de la moyenne de 25 répétitions. spots représentatifs sont présentés pour illustrer les différences de signal proportionnel à la concentration de l&#39;inhibiteur. Reproduit avec la permission de la référence 5, copyright 2013 américaine Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figure 7. Essai sur tableau de quatre kinases en utilisant 1.4SS/1.0PVA de piégeage et imprimé sur un toboggan amine dérivé. (A) Une image d&#39;une section de puces dans lequel les taches avec kinases co-emprisonnées avec leurs substrats respectifs étaient surchargés avec un tampon (NC, rangée du haut), ou des solutions contenant de l&#39;ATP (PC, rangée du milieu) ou ATP + staurosporine (rangée du bas). (B) Les graphiques à barres comparant les intensités de signaux entre inhibés et réactions décomplexé, après soustraction du bruit de fond et les barres d&#39;erreur représentent un écart type de la moyenne de 25 répétitions. Reproduit avec la permission de la référence 8, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figure 8. Inhibiti. sur le dosage sur un p38a/MBP microarray (A) Sections de puces montrant des taches représentatives overspotted avec des concentrations variant de staurosporine, comme indiqué (les images ont été obtenues par un simple balayage de la même lame; image composite est représenté pour plus de clarté). (B) CI50 courbe générée à partir des images de réseau analysés. L&#39;intensité obtenue à 100 mM a été soustraite de toutes les images, tous les autres intensités sont normalisées en fixant l&#39;intensité obtenue à 10 nm à une valeur de 100% d&#39;activité. Reproduit avec la permission de la référence 8, copyright 2013 américaine Chemical Society. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figure 9. Images de pin furtif microscopique utilisé en contact pin-impression montrant diverses imperfections: (A) bouché, (B) cintrées.

Une approche de dépistage du matériau guidée de développer des puces dopés protéines dérivées sol-gel en utilisant une méthode pin-impression émergent de fabrication est décrit. Cette méthodologie est illustrée par le développement de l&#39;acétylcholinestérase et multikinase puces, qui sont utilisés pour le criblage de petites molécules rentable.

Une approche de dépistage des matériaux guidée pour le développement quantitatives des puces à protéines dérivées Sol-gel

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier de nouveaux matériaux à base de gel souffrant pour la fabrication de puces à ADN et d'utiliser ces matériaux pour des dosages enzymatiques à volume nanométrique. Cela est réalisé en premier lieu en identifiant des matériaux présentant des durées de réticulation suffisamment longues pour éviter la gélification dans l'aiguille d'impression de la puce pendant le processus d'impression. La deuxième étape consiste à évaluer les matériaux à durée de réticulation prolongée en fonction de leur capacité à être imprimés sous forme de puces avec une reproductibilité satisfaisante, une résistance au fendillement, une qualité d'adhérence, une absence de séparation de phase indésirable, et, en fin de compte, une activité élevée pour les enzymes piégées.Ensuite, l'enzyme d'intérêt est imprimée sous forme de puces à l'aide des matériaux optimaux, et sa capacité à déposer précisément la solution d'essai et à générer une réponse enzymatique mesurable est évaluée. La dernière étape consiste à évaluer les matériaux selon leur capacité à fournir des essais hautement reproductibles à l'aide de l'enzyme d'intérêt et à produire des données quantitatives. Le matériau final pour la fabrication de la puce est alors sélectionné.En fin de compte, les puces à protéines dérivées du gel soul sont utilisées pour identifier des petites molécules qui réduisent l'activité enzymatique. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, comme le criblage en plaque, est que l'on peut analyser un grand nombre de composés de manière systématique et très rapide en utilisant de faibles volumes de réactifs. Généralement, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés car il est possible que les composés gélifient à l'intérieur des pointes d'impression.Si ceux-ci ne sont pas correctement nettoyés, cela entraînera des zones manquantes pouvant être interprétées comme des matériaux non imprimables. Commencez par préparer les diverses solutions additives comme décrit dans le protocole textuel associé. De nombreuses solutions peuvent être préparées à l’avance et conservées jusqu’à un mois ou plus dans des conditions appropriées, mais certaines doivent être préparées le jour de l’expérience.Mélangez les scies à base de silicate de sodium immédiatement avant utilisation, et veillez à les maintenir sur glace. Le SOS doit être utilisé dans l'heure suivant l'ajout de l'eau, car des périodes d'attente plus longues entraînent des durées de DATION réduites et irrégulières. Ensuite, préparez diverses combinaisons de tampons, de polymères salans et de voies organiques selon les instructions du protocole texte accompagnant afin d'identifier quelles combinaisons peuvent être utilisées comme matériau imprimable avec des durées de dilatation supérieures à 2,5 heures.Une fois qu'un certain nombre de combinaisons ont été identifiées, régler l'humidité dans la chambre d'impression à entre 80 et 90 % ; une humidité inférieure à 80 % pourrait entraîner une évaporation de l'échantillon et des irrégularités lors de l'impression, en raison des petits volumes déposés par l'imprimante. Maintenant prêt, organiser les motifs de réseau à imprimer à l'aide du programme Chip Writer Pro. Régler la vitesse de déplacement dans les directions XY à 10 millimètres par seconde et la vitesse d'approche de l'échantillon dans la direction Z à deux millimètres par seconde, avec un temps de chargement de l'échantillon de 2,5 secondes, en utilisant les combinaisons de gel de sciage identifiées précédemment.Préparez 25 microlitres des matériaux de base en combinant les polymères, les organo lanes et les additifs de petite molécule identifiés lors du processus de présélection. Utilisez des tampons de 50 millimolaires ayant un pH de 8,0 dans des puits individuels d'une plaque microtitration de 384 puits. Ensuite, soniquez jusqu'à quatre broches à gaine fendue de 100 microns de diamètre dans de l'eau doublement distillée.Après 15 minutes, essayez-les sous un courant d'azote. Ensuite, utilisez un tire-fil pour éliminer l'humidité résiduelle à l'intérieur du support d'aiguille et placez soigneusement l'aiguille dans la tête d'impression du robot d'impression par contact à aiguille. Le fait de ne pas éliminer l'humidité résiduelle peut entraver le mouvement libre de l'aiguille avec le support, ce qui peut entraîner des points manqués.Ensuite, ajoutez 25 microlitres du SA respectif dans le puits juste avant l'impression. Mélangez la solution à l'aide d'un mouvement de pipetage ascendant et descendant répété 50 fois lors du mélange au moyen d'une pipette. Minimisez la quantité d'air incorporée dans la solution.Les bulles d'air empêchent un chargement complet de l'échantillon dans l'épingle. Ensuite, chargez l'épingle en l'abaissant dans l'échantillon. Une fois les épingles chargées, commencez le processus d'impression et imprimez l'échantillon sur une surface de lame.Interrompez le processus d'impression avant d'ajouter du sel à la plaque source suivante. Une fois le processus en pause, retirez l'aiguille d'impression à l'aide d'un aimant et insérez un cure-pipe dans la tête d'impression afin d'éviter l'accumulation d'humidité dans celle-ci. Rincez ensuite l'aiguille d'impression avec de l'eau doublement distillée et soumettez-la à une sonication dans de l'eau doublement distillée propre pendant 30 secondes.Ensuite, séchez la pointe d'impression sous un flux d'azote, puis replacez la pointe dans la tête d'impression. Continuez à mélanger, imprimer et nettoyer pour tous les échantillons restants dans la plaque source ; jusqu'à 12 000 taches, de 100 micromètres de diamètre, peuvent être déposées sur une lame unique. Une fois l'impression terminée, faites vieillir le réseau pendant un minimum de 30 minutes et jusqu'à 24 heures dans la chambre d'impression, à une humidité de 80 à 90 %.Préparez 50 microlitres du témoin positif juste avant utilisation en combinant 25 microlitres d'iodure d'acétylcholine à une concentration d'un millimolaire, 0,14 microlitre de bodipy-FIL-cystéine à cinq millimolaire et du tris à 25 millimolaire, pH 7,0, contenant 4 % de glycérol dans une cavité d'une plaque microtitration 384 puits. Pipetez lentement la solution vers le haut et vers le bas afin de bien mélanger sans créer de bulles. Ensuite, préparez les témoins négatifs juste avant utilisation en ajoutant 0,14 microlitre de boai-PI-FIL-cystéine à cinq millimolaire à 49,86 microlitres de tris à 25 millimolaire, pH 7,0, contenant 4 % de glycérol dans une autre cavité d'une plaque microtitration 384 puits, puis mélangez délicatement. Imprimez ensuite les témoins sur les puces microarray vieillies en utilisant les mêmes procédés décrits dans la section précédente. Toutefois, au lieu d'utiliser des pointes de diamètre 100 microns, utilisez des pointes fendues de diamètre 235 microns.Cela garantit que les solutions recouvrent complètement les taches préalablement déposées. Faites vieillir les puces à une humidité de 80 à 90 % pendant une heure à température ambiante en raison de l'hydrolyse spontanée de l'acétylcholine. Des temps d'incubation plus longs peuvent entraîner des faux positifs en raison d'une activité enzymatique accrue.Veillez à ce que l'imager à puces Alpha Innotech Novo soit allumé et équipé d'un filtre d'excitation de 478 ± 17 nanomètres et d'un filtre d'émission de 538 ± 21 nanomètres pour la mesure des puces microarray d'acétylcholinestérase. Ensuite, insérez la lame dans le support en orientant les taches vers le haut. Réglez le nombre de sections d'aperçu de manière à visualiser au moins une section de chaque côté de la lame de microscope, avec une résolution minimale de quatre micromètres, en utilisant la fonction d'exposition automatique.Une fois les paramètres jugés acceptables, acquérez une image de la lame et enregistrez-la au format fichier TIFF. Ensuite, ouvrez l'image de la lame acquise dans ImageJ 64. Cliquez sur l'outil de sélection ovale et sélectionnez chaque point.Sélectionnez une région légèrement plus grande que la tache observée, et veillez à utiliser une taille constante entre les taches afin de réduire la subjectivité d'ImageJ. Ensuite, mesurez l'intensité du signal de chaque tache à l'aide de l'option de mesure, sous l'onglet Analyser. Faites la moyenne de l'intensité de 25 taches de contrôle positif similaires et divisez-la par la moyenne de l'intensité de 25 taches de contrôle négatif similaires afin d'obtenir les rapports contrôle positif sur contrôle négatif pour les compositions de matériaux individuelles.Voici un exemple de la gamme dynamique des puces à ADN obtenues à l'aide de ces méthodes. Les témoins positifs ont donné des régions vert vif, tandis que les témoins négatifs ont produit des taches beaucoup plus faibles. L'intensité mesurée par ImageJ 64 montre que les témoins positifs atteignent en moyenne environ 22 000 unités de fluorescence relative, tandis que les témoins négatifs se situent en moyenne près de 8 000.Les lignes pointillées représentent trois écarts types par rapport à la moyenne. Voici des exemples de microréseaux pour un criblage de type « honor array » d'analogues synthétiques des alcaloïdes ameral sier identifiés comme le composé un et le composé deux. Les deux axes représentent le pourcentage d'enzyme déterminé à partir du signal fluorescent.En doublet, la proximité des points par rapport à la diagonale représente une forte reproductibilité du test. Des courbes de CI50 pour deux inhibiteurs potentiels différents sont présentées ici. Le composé un a donné une CI50 de 16 micromolaire, tandis que la CI50 du composé deux était de 21 micromolaire. Des taches représentatives sont affichées ci-dessus pour illustrer les différences de signal proportionnelles aux concentrations en inhibiteur.Le réseau illustré ici a été imprimé avec quatre kinases différentes : la kinase P38 MAP, EGFR et GSK, puis surimprimé avec un tampon seul, un tampon contenant de l'ATP et un tampon contenant de l'ATP et la staurosporine, un inhibiteur de l'activité enzymatique. Les résultats montrent un effet significatif de l'inhibiteur de kinase staurosporine, basé sur les intensités de fluorescence obtenues, comme décrit ici. La plus grande différence observée à la concentration de staurosporine utilisée dans cet essai provient des taches correspondant à la P38.Ici, des spots représentatifs d'une micropuce P 30 à 8:00 AM BP sont présentés, qui ont été surchargés avec des concentrations variables de stor sporine. Comme indiqué, la CI 50 de cette molécule a été déterminée à un micromolaire et est indiquée sur le graphique à droite une fois maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est effectuée correctement en suivant cette procédure.D'autres méthodes, telles que les dosages immuno-enzymatiques ou les dosages d'interaction protéique, peuvent également être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires liées au diagnostic ou à la découverte de petites molécules.

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