Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une expérience de microréseau à l’aide d’un appareil mélangeur automatisé. Ceci est accompli en analysant d’abord la qualité des échantillons d’ARN avec le bioanalyseur après l’amplification et le marquage de l’ARN. Les échantillons d’ARN sont hybridés aux microréseaux.

Enfin, les microréseaux hybrides sont lavés et scannés. En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent l’expression différentielle des transcrits d’ARN grâce à l’analyse d’images de microréseaux de fluorescence bicolores. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’hybridation des microréseaux sont difficiles à apprendre en raison de l’équipement spécialisé.

L’analyse du contrôle de la qualité commence par la préparation de l’instrument de bioanalyseur de 2 100 et de la station d’amorçage de la puce, comme indiqué dans la procédure écrite. La matrice de gel est ensuite filtrée par pipetage de 550 microlitres dans un filtre de spin équipé d’une centrifugeuse en kit nano ARN 6 000. Le filtre à 1 500 RCF pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, aliquote le gel filtré en aliquotes de 65 microlitres, qui peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois. Vortex le concentré de colorant pendant 10 secondes et ajoutez un microlitre à une aliquote de 65 microlitres. Un gel filtré après vortex de la centrifugeuse de mélange à 13 000 FCR pendant 10 minutes à température ambiante pour analyser les échantillons.

Positionnez d’abord une puce sur la station d’amorçage. Dans cette démonstration, 6 000 nanopuces d’ARN sont utilisées. Chargez neuf microlitres du mélange de colorant gel dans le puits marqué d’un G blanc sur fond noir.

Avec la pointe de la pipette positionnée tout au fond du puits. Positionnez le piston de la seringue à un millilitre et fermez la station d’amorçage. Appuyez lentement mais régulièrement sur le piston jusqu’à ce qu’il soit maintenu par le clip.

Après 30 secondes, relâchez le clip et laissez le piston monter quelques secondes. Une fois le piston arrêté, ramenez-le en position d’un millilitre et ouvrez la station d’amorçage. Chargez neuf microlitres de la matrice de gel.

Mélangez dans chacun des deux puits. Marquez G.Ensuite, placez cinq microlitres du marqueur dans le puits de l’échelle et dans chacun des 12 puits d’échantillon. Chargement suivant, un microlitre de l’échelle dénaturée dans le puits de l’échelle et un microlitre de chaque échantillon dénaturé dans les puits d’échantillon.

Enfin, ajoutez un microlitre du marqueur dans chaque échantillon non utilisé. Eh bien, une fois chargée, faites vortex la puce pendant une minute à 2, 400 tr/min. Après avoir démarré le logiciel expert 2, 100, positionnez la puce et fermez le couvercle.

Assurez-vous que le bon port est sélectionné et exécutez le test dans les cinq minutes suivant le chargement des échantillons pour éviter l’évaporation. Les méthodes d’amplification et de marquage de l’ARN se trouvent dans le protocole écrit. Une fois marqué, purifiez le CRNA pour éliminer tous les nucléotides non incorporés À l’aide de cogens ou de mini-colonnes faciles, le CRNA marqué peut ensuite être quantifié avec un photomètre à spectres NanoDrop 2000

En mode de mesure sur microréseau, enregistrez la concentration de l’échantillon, le rendement et l’activité spécifique. Pour l’hybridation sur puce, il est nécessaire d’obtenir un rendement d’au moins 825 nanogrammes et une activité spécifique d’au moins huit picomoles par microgramme au moins deux heures avant l’hybridation sur puce. Allumez la station d’hybridation et réglez-la à 65 degrés Celsius.

Ce protocole décrit l’utilisation de réseaux 4K Agilent quatre par 40 avec le système d’hybridation Nimble gen de Roche et quatre chambres de mélange suite à la fragmentation CRNA effectuée comme décrit dans le protocole écrit, préparer la chambre d’hybridation. Placez une glissière de microréseau dans le côté code-barres de l’outil de démontage de l’assemblage. Ouvrez d’abord un mélangeur A four et exposez l’adhésif qui maintient l’ensemble et l’outil de démontage pour éviter tout mouvement.

Placez le mélangeur A four sur la diapositive en commençant par l’extrémité. Assurez-vous qu’il est correctement aligné sur l’outil et collez le mélangeur le long du réseau. Faites glisser la traction à partir de l’extrémité du mélangeur pour retirer l’ensemble du mélangeur à glissières.

À l’aide de l’outil de braiage, appuyez tout le long du joint adhésif pour vous assurer qu’il est bien collé à la glissière. De petites bulles d’air piégées entre l’adhésif et la diapositive sont visibles sur le fond sombre. Prenez plus de temps pour éliminer ces bulles avec l’outil de braiement.

Le tableau est maintenant prêt à être chargé. Utilisez une perpet à déplacement positif pour charger 100 microlitres de l’échantillon d’hybridation. Poussez fermement l’embout à l’intérieur du hublot et distribuez lentement et en douceur afin que l’air ne soit pas emprisonné dans la zone du réseau.

Lorsque l’échantillon couvre l’ensemble du réseau et que le liquide commence à sortir, l’orifice de ventilation retire rapidement la pipette, relâche uniquement le piston. Une fois que la pointe est éloignée de la lame, tamponnez doucement l’excès de liquide aux deux orifices, en prenant soin de ne pas prélever l’échantillon hors de la chambre elle-même. Couvrez ensuite les hublots avec des autocollants à l’aide d’une pince à épiler.

Placez la glissière sur la station d’hybridation et vérifiez que les trous de la vessie sont correctement positionnés sur les joints toriques. Cela garantira un bon mélange lors de l’hybridation. Fermez le couvercle de la glissière et le couvercle de la station.

Réglez la station sur le mode de mixage B et hybridez le réseau à 65 degrés Celsius pendant 17 heures. Une fois que le plat en verre de remplissage étiqueté A avec tampon de lavage un est terminé, le plat doit être suffisamment grand pour contenir l’outil de démontage de l’assemblage et permettre également certaines manœuvres. Tous les lavages doivent être effectués dans de la verrerie, car le plastique a tendance à lessiver les composés, ce qui entraîne un bruit de fond élevé dans le réseau.

Mettez une grille coulissante et une barre d’agitation dans un plat de coloration. Étiqueté B, remplissez le plat avec un tampon de lavage couvrant la grille et placez le plat sur une plaque à mélanger à température ambiante. Ajoutez également une barre d’agitation dans un plat de coloration vide étiqueté C et placez-la sur une plaque d’agitation.

Retirez le réseau de la station d’hybridation et placez-le dans l’outil de démontage de l’assemblage. Immergez l’ensemble dans le plat en tenant d’une main l’outil de démontage de l’assemblage et la glissière des côtés opposés. Décollez soigneusement le mélangeur A four en prenant soin de ne pas rayer la zone du réseau.

Placez rapidement la lame sur la grille et le plat de coloration B.L’exposition à l’air doit être minimisée car le colorant SCI cinq est sensible à l’ozone. Lavez l’effaceur pendant une minute en remuant à vitesse moyenne. Remplissez le plat de coloration C avec le tampon de lavage préchauffé deux.

Transférez les lames et lavez-les pendant une minute. Après le lavage très lentement, retirez la grille coulissante du plat C pour minimiser les gouttelettes laissées sur la lame. Séchez la lame en la tournant pendant deux minutes.

Ensuite, placez la lame dans un tube conique de 50 millilitres et remplissez-la immédiatement de gaz argon à l’aide d’un scanner de gènes 4 000 B à partir de dispositifs moléculaires pour éviter la perte de signal indiquée. Voici des exemples de quatre échantillons d’ARN isolés du cerveau humain. La qualité de l’échantillon de tissu tumoral a été évaluée à l’aide du bioanalyseur 2 100 sur une puce d’ARN 6 000.

Les pointes de flèche pleines et ouvertes indiquent la position des espèces 18 s et 28 S-R-R-N-A, respectivement. L’indice d’intégrité de l’ARN ou RIN est une mesure quantitative de la qualité de l’ARN de bonne qualité Total. Les échantillons d’ARN ne devraient produire que deux pics majeurs lorsqu’ils sont analysés dans un bioanalyseur pour le contrôle de la qualité correspondant aux deux principales espèces d’ARN ribosomiques.

Une certaine dégradation de l’ARN se manifestera par un frottis avant le premier pic d’ARN ribosomique et un pic significativement plus faible pour 28 S-R-R-N-A sévèrement dégradés. L’ARN de mauvaise qualité présentera un pic large ou une série de pics à de faibles temps de rétention. Alors que les deux pics d’ARN ribosomique seront d’une intensité très faible ou ne seront pas identifiables du tout.

Des réseaux de bonne qualité devraient produire un signal élevé à des valeurs PMT relativement faibles. La plupart des transcrits devraient être présents à des niveaux similaires dans l’échantillon expérimental et l’échantillon de référence. Des changements massifs et généralisés dans l’expression des gènes seront probablement dépourvus de toute signification biologique.

Par conséquent, la majeure partie du tableau doit être jaune plutôt que verte ou rouge. Les signaux de bonne qualité doivent également se trouver dans une plage dynamique telle que les histogrammes des signaux se chevauchent complètement, comme le montre le nuage de points de l’image du réseau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une expérience de microréseau à l’aide d’un appareil d’hybridation automatisé.