Name: Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Apprenez le contrôle qualité de l'ARN, l'hybridation sur puce à ADN et le balayage pour le profilage d'expression génique dans le système nerveux. Cette méthode automatisée permet d'analyser la différenciation des transcrits par imagerie à fluorescence.

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Ce travail a été soutenu par des subventions à l&#39;ED de la James S. McDonnell 21 Programme er Prix siècle, et le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle. AGE a été soutenu en partie par une bourse postdoctorale du California Institute of Regenerative Medicine.

1. Analyse de contrôle de la qualité de l'échantillon d'ARN avec 2100 bioanalyseur Avant de commencer, <ol><li> Dénaturer l'échelle et vos échantillons à 70 ° C pendant 10 min. Réfrigérer immédiatement sur la glace. </li><li> Nettoyer les électrodes avec des instruments RNaseZAP pendant 1 min, suivie par l'eau sans RNase pendant 10 sec. Autoriser les électrodes sécher à l'air. </li><li> Préparer la matrice de gel par pipetage 550 pl de la matrice de gel dans un filtre rotatif fourni avec le kit. Centrifuger à 1500 RCF pendant 10 min à température ambiante. Aliquoter filtré sur gel en 65 aliquotes et stocker à 4 ° C pour un maximum de 1 mois. </li><li> Afin de préparer la station d'amorçage à puce, <ol class="lalpha"><li> Insérer une seringue de 1 ml dans le clip et dans l'adaptateur luer lock. </li><li> Ajustez la plaque de base à la position C en desserrant la vis sous la base, en soulevant la plaque et en resserrant la vis. </li><li> Ajustez le clip de la seringue pour la première position. </li></ol></li><li> Equilibrer le concentré de teinture à la température ambiante. Vortex pendant 10 sec. Ajouter 1 l de teinture à une aliquote de 65 pl de gel filtré. Vortex bien et centrifuger à 13 000 RCF pendant 10 min à température ambiante. Utiliser moins d'un jour. Lorsque vous êtes prêt à exécuter vos échantillons, </li><li> Position d'une puce sur la station d'amorçage. Dans ce protocole, nous utilisons des puces ARN 6000 nano. Pour charger le gel, <ol class="lalpha"><li> Pipette 9 ul du mélange gel-dye dans le bien marqués avec un blanc "G" sur un fond noir. Assurez-vous que votre astuce est positionné au bas du puits. </li><li> Positionner le piston de la seringue à 1 ml. Fermer la station d'amorçage. Assurez-vous qu'il cliquez-écluses. </li><li> Appuyez sur le piston vers le bas, lentement mais sûrement jusqu'à ce qu'elle soit tenue par le clip. </li><li> Attendre 30 sec. Libérez le clip. </li><li> Laissez le piston monte en soi. Après qu'il cesse de bouger, d'attendre quelques secondes et tirez sur le piston à la position de 1 ml. Ouvrez la station d'amorçage. </li></ol></li><li> Pipette 9 ul du mélange gel-dye dans chacun des 2 puits marqué "G". </li><li> Pipeter 5 pl du marqueur dans chacun des 12 puits d'échantillon et de l'échelle bien. </li><li> Pipeter 1 pl de l'échelle préparés échelle bien. </li><li> Pipeter 1 ul de chaque échantillon dans le puits d'échantillon. </li><li> Pipeter 1 pl de la marque dans chaque échantillon inutilisée bien. </li><li> Vortex de la puce pendant 1 min à 2400 rpm. </li><li> Pour exécuter la puce, <ol class="lalpha"><li> Démarrez le logiciel 2100 Expert. </li><li> Position de la puce et fermer le couvercle. Si l'instrument est en ligne, une icône apparaîtra si le couvercle est ouvert ou fermé et quel type de puce est insérée. Assurez-vous que le port correct est sélectionné. </li><li> Dosage Exécutez sein d'embarquement 5 mn les échantillons pour prévenir évaporation. </li></ol></li></ol> 2. L'amplification et l'étiquetage Pour se préparer à l'analyse des microréseaux, des échantillons d'ARN sont amplifiés et marqués, habituellement dans une réaction basée sur l'ARN polymérase T7 3. ADNc double brin est généré par transcription inverse. L'ADNc est utilisé dans une réaction de transcription in vitro pour générer ce qui est connu comme ARNc. Cette réaction est effectuée en présence de ribonucléotides étiquetés, produisant des quantités de microgramme d'ARN marqués d'hybridation tableau. Le choix de l'amplification / étiquetage des méthodes dépend de la plateforme microarray postérieurement à être utilisé. Dans cette section, nous décrivons la génération d'ARN marqué par fluorescence à l'aide d'Agilent kit rapide étiquetage Amp. <ol><li> Pipeter 50 ng à 5 ug d'ARN dans un tube de 1,5 ml. Le volume ne doit pas dépasser 8,3 pi. Si nécessaire, concentrer votre échantillon d'ARN par centrifugation sous vide ou par précipitation avec de l'alcool. </li><li> Ajouter 1,2 ul d'apprêt T7. </li><li> Porter à un volume final de 11,5 ul avec l'eau sans RNase. </li><li> Incuber à 65 ° C pendant 10 min pour dénaturer l'ARN. Nous vous recommandons d'utiliser un thermocycleur avec un couvercle chaud pour éviter la condensation dans le haut du tube. </li><li> Pendant les 10 minutes d'incubation, Buffer 5X First Strand chaude à 80 ° C pendant 5 min. Vortex et spin bas. Gardez à température ambiante jusqu'au moment de servir. </li><li> Après l'incubation de 10 min, refroidir rapidement les échantillons d'ARN dénaturé sur la glace. </li><li> Préparer le mélange maître d'ADNc. Par réaction, ajoutez la ligne suivante: <ol class="lalpha"><li> 4 pl de tampon 5X First Strand </li><li> 2 pl 0,1 M TNT </li><li> 1 pl 10 mM de dNTPs </li><li> 1 pl MMLV-RT enzymatiques </li><li> 0,5 sur ul RNase. </li></ol></li><li> Mélanger les composants en inversant le tube 4 fois. Ne pas vortex. Isoler pour recueillir le contenu au fond du tube. </li><li> Ajouter 8,5 ul de mélange maître par échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 40 ° C, suivi de 10 min à 65 ° C. Nous vous recommandons d'utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé. </li><li> Transférer les tubes à la glace pendant 5 min. </li><li> Préparer le mélange maître de transcription. Par réaction, ajoutez la ligne suivante: <ol class="lalpha"><li> 15,3 ul eau sans nucléase </li><li> 20 plTampon de transcription 4X </li><li> 6 pl 0,1 M TNT </li><li> 8 PNT ul </li><li> 6,4 ul de PEG 50% (PEG doit être préchauffée à 40 ° C et un vortex pour assurer la remise en suspension) </li><li> 0,5 ul RNase Out </li><li> 0,6 ul pyrophosphatase inorganique </li><li> 0,8 ul T7 RNA polymérase </li><li> 2,4 ul-Cy3 ou Cy5 CTP </li></ol></li><li> Centrifuger brièvement les échantillons pour recueillir le contenu au fond du tube. </li><li> Ajouter 60 ul de Mix Master transcription par échantillon. </li><li> Incuber à 40 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 20 ul d'eau sans RNase. </li><li> Purifier l'ARNc marqué pour enlever nucléotides non incorporés. Nous recommandons l'utilisation de Qiagen RNeasy mini colonnes. </li><li> Quantifier les ARNc marqué. Nous recommandons l'utilisation d'un spectrophotomètre NanoDrop2000 en mode de mesure biopuces. Assurez-vous que vous sélectionnez l'ARN-40 comme le type d'échantillon. </li><li> Concentration de l'échantillon record, le rendement (calculé comme la concentration, multipliée par le volume) et l'activité spécifique (calculée comme 1000, multiplié par la ration de concentration du colorant sur la concentration ARNc). Pour l'hybridation puces, il est nécessaire d'atteindre un rendement d'au moins 825 ng et une activité spécifique d'au moins 8 pmol / mg. </li></ol> 3. L'hybridation Microarray <ol><li> Tournez sur la station d'hybridation et réglé à 65 ° C au moins 2 heures avant l'hybridation commence. </li><li> Pour préparer l'échantillon hybridation, mélanger les suivants dans un tube de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3 ARNc (ce qui est généralement votre "traité" de l'échantillon) </li><li> 825 ng Cy5-ARNc (ce qui est généralement votre «référence» de l'échantillon) </li><li> 11 ul d'agent de blocage 10X. </li><li> Ajouter l'eau sans RNase à un volume final de 52,8 ul </li><li> Ajouter 2,2 ul de tampon de fragmentation. </li></ol></li><li> Vortex à basse vitesse pour mélanger. </li><li> Incuber à 60 ° C pendant exactement 30 minutes. Cette étape est la fragmentation des ARNc, qui génère des fragments marqués d'hybridation tableau. Il est très important pour incuber exactement comme décrit. Nous recommandons l'utilisation d'un thermocycleur avec un couvercle chauffé. Il est très important pour incuber exactement comme décrit pour générer des sondes de la durée moyenne correcte. Une fragmentation excessive ou insuffisante se traduira par de faux négatifs ou faux positifs. </li><li> Ajouter 55 ul de tampon d'hybridation 2X pour arrêter la fragmentation. Mélanger à la pipette, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. </li><li> Centrifuger 1 min à vitesse maximale pour recueillir le contenu au fond du tube. Si des bulles sont observées, centrifugeuse plus de temps à les supprimer. </li><li> Placer le tube sur la glace, protégé de la lumière. Chargez l'échantillon sur le tableau dès que possible. </li><li> Pour charger le tableau, d'abord préparer la chambre d'hybridation. Ce protocole décrit l'utilisation de tableaux 4x44K Agilent avec le système d'hybridation et de la Roche-Nimblegen chambres mélangeur A4. <ol class="lalpha"><li> Placez une diapositive dans la puce le code à barres de montage / démontage d'outils, d'abord. </li><li> Ouvrir un mélangeur A4 et exposer l'adhésif. Tenir le tableau et l'assemblage / désassemblage outil pour empêcher tout mouvement, placer le mélangeur A4 sur la diapositive, en commençant à l'extrémité. Assurez-vous qu'il est correctement aligné sur l'outil. Bâton mélangeur tout au long de la glissière de tableau. </li><li> Tirez sur la fin de la table de mixage pour enlever la lame / montage mélangeur. </li><li> Utilisation de l'outil braiment, la presse tout au long du joint adhésif pour s'assurer qu'il est solidement collé à coulisseau. Petites bulles d'air piégées entre l'adhésif et la lame peut être vu sur un fond sombre. Prenez le temps supplémentaire pour éliminer ces bulles avec l'outil braiement. Votre tableau est maintenant prêt à être chargé. </li></ol></li><li> Utiliser une pipette à déplacement positif à une charge de 100 pl de l'échantillon d'hybridation. Poussez le bout serré dans le trou du port, puis passer lentement et en douceur pour que l'air n'est pas emprisonné dans la zone de tableau. Ne jamais essayer d'aspirer l'échantillon sauvegarder. Une fois l'ensemble de l'échantillon a été distribuée, garder la pointe sur le hublot, sans relâcher le piston. Lorsque l'échantillon couvre la totalité du tableau et le liquide commence à sortir de l'évent, enlever rapidement la pipette. Seul le piston communiqué une fois que la pointe est loin de la glissière. </li><li> Tamponnez délicatement l'excès de liquide dans les deux ports. Assurez vous de ne pas tirer l'échantillon hors de la chambre elle-même. </li><li> Recouvrez les trous du port avec des autocollants en utilisant une pince à épiler. </li><li> Mettez la lame sur la station d'hybridation, et vérifiez que les trous vessie sont correctement positionnés sur les joints toriques. Cela permettra d'assurer un bon mélange lors de l'hybridation. </li><li> Fermez le couvercle coulissant et le couvercle station. Réglez la station de mélange en mode B. </li><li> Hybrider le tableau à 65 ° C pendant 17 heures. </li><li> Préparer le tampon de lavage 2 en ajoutant de Triton X-102 à une concentration finale de 0,005%. Gardez à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 4. Laver Microarray <ol><li> Ajouter Triton X-102 à Wash Buffer 1 à une concentration finale de 0,005%. Conserver à températur ambiantee. </li><li> Lorsque l'hybridation est terminé, remplir un verre plat "A" avec le tampon de lavage 1. Le plat doit être assez grand pour tenir l'outil de montage / démontage et de permettre des manœuvres aussi bien. Tous les lavages doit être fait dans de la verrerie. Eviter les plats en plastique, car ils ont tendance à lessiver les composés résultant de fond élevé dans le tableau. </li><li> Mettez un rack de diapositives et un barreau dans un plat à coloration «B». Remplir avec le tampon de lavage 1, faire en sorte qu'il recouvre la baie. Placer sur une plaque d'agitation à température ambiante. </li><li> Mettez un barreau sur un plat de coloration vide "C" et le placer sur une plaque d'agitation. </li><li> Retirez le tableau et le mettre dans l'outil de montage / démontage. Plonger l'ensemble dans le plat "A". </li><li> Tout en maintenant l'outil de montage / démontage et la diapositive à partir des côtés opposés d'une seule main, soigneusement décoller le mélangeur A4. Assurez vous de ne pas rayer la zone de tableau. </li><li> Vite placer la lame dans le rack de coloration plat "B". A partir de maintenant, l'exposition à l'air doit être minimisée car le colorant Cy5 est sensible à l'ozone. Ne lavez pas plus de 8 tableaux à la fois. </li><li> Laver pendant 1 minute en remuant à vitesse moyenne. </li><li> Remplissez coloration plat "C" avec le tampon de lavage préchauffé 2. Placer les lames et laver pendant 1 minute. </li><li> Très lentement, retirez le porte-diapositive de coloration plat "C" pour minimiser les gouttelettes laissées sur la diapositive. </li><li> Sécher le glisser en faisant tourner pendant 2 minutes. Si une centrifugeuse compatibles n'est pas disponible, centrifuger les glisser dans un tube conique de 50 ml ou un coup de gaz argon sur elle. </li><li> Placer les lames dans un tube conique de 50 ml et le remplir avec du gaz argon. Balayage immédiatement pour éviter la perte de signal. Nous recommandons d'utiliser le scanner GenePix 4000B de Molecular Devices. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Bonne qualité totale échantillons d'ARN devrait produire seulement deux pics majeurs lorsqu'il est exécuté dans un bioanalyseur de contrôle de qualité, correspondant aux deux principales espèces d'ARN ribosomal. Certains dégradation de l'ARN se montrer comme un frottis avant le pic premier ARN ribosomal. Fortement dégradées, l'ARN de faible qualité montrera un large pic ou d'une série de pics au temps de rétention faible, tandis que les 2 pics ARN ribosomique seront de très faible intensité ou pas identifiables à tout. Pour des exemples de la sortie 2100 bioanalyseur, voir la figure 1. L'Expert 2100 logiciel calcule un numéro intégrité de l'ARN, ou RIN, comme une mesure quantitative de la qualité de l'ARN. Échantillons de haute qualité, avec des valeurs RIN supérieur à 9, sont évidemment mieux pour les applications de biopuces. Cependant, nous avons utilisé des échantillons avec des valeurs RIN aussi bas que 5,2 pour générer données de biopuces de qualité raisonnable. Tableaux de bonne qualité devrait produire un signal à des valeurs élevées PMT relativement faible. Dans notre expérience, la plupart des transcriptions devraient être présents à des niveaux similaires dans l'échantillon expérimental et de référence; massive, de vastes changements dans l'expression génique sera probablement n'ont aucune signification biologique. Par conséquent, la plupart du tableau devrait ressembler plutôt jaune que verte ou rouge. Signaux de bonne qualité devrait également être dans une plage dynamique tels que les histogrammes signal entièrement chevauchent. Pour des exemples, voir la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Exemple de quatre échantillons d'ARN isolés à partir de tissus de tumeurs cérébrales humaines. L'ARN a été isolé en utilisant le protocole présenté en 3.1.1. La qualité des échantillons a été évaluée en utilisant le bioanalyseur 2100 sur une puce 6000 ARN tel que décrit au paragraphe 3.1.3. Les échantillons sont représentatifs de quatre qualités ARN distincts: A, de très bonne qualité d'ARN (RIN&gt; 9); B, partiellement dégradées ARN (RIN 5-6, noter le pic de nettement plus faible pour l'ARNr 28S); C, fortement dégradées ARN (RIN &lt; 3); D, presque complètement dégradé ARN (RIN = 2). Nous avons utilisé avec succès des échantillons avec des qualités similaires ou supérieures à B (RIN&gt; 5,2) pour les applications de biopuces en aval. Des pointes de flèches solides et ouverts indiquent la position de la 18S et 28S ARNr des espèces, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Exemples d'images de tableau et des diagrammes de dispersion. Un aperçu, faites glisser l'ensemble, montrant les quatre tableaux au format 4X44K Agilent; B, numérisation haute résolution de l'une des zones de tableau, noter que ni des signaux (vert ou rouge) est prédominante; C, diagramme de dispersion de l'image dans B, note que les signaux totalement le chevauchement et pas plus de 1x10 -6 fonctionnalités sont à l'intensité de saturation.

<ol><li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Decade+Later%3A+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types%2C+Brain+Function+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li>
<li>Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li>
</ol>

Profilage de l&#39;expression avec des puces à ADN offre une approche simple pour identifier les gènes différentiellement exprimés entre deux échantillons biologiques. Le succès des expériences de profilage d&#39;expression de haute qualité nécessitent des échantillons d&#39;ARN, l&#39;étiquetage robuste et d&#39;hybridation. Dans notre expérience, les tableaux et les kits commerciaux d&#39;Agilent étiquetage fournissent des données de haute qualité à un coût raisonnable. Bien Agilent propose également de leurs propres machines et l&#39;hybridation de numérisation, nous privilégions le système d&#39;hybridation de Roche-Nimblegen et le GenePix 4000B biopuces scanner de Molecular Devices. Notez que l&#39;unité d&#39;hybridation Roche-Nimblegen était anciennement connu sous le système d&#39;hybridation Maui. Après la récente acquisition d&#39;entreprise par Roche, les mélangeurs A4 ont été abandonnées. Dès l&#39;instant où j&#39;écris ces lignes, ils peuvent encore être trouvés par d&#39;autres vendeurs tels que Diagnostics Kreatech ( <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ; ce site propose également un outil pratique éventail de compatibilité), mais la disponibilité du stock à long terme est incertaine. Autres systèmes d&#39;hybridation sont disponibles (par exemple, d&#39;Agilent), mais si mélangeurs compatible peut être trouvé pour le tableau utilisé, nous recommandons le système de la Roche-NimbleGen pour sa qualité et de reproductibilité.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td>Inclut une station de amorçage de puce, un vortexeur, un logiciel et un ordinateur portable</td></tr><tr><td>Ensemble d'électrophorèse 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2947CA</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Inclut l'échelle de taille, le marqueur, la matrice de gel, le colorant, les nettoyants d'électrode, les filtres à centrifuger et les nanopuces</td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780M</td><td></td></tr><tr><td>Kit de marquage Quick Amp, deux couleurs</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-0444</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'hybridation pour expression génique</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-542</td><td>Inclut l'agent de blocage, le tampon de fragmentation et le tampon d'hybridation</td></tr><tr><td>Kit de tampon de lavage pour expression génique</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5327</td><td>Inclut les tampons de lavage 1 et 2 et le Triton X-102</td></tr><tr><td>Station d'hybridation</td><td>Roche Group</td><td>05223652001</td><td>Modèle à 4 lames</td></tr><tr><td>Kit d'accessoires pour système d'hybridation</td><td>Roche Group</td><td>05327695001</td><td>Contient un ensemble de vérification pour tester le mélange, des joints toriques de remplacement, un outil de démontage, une pince et un brayer</td></tr><tr><td>Chambres d'hybridation A4 avec mélangeur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microarray d'oligonucléotides pour génome humain entier (4x44)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4112F</td><td></td></tr><tr><td>Pipette à déplacement positif</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Pistons capillaires pour pipette à déplacement positif</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148415</td><td></td></tr><tr><td>Séchoir pour microarray</td><td>Nimblegen</td><td>05223636001</td><td></td></tr><tr><td>Scanner fluorescent pour microarray, Axon GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX4000B</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel GenePix Pro 6.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation array et balayage

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Profilage de l&#39;expression Microarray du système nerveux fournit une approche puissante pour identifier les activités de gènes dans différents stades de développement, les différents états physiologiques ou pathologiques, la réponse au traitement, et, en général, toute condition qui est testée expérimentalement, 1. Profilage de l&#39;expression des tissus neuronaux nécessite l&#39;isolement de l&#39;ARN de haute qualité, l&#39;amplification de l&#39;ARN isolé et l&#39;hybridation de puces à ADN. Dans cet article, nous décrivons les protocoles des expériences biopuces reproductibles à partir de tissus tumeur au cerveau 2. Nous allons commencer par réaliser une analyse de contrôle de qualité des échantillons d&#39;ARN isolés avec Agilent 2100 Bioanalyzer «lab-on-a-chip&quot; de la technologie. Haute qualité des échantillons d&#39;ARN sont essentiels pour la réussite de toute expérience microarray, et le bioanalyseur 2100 fournit un moyen rapide, mesure quantitative de la qualité de l&#39;échantillon. Les échantillons d&#39;ARN sont ensuite amplifiés et marqués en effectuant la transcription inverse pour obtenir l&#39;ADNc, suivi par transcription in vitro en présence de nucléotides marqués à produire étiquetés ARNc. En utilisant un kit de marquage bicolore, nous marquerons notre échantillon expérimental avec Cy3 et un échantillon de référence avec Cy5. Les deux échantillons seront ensuite combinées et hybridé à des tableaux d&#39;Agilent K 4x44. Double-couleurs des tableaux offrent l&#39;avantage d&#39;une comparaison directe entre deux échantillons d&#39;ARN, augmentant ainsi la précision des mesures, en particulier pour de petits changements dans les niveaux d&#39;expression, parce que les deux échantillons d&#39;ARN sont hybridés de manière compétitive aux puces une seule. Les tableaux seront analysés lors des deux longueurs d&#39;onde correspondant, et le ratio de Cy3 au Cy5 signal pour chaque fonctionnalité sera utilisée comme une mesure directe de l&#39;abondance relative de l&#39;ARNm correspondant. Cette analyse identifie des gènes qui sont différentiellement exprimés en réponse à des conditions expérimentales testées.

Nous démontrons l&#39;utilisation de puces à ADN pour le profilage de l&#39;expression du système nerveux. Nous décrivons le contrôle qualité de l&#39;ARN, l&#39;étiquetage de l&#39;échantillon, et l&#39;hybridation de tableau et de numérisation.

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Le profilage d'expression par puces à ADN du système nerveux constitue une approche puissante pour identifier les activités géniques aux différents stades du développement, ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une expérience de puces à ADN à l'aide d'un appareil mélangeur automatisé. Cela est réalisé en analysant d'abord la qualité des échantillons d'ARN à l'aide du bioanalyseur, après amplification et marquage de l'ARN. Les échantillons d'ARN sont hybridés aux puces à ADN.Enfin, les puces à ADN hybridées sont lavées et analysées par lecture. En définitive, les résultats obtenus montrent l'expression différentielle des transcrits d'ARN grâce à l'analyse d'images de puces à fluorescence double couleur. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'hybridation sur puces sont difficiles à apprendre en raison de l'utilisation d'équipements spécialisés.L'analyse de contrôle qualité commence par la préparation de l'instrument bioanalyzer 2, 100 et de la station de amorçage de la puce, comme indiqué dans la procédure écrite. La matrice de gel est ensuite filtrée en pipetant 550 microlitres dans un filtre centrifuge fourni avec le kit RNA 6,000 nano. La centrifugation s'effectue à 1 500 RCF pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, aliquoter le gel filtré en prélèvements de 65 microlitres, qui peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum. Vortexer le concentré de colorant pendant 10 secondes et ajouter un microlitre à un prélèvement de 65 microlitres. Après vortexage du mélange, centrifuger le gel filtré à 13 000 RCF pendant 10 minutes à température ambiante afin de courir les échantillons.Placez d'abord une puce sur la station d'amorçage. Dans cette démonstration, des puces RNA 6,000 nano sont utilisées. Chargez neuf microlitres du mélange de gélatine et de colorant dans le puits marqué d'un G blanc sur fond noir.Avec la pointe de pipette positionnée tout en bas du puits, placez le piston de la seringue à un millilitre et fermez la station de amorçage. Appuyez lentement mais régulièrement sur le piston jusqu'à ce qu'il soit maintenu par le clip.Après 30 secondes, relâchez le clip et laissez le piston remonter pendant quelques secondes. Une fois le piston arrêté, ramenez-le à la position d'un millilitre et ouvrez la station d'amorçage. Chargez neuf microlitres du colorant pour gel.Mélanger dans chacun des deux puits. Marquer G. Ensuite, déposer cinq microlitres du marqueur dans le puit témoin et dans chacun des 12 puits d'échantillons. Charger ensuite un microlitre du témoin dénaturé dans le puit témoin et un microlitre de chaque échantillon dénaturé dans les puits d'échantillons.Enfin, ajoutez un microlitre du marqueur dans chaque échantillon inutilisé. Une fois les puits chargés, vortexer la puce pendant une minute à 2 400 tr/min. Après avoir démarré le logiciel 2 100 expert, positionnez la puce et fermez le couvercle.Vérifiez que le bon port est sélectionné et exécutez le test dans les cinq minutes suivant le chargement des échantillons afin d'éviter l'évaporation. Les méthodes de réalisation de l'amplification et de l'étiquetage de l'ARN peuvent être consultées dans le protocole écrit. Une fois marqué, purifiez l'ARNc pour éliminer les nucléotides non incorporés. À l'aide de colonnettes miniatures Cogens, l'ARNc marqué peut ensuite être quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000.En mode de mesure par puces à ADN, enregistrez la concentration de l'échantillon, le rendement et l'activité spécifique. Pour l'hybridation sur puce à ADN, il est nécessaire d'obtenir un rendement d'au moins 825 nanogrammes et une activité spécifique d'au moins huit picomoles par microgramme au moins deux heures avant l'hybridation sur puce à ADN. Allumez la station d'hybridation et réglez-la à 65 degrés Celsius.Ce protocole décrit l'utilisation de puces Agilent quatre par 40 4K avec le système d'hybridation Roche nimble gen et une chambre de mélange quadruple après la fragmentation de l'ARNc réalisée comme décrite dans le protocole écrit, préparer la chambre d'hybridation. Placer une lame de puces dans l'outil d'assemblage et de désassemblage, côté code-barres. Ouvrir d'abord un mélangeur A et exposer l'adhésif maintenant la puce et l'outil d'assemblage et de désassemblage afin d'éviter tout déplacement.Placer le mélangeur A four sur la lame en partant de l'extrémité opposée. S'assurer qu'il est correctement aligné par rapport à l'outil et fixer le mélangeur le long de la matrice. Faire glisser à partir de l'extrémité du mélangeur pour retirer l'ensemble lame-mélangeur.À l’aide de l’outil de lissage, appuyez fermement tout le long du joint adhésif afin de garantir qu’il soit bien collé à la lame. De petites bulles d’air piégées entre l’adhésif et la lame peuvent être visibles sur fond sombre. Prenez le temps nécessaire pour éliminer ces bulles à l’aide de l’outil de lissage.Le réseau est désormais prêt à être chargé. Utilisez une pipette à déplacement positif pour charger 100 microlitres de l'échantillon d'hybridation. Insérez fermement la pointe à l'intérieur du hublot et délivrez lentement et régulièrement afin qu'aucun air ne soit piégé dans la zone du réseau.Lorsque l'échantillon recouvre entièrement la matrice et que le liquide commence à sortir rapidement par le port de ventilation, retirez uniquement le piston de la pipette. Une fois que l'embout est éloigné de la lame, tamponnez délicatement l'excès de liquide aux deux ports, en prenant soin de ne pas extraire l'échantillon de la chambre elle-même. Ensuite, couvrez les orifices avec des autocollants à l'aide de pinces.Placer la lame sur la station d'hybridation et vérifier que les trous des vessies sont correctement positionnés au-dessus des joints toriques. Cela garantira un mélange adéquat pendant l'hybridation. Fermer le couvercle de la lame et le couvercle de la station.Régler la station sur le mode de mélange B et hybrider la matrice à 65 degrés Celsius pendant 17 heures. Une fois terminé, remplir un plat en verre étiqueté A avec le tampon de lavage un ; le plat doit être suffisamment grand pour accueillir l'outil d'assemblage et de désassemblage, tout en permettant une certaine manœuvrabilité. Tous les lavages doivent être effectués dans du matériel en verre, car le plastique a tendance à libérer des composés, ce qui entraîne un fond élevé sur la matrice.Placer un porte-lame et une barre d'agitation dans une boîte de coloration. Intitulée B, remplir la boîte avec du tampon de lavage en quantité suffisante pour recouvrir le porte-lame, puis placer la boîte sur un agitateur magnétique à température ambiante. Ajouter également une barre d'agitation dans une boîte de coloration vide intitulée C et la placer sur un agitateur magnétique.Retirez la matrice du poste d'hybridation et placez-la dans l'outil de montage et démontage. Plongez l'ensemble dans la boîte tout en tenant l'outil de montage et démontage d'un côté et la lame de l'autre côté avec une seule main. Détachez soigneusement le mélangeur A quatre en prenant garde de ne pas rayer la zone de la matrice.Placez rapidement la lame sur le porte-lame et dans la cuve de coloration B. L'exposition à l'air doit être minimisée, car le colorant SCI five est sensible à l'ozone. Lavez l'effacement pendant une minute en agitant à vitesse moyenne. Remplissez la cuve de coloration C avec le tampon de lavage 2 préchauffé.Transférez les lames et rincez pendant une minute. Après le rinçage, retirez très lentement le porte-lames de la coupelle de coloration C afin de minimiser les gouttelettes restant sur la lame. Séchez la lame par centrifugation pendant deux minutes.Ensuite, placer la lame dans un tube conique de 50 millilitres et remplir immédiatement avec du gaz argon en effectuant une analyse à l’aide du scanner GenePix 4 000 B de Molecular Devices afin d’éviter la perte de signal observée. Voici des exemples de quatre échantillons d’ARN isolés à partir de cerveau humain. La qualité des échantillons de tissu tumoral a été évaluée à l’aide du Bioanalyzer 2 100 sur une puce RNA 6 000.Les flèches pleines et ouvertes indiquent respectivement la position des espèces d'ARN 18 S et 28 S. Le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) est une mesure quantitative de la qualité de l'ARN ; des échantillons d'ARN total de bonne qualité doivent produire uniquement deux pics majeurs lorsqu'ils sont analysés sur un bioanalyseur pour le contrôle qualité, correspondant aux deux principales espèces d'ARN ribosomiques.Une certaine dégradation de l'ARN apparaîtra sous forme d'une traînée avant le premier pic d'ARN ribosomique et d'un pic nettement plus bas pour l'ARN 28 S-R-R-N-A fortement dégradé. Un ARN de mauvaise qualité présentera un pic large ou une série de pics à de faibles temps de rétention. Dans ce cas, les deux pics d'ARN ribosomique seront d'une intensité très faible ou pas identifiables du tout.Des puces de bonne qualité doivent produire un signal élevé à des valeurs relativement faibles du PMT. On s'attend à ce que la plupart des transcrits soient présents à des niveaux similaires dans l'échantillon expérimental et l'échantillon de référence. Des changements massifs et généralisés de l'expression génique manqueront probablement de signification biologique.Par conséquent, la majeure partie de la matrice devrait apparaître en jaune plutôt qu'en vert ou en rouge. Les signaux de bonne qualité doivent également se situer dans une plage dynamique telle que les histogrammes de signal se superposent entièrement, comme observé sur le nuage de points de l'image de la matrice. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une expérience de puces à ADN en utilisant un appareil d'hybridation automatisé.

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