Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Cet article vidéo décrit une procédure permettant d'obtenir les profils de glycosylation de 20 glycoprotéines différentes dans un échantillon de sérum provenant d'un patient atteint d'un carcinome hépatocellulaire, en utilisant une puces d'anticorps chimiquement bloquée. Des anticorps spécifiques des glycoprotéines sont directement imprimés sur des lames de puces, et les glycannes des anticorps sont bloqués afin d'empêcher la liaison de lectines. Lorsque des échantillons de sérum de patient sont appliqués, les glycoprotéines présents dans l'échantillon sont capturés par les anticorps. Des protéines de liaison aux glycannes marquées à la biotine sont ensuite ajoutées pour détecter les glycannes, puis de la néutravine doublement conjuguée est ajoutée pour marquer les lectines biotinylées.

La lame de puces à ADN est ensuite analysée par lecture fluorescente ; l'analyse des données obtenues révèle les profils de glycosylation des protéines échantillonnées. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes telles que la HPLC. Elle permet la détection de glycoprotéines individuelles dans leur état natif.

Il est plus rapide et plus facile de cribler simultanément la modification de la glycosylation pour de multiples protéines. En effet, nous avons constaté que les biomarqueurs de maladies, en particulier du cancer et du cancer du foie, que nous avons examinés avec le plus grand soin, sont souvent glycosylés. Et nous avons constaté que la capacité à détecter des formes glycosylées spécifiques améliore considérablement les performances des biomarqueurs, tant en sensibilité qu'en spécificité.

Ainsi, cette mesure peut fournir des informations sur les altérations de la glycosylation de multiples protéines sériques dans le CHC. Elle peut également être appliquée à l'étude pathologique et à la découverte de biomarqueurs dans d'autres cancers et maladies, tels que le cancer du pancréas, le diabète et la maladie d'Alzheimer. La procédure sera démontrée par Chen Lu, un technicien de mon laboratoire.

Commencez ce protocole en préparant d'abord la matrice de micro-réseaux d'anticorps dans des tubes de microcentrifugation de 0,8 millilitre sur de la glace ; diluez tous les anticorps qui seront utilisés pour l'impression du micro-réseau à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre dans un volume minimal de 40 millilitres de PBS. Ici, 26 anticorps différents seront utilisés comme témoin positif. Préparez également la même quantité d'albumine sérique bovin biotinylée (BSA) à 0,5 milligramme par millilitre dans le PBS. Utilisez une pipette pour répartir 40 millilitres de chaque anticorps dans la plaque source de 384 puits sur glace.

Ensuite, dans le logiciel de contrôle du microarray, désignez l'emplacement de chaque anticorps. Chargez ensuite la plaque sur le microarray en tant que source. Puis chargez 20 lames de microarray sur le microarray en tant que cible.

Configurer le microdispositif pour imprimer 48 sous-réseaux identiques, dans lesquels 27 anticorps et protéines de contrôle sont déposés en triple exemplaire selon un motif de neuf par neuf. Démarrer l'impression des lames de microréseau d'anticorps. Récupérer les lames de microréseau d'anticorps et les conserver dans une cassette à lames avec un agent desséchant.

Scellez la cassette dans un sac en plastique afin d'éviter la dénaturation des protéines et l'humidité sur les lames pendant le stockage. Conservez les lames de puces à ADN scellées à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. L'aspect le plus difficile et le plus important de cette procédure est l'étape de blocage chimique.

Pour assurer le succès, il est essentiel qu'une quantité suffisante d'anticorps soit imprimée sur la puce micro-photométrique. Préparez toujours du IDE sodium et de l'acide agro hydrocyte frais juste avant l'expérience. Veillez également à effectuer la procédure d'oxydation à quatre degrés à l'abri de la lumière.

Sortez les lames de puces de l'imprimante et laissez-les s'équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez une lame de la boîte de stockage. Immergez brièvement la lame dans un bac de lavage contenant du PBS avec 0,1 % de Tween 20.

Ensuite, plonger la lame dans un tampon d'acétate de sodium 15 millimolaire contenant 0,1 % de Tween pendant 10 minutes. Préparer ensuite du périodate de sodium 150 millimolaire fraîchement dissous dans un tampon d'acétate de sodium 15 millimolaire, puis transférer la solution dans un bac de lavage pour lames. Conserver au réfrigérateur, à l'abri de la lumière, jusqu'à utilisation. Retirer la lame du tampon d'acétate de sodium et la placer dans le bac contenant le périodate de sodium fraîchement préparé, côté anticorps vers le haut.

Couvrir le bac avec du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Placer ensuite le bac à lames à quatre degrés Celsius avec agitation douce pendant deux heures. Retirer la lame du bac et la rincer brièvement trois fois dans du tampon d’acétate de sodium, cinq minutes à chaque fois.

Incuber la lame dans 300 millilitres de solution de blocage fraîchement préparée d'acide hydroglutamique 10 millimolaire dans une chambre d'incubation pendant deux heures à température ambiante avec agitation douce. Retirer les lames de la chambre et les laver avec du PBS contenant 0,1 % de Tween pendant trois minutes. Ensuite, dans un bac de lavage pour lames, incuber la lame de microarray dans 300 millilitres de BSA 1 % dans du PBS contenant 0,5 % de Tween pendant une heure à température ambiante avec agitation douce.

Rincez les lames dans du PBS contenant 0,1 % de Tween trois fois pendant trois minutes. Placez la lame sur un support pour lames et centrifugez à 1 200 × g pendant deux minutes afin de sécher la lame de microarray. Pour séparer chaque sous-réseau, une grille en cire est imprimée sur la lame.

Après avoir préchauffé l'empreinteur à cire à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, insérez la lame de microarray bloquée dans l'empreinteur à cire, côté anticorps orienté vers la cire. Tirez doucement sur le levier pour appliquer la cire uniformément sur la lame. Cette méthode peut être utilisée pour réaliser soit des essais de profilage glyco pour un échantillon unique, soit pour mesurer un unique épitope glyco dans plusieurs échantillons.

Ici, nous allons démontrer des dosages de profilage glycosidique. Commencez par diluer 40 microlitres de sérum dans 360 microlitres de PBS contenant 0,1 % de tween, 0,1 % de bridge 35 et 100 microgrammes par millilitre, chacun d’IgG de souris, de rat, de lapin, de chèvre et d’âne. Ce volume suffit pour appliquer six microlitres de solution de sérum diluée sur chaque sous-réseau.

Appliquez soigneusement six microlitres de l'échantillon dilué ou du témoin sur chaque sous-réseau de la lame. Incubez la lame dans une cassette humidifiée avec des serviettes en papier humides à température ambiante pendant une heure. Rincez la lame avec du PBS contenant 0,1 % de Tween trois fois pendant trois minutes.

Ensuite, séchez la lame en la centrifugeant à 1200 ×g pendant deux minutes. Préparez 20 microlitres de protéines de liaison aux glycanes biotinylées à 10 milligrammes par millilitre dans du PBS contenant du Tween, dans un tube microfuge de 0,8 millilitre placé sur de la glace. Appliquez six microlitres des lectines biotinylées diluées sur chaque sous-réseau de la lame et incubez dans une boîte à lames humidifiée avec des serviettes en papier humides, à température ambiante pendant une heure.

Après avoir rincé les lames avec du PBS contenant 0,1 % de Tween trois fois comme précédemment, séchez la lame en la faisant tourner à 1200 × g dans une centrifugeuse pendant deux minutes. Préparez 400 microlitres de DITE 5 49 marqué neut travain à 10 milligrammes par millilitre dans du PBS contenant 0,1 % de Tween dans un tube microfuge de 0,8 millilitre sur de la glace. Utilisez une pipette répétitive pour appliquer six microlitres de DITE 5 49 marqué neut travain sur chaque sous-réseau, puis incubez la lame dans la cassette humidifiée pour lames à température ambiante pendant une heure après l'incubation.

Lavez la lame avec du PBS 0,1 % Tween trois fois pendant trois minutes. Séchez la lame en la faisant tourner à 1200 × g dans une centrifugeuse pendant deux minutes. Analysez la lame à l'aide d'un scanner de puces à fluorescence avec une résolution de 10 millimètres.

Les réglages du laser et du PMT doivent être aussi élevés que possible tout en s'assurant qu'aucune saturation n'est observée. Ouvrez l'image dans Array Pro 3.2. Configurez le modèle de réseau selon la carte de réseau indiquant les emplacements des taches d'anticorps.

Alignez soigneusement chaque cercle de modèle sur l'emplacement correspondant dans l'image, puis extrayez l'intensité de chaque point dans un fichier Excel pour une analyse ultérieure. Une puce à anticorps contenant 48 sous-puces identiques, chacune comportant 26 anticorps dirigés contre 20 glycoprotéines sériques et de la biotine, a été conçue et fabriquée comme décrit dans cette vidéo afin d'examiner l'importance de la procédure de blocage.

Lors de l'analyse du profilage des glycoprotéines, deux lames identiques de micropuces ont été préparées. L'une n'a pas été bloquée chimiquement, tandis que l'autre était utilisée comme témoin. Un échantillon témoin a été appliqué sur les sous-réseaux des colonnes une et trois, et un échantillon de sérum de CCH groupé a été appliqué sur les sous-réseaux des colonnes deux et quatre 22.

Des lectines biotinylées spécifiques à différents glycanes ont ensuite été appliquées sur chaque sous-réseau, comme illustré sur ces images des sous-réseaux. Les lectines se sont liées aux anticorps de capture dans les colonnes témoins, produisant un signal de fond élevé, indiscernable de celui des colonnes chargées avec du sérum sur les puces à anticorps non bloquées. Toutefois, lorsque la même expérience a été réalisée sur une puce à anticorps bloquée chimiquement, aucune ou très faible liaison aux anticorps de capture n’a été observée dans les colonnes témoins, tandis qu’un fort signal de liaison antigénique a été détecté dans les colonnes chargées avec du sérum.

Ces résultats démontrent que la procédure de blocage chimique est une étape cruciale pour la mesure des glycanes sur les glycoprotéines capturées par anticorps. En suivant le protocole, les profils de glycosylation de 22 glycoprotéines dans le sérum de carcinome hépatocellulaire peuvent être obtenus une fois la méthode maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est correctement exécutée. Les anticorps, lorsqu'ils sont modifiés, peuvent perdre leur affinité pour leurs antigènes ainsi que d'autres propriétés.

Il est donc important de garder cela à l'esprit et d'utiliser plusieurs anticorps différents provenant de diverses sources d'anticorps en suivant cette procédure. D'autres mesures, telles que la détection de la concentration de chaque protéine à l'aide de la même lame de microréseau, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si l'altération de la glycosylation est due à un changement des niveaux d'expression protéique ou uniquement à une modification de la glycosylation de chaque protéine individuelle. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons sériques contenant des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.