Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Cet article vidéo décrit une procédure permettant d’obtenir des profils de glycosylation de 20 glycoprotéines différentes dans un échantillon de sérum de patient atteint d’un carcinome hépatocellulaire à l’aide d’une puce à anticorps bloquée chimiquement : première glycoprotéine : des anticorps spécifiques sont imprimés directement sur les lames de la puce et les glycanes d’anticorps sont bloqués pour empêcher la liaison des lectines. Lorsque des échantillons de sérum de patient sont appliqués, les glycoprotéines de l’échantillon sont capturées par les anticorps. Des protéines de liaison aux glycanes biotinylées sont ensuite ajoutées pour détecter les glycanes et du neu travain diconjugué est ajouté pour marquer les lectines biotinylées.

La lame de la puce est ensuite balayée pour détecter la fluorescence : l’analyse des données résultantes révèle les profils de glycosylation des protéines de l’échantillon. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes comme l’HPLC. Cette méthode permet de détecter les glycoprotéines individuelles dans leur état natif.

Il est plus rapide et plus facile de cribler l’altération de la glycosylation pour plusieurs protéines simultanément. D’accord, nous avons découvert que les biomarqueurs de la maladie, en particulier du cancer et du cancer du foie, que nous avons examinés le plus attentivement, sont souvent glycosylés. Et la capacité de détecter des formes de glyco spécifiques que nous avons trouvées améliore considérablement les performances des biomarqueurs dans leur sensibilité et dans leur spécificité.

Cette mesure peut donc fournir des informations sur les altérations de la glycosylation sur plusieurs protéines sériques dans le CHC. Il peut également être appliqué à l’étude de la pathologie et à la découverte de biomarqueurs dans d’autres cancers et maladies tels que le cancer du pancréas, le diabète et la maladie d’Alzheimer. La démonstration de la procédure sera faite par Chen Lu, un technicien de mon laboratoire.

Commencez ce protocole en préparant d’abord la micropuce d’anticorps dans des tubes de micro-centrifugeuse de 0,8 millilitre sur de la glace, diluez tous les anticorps qui seront utilisés pour l’impression de micropuces à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre dans un minimum de 40 millilitres de PBS ici, 26 anticorps différents seront utilisés comme contrôle positif. Préparez également la même quantité de 0,5 milligramme par millilitre de BSA biotinylé dans du PBS. À l’aide d’une pipette, aliquoter 40 millilitres de chaque anticorps dans la plaque source de 384 puits sur de la glace.

Ensuite, dans le logiciel de contrôle des microréseaux, désignez l’emplacement de chaque anticorps. Ensuite, chargez la plaque sur la puce à ADN comme source. Chargez ensuite les diapositives de la puce à 20 chemins sur la puce en tant que cible.

Réglez la micropuce pour imprimer 48 puces subar identiques dans lesquelles 27 anticorps et protéines de contrôle sont repérés en trois exemplaires selon un motif neuf par neuf. Démarrez la puce pour imprimer les lames de la puce à anticorps. Récupérez les lames de microréseaux d’anticorps et stockez-les dans une cassette de lames avec un dessiccant.

Scellez la cassette dans un sac en plastique pour éviter la dénaturation des protéines et l’humidité sur les lames pendant le stockage. Conservez les lames scellées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. L’aspect le plus difficile et le plus important de cette procédure est l’étape de blocage chimique.

Pour garantir le succès, il est essentiel qu’une quantité suffisante d’anticorps soit imprimée sur la lumière du microréseau. Préparez toujours de l’IDE de sodium frais et de l’hydrocyte d’agro-acide immédiatement avant l’expérience. Et assurez-vous d’effectuer la procédure d’oxydation à quatre degrés en évitant la lumière.

Sortez les lames de la micropuce du réfrigérateur et équilibrez-les à la température ambiante pendant 30 minutes. Retirez une diapositive de la boîte de rangement. Immergez brièvement la lame dans un lavabo contenant du PBS avec 0,1 % entre 20 %.

Ensuite, immergez la lame dans un tampon d’acétate de sodium de 15 millimolaires avec 0,1 % d’entretoise pendant 10 minutes. Ensuite, préparez du sodium frais de 150 millimolaires par iodate dans un tampon d’acétate de sodium de 15 millimolaires et transférez-le dans un lavabo à glissières Conserver au réfrigérateur, en évitant la lumière jusqu’à utilisation. Retirez la lame du tampon d’acétate de sodium et placez-la dans le bassin contenant du puriate de sodium frais, avec le côté anticorps vers le haut.

Couvrez le bassin avec du papier d’aluminium pour éviter la lumière. Placez ensuite le toboggan à quatre degrés Celsius en secouant doucement pendant deux heures. Retirez la lame du bassin et rincez-la brièvement dans un tampon d’acétate de sodium trois fois pendant cinq minutes.

Incuber la lame dans 300 millilitres de solution de blocage de l’acide hydro-glutamique de 10 millimolaires fraîchement préparée dans une chambre d’incubation pendant deux heures à température ambiante en secouant doucement. Retirez les lames de la chambre et lavez-les avec du PBS à 0,1 % d’entretoi pendant trois minutes. Ensuite, dans une cuvette de lavage de lames, incubez la lame de microarray dans 300 millilitres de 1 % BSA dans du PBS avec 0,5 % d’entrejambe pendant une heure à température ambiante en secouant doucement.

Rincez les lames avec du PBS avec 0,1 % d’interpolation trois fois pendant trois minutes. Placez la lame sur un support à glissières et faites-la tourner à 1 200 fois G pendant deux minutes pour sécher la lame de la puce à air. Pour séparer chaque ensemble subar, une grille de cire est imprimée sur la diapositive.

Après avoir préchauffé l’imprimante à cire à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, chargez la diapositive bloquée de la micromatrice dans l’imprimante à cire avec le côté anticorps tourné vers la cire. Tirez doucement sur la poignée pour imprimer uniformément la cire sur la lame. Cette méthode peut être utilisée pour effectuer des tests de glycoprofilage pour un seul échantillon ou pour mesurer un seul épitope de glyco dans plusieurs échantillons.

Ici, nous allons démontrer des tests de profilage glyco. Commencez par diluer 40 microlitres de sérum dans 360 microlitres de PBS contenant 0,1 % entre 0,1 % de pont 35 et 100 microgrammes par millilitre, chacun d’IgG de souris, de rat, de lapin, de chèvre et d’âne. Ce volume est suffisant pour appliquer six microlitres de solution sérique diluée sur chaque sous-réseau.

Appliquez soigneusement six microlitres de l’échantillon dilué ou du témoin sur chaque sous-ensemble de la lame. Incuber la diapositive dans une cassette humidifiée avec des serviettes en papier humides à température ambiante pendant une heure. Rincez la lame avec du PBS avec 0,1 % d’interpolation trois fois pendant trois minutes.

Séchez ensuite la lame en la faisant tourner à 1200 fois G pendant deux minutes. Préparez 20 microlitres de protéines de liaison aux glycanes biotinylées à 10 milligrammes par millilitre dans un tube de micro-fuge de 0,8 millilitre sur de la glace. Appliquez six microlitres de lectines biotinylées diluées sur chaque sous-ensemble de la lame et incubez dans la boîte de lames humidifiée avec des serviettes en papier humides à température ambiante pendant une heure.

Après avoir rincé les lames avec du PBS à 0,1 % entre les deux fois comme précédemment, séchez la lame en la faisant tourner à 1200 fois G dans une centrifugeuse pendant deux minutes. Préparez 400 microlitres de 10 milligrammes par millilitre DITE 5 49 étiqueté neut travain en PBS 0,1 % entre deux dans un tube de micro fuge de 0,8 millilitre sur glace. À l’aide d’une pipette à répétition, appliquez six microlitres de neut travain marqué DITE 5 49 sur chaque sous-réseau et incubez la lame dans la cassette de lames humidifiée à température ambiante pendant une heure après l’incubation.

Rincez la lame avec du PBS 0,1 % entre trois fois pendant trois minutes. Séchez la lame en la faisant tourner à 1200 fois G dans une centrifugeuse pendant deux minutes. Numérisez la lame à l’aide d’un scanner à microréseaux à fluorescence à une résolution de 10 millimètres.

Les réglages laser et PMT doivent être aussi forts que possible tout en veillant à ce qu’aucune saturation ne soit observée. Ouvrez l’image dans array Pro 3.2. Configurez le modèle de matrice en fonction de la carte de matrice qui indique l’emplacement des points d’anticorps.

Alignez soigneusement chaque cercle de modèle sur l’endroit correspondant dans l’image, extrayez l’intensité de chaque point dans un fichier Excel pour une analyse plus approfondie. Une micropuce d’anticorps contenant 48 puces subar identiques avec 26 anticorps contre 20 glycoprotéines sériques et la biotine. BSA a été conçu et fabriqué comme décrit dans cette vidéo pour examiner l’importance de la procédure de blocage.

Lors de l’analyse du profilage des glycoprotéines, deux lames de puces identiques ont été générées. L’un n’a pas été bloqué chimiquement tandis que l’autre était un échantillon de contrôle a été appliqué sur les puces subar dans les colonnes un et trois et un échantillon de sérum HCC mélangé a été appliqué sur les puces subar. Dans les colonnes deux et 4 22.

Des lectines biotinylées spécifiques à différents glycanes ont ensuite été appliquées sur chaque sous-réseau, comme le montrent ces images des réseaux subar. Les lectines liées pour capturer les anticorps dans les colonnes de contrôle, ce qui donne un bruit de fond élevé qui était indiscernable des colonnes chargées de sérum dans les microréseaux non bloqués. Cependant, lorsque la même expérience a été réalisée sur une lame de microréseau d’anticorps bloquée chimiquement, il n’y avait pas ou très peu de liaison pour capturer les anticorps dans les colonnes de contrôle et une liaison élevée de l’antigène dans les colonnes chargées de sérum.

Ces résultats démontrent que la procédure de blocage chimique est une étape critique pour la mesure des glycanes sur les glycoprotéines capturées par anticorps En suivant le protocole, les profils de glycosylation de 22 glycoprotéines dans le sérum CHC peuvent être obtenus Une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en huit heures si elle fonctionne correctement. Les anticorps, lorsqu’ils sont modifiés, peuvent perdre leurs affinités pour leurs antigènes et d’autres propriétés.

Il est donc important de garder cela à l’esprit et d’utiliser plusieurs anticorps différents dans différentes sources d’anticorps après cette procédure. D’autres mesures, telles que la détection de chaque concentration de protéines à l’aide de la même lame microrayonnante, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si l’altération de la glycosylation est due à la modification des niveaux d’expression des protéines ou uniquement à l’altération de la glycosylation sur chaque protéine individuelle. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sérum contenant des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.