Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

L’objectif global de ces expériences est de cribler et de caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Les tests de diffusion et de libération de colorants sur microlames sont utiles pour la découverte fonctionnelle de nouveaux antimicrobiens ayant une activité lytique contre des cibles spécifiques telles qu’une bactérie pathogène d’intérêt. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’elles sont simples à exécuter, offrent une flexibilité pour la variation des paramètres expérimentaux et peuvent être réalisées avec des équipements de laboratoire que l’on trouve couramment dans la plupart des laboratoires de microbiologie.

Avant de commencer l’essai de diffusion sur microlames, la concentration de l’enzyme antimicrobienne à évaluer doit être déterminée à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA, conformément au protocole du fabricant. Effectuez une dilution en série de l’enzyme antimicrobienne, en utilisant le PBS comme tampon de réaction. Distribuez la protéine dans des tubes microfuges individuels et ajustez les volumes à 20 millilitres à l’aide de PBS.

Ensuite, préparez une solution d’agarose à 0,5 % en dissolvant 0,25 gramme d’agarose dans 50 millilitres de PBS. Faites bouillir cette solution jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Déterminez l’eau perdue pendant le processus de fusion en poids et ajoutez-la à la solution.

Pour inhiber la croissance bactérienne contaminante pendant l’incubation de l’essai, ajoutez 15 microlitres d’azoture de sodium à 10 % dans l’eau à la solution d’agarose et ajustez la température de la solution à 50 degrés Celsius dans un bain d’eau. Si des cellules viables sont utilisées comme substrat, omettez l’azoture de sodium de la solution d’agarose. Décongelez le substrat bactérien tué par la chaleur sur de la glace.

Remettre le substrat bactérien en suspension dans 12 millilitres de solution d’agarose pour correspondre approximativement à la turbidité d’un étalon de turbidité d’équivalence McFarland de 2,0. Comparez les turbidités des solutions en visualisant une ligne noire sur fond blanc à travers les solutions, en ajoutant un substrat bactérien à l’agarose jusqu’à ce que la turbidité approximative soit atteinte. Immédiatement mais soigneusement, piquez trois millilitres de la solution de substrat d’agarose sur chaque microlame, en vous assurant que la solution ne déborde pas de la microlame.

Une fois que les lames se sont solidifiées, utilisez une foreuse de liège de 4,8 millimètres de diamètre pour percer trois puits dans la couche de substrat d’agarose de chaque microlame. Ajoutez 20 microlitres de chaque dilution en série de protéines ajustée dans les puits respectifs. Utilisez bien l’albumine sérique bovine dans un puits de contrôle négatif.

En tant que contrôle positif, utilisez des enzymes bactériolytiques connues et appropriées pour le substrat, telles que le lysozyme. Incuber les lames dans une chambre d’humidité à 37 degrés Celsius, ou la température d’activité optimale de l’enzyme. La durée de l’incubation dépend de la concentration et de l’activité spécifique de l’enzyme antimicrobienne.

Un temps de réaction typique est d’environ 16 heures. Lorsque l’incubation est terminée, observez les lames sous la lumière indirecte et capturez des images de l’essai en développement. Utilisez un appareil photo reflex numérique mono-objectif avec un objectif de 60 millimètres à une distance focale d’environ 30 centimètres.

Dans le test de libération de colorant qui sera démontré dans le segment suivant, le substrat est lié de manière covalente au colorant Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Commencez ce protocole en créant une solution RBB de 200 milliMolaires. Dissoudre 1,25 gramme de RBB dans une solution d’hydroxyde de sodium fraîchement préparée.

Ensuite, remettez en suspension les cellules bactériennes tuées par la chaleur à une concentration de 0,5 gramme de poids humide dans 30 millilitres de solution RBB. Pour le peptidoglycane purifié, remettre le peptidoglycane en suspension à une concentration de 0,3 gramme de poids humide dans 30 millilitres de solution RBB. Étant donné que les étapes suivantes sont les mêmes, quel que soit le substrat utilisé, le marquage ne sera démontré que pour les cellules bactériennes.

Incuber le mélange réactionnel sur une plate-forme rotative pendant six heures à 37 degrés Celsius en mélangeant doucement. Après six heures, transférez le mélange réactionnel dans un incubateur à quatre degrés Celsius et incubez pendant 12 heures supplémentaires en mélangeant doucement. Lorsque l’incubation est terminée, récoltez le substrat teint par centrifugation à 3000 x g pendant 30 minutes.

Décantez la solution de colorant de la pastille de substrat. Remettre complètement le granulé en suspension dans de l’eau de type I suivi d’une centrifugation. Arrosez les cellules marquées au colorant trois à cinq fois de cette manière pour éliminer le colorant soluble non lié de manière covalente des substrats.

Pour les lavages finaux, transférez la portion de granulés qui sera utilisée dans le test de libération de colorant dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre. Le surnageant du dernier lavage doit être clair tandis que le substrat reste bleu. Conservez le substrat teint en suspension dans une quantité minimale d’eau à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Pour préparer l’essai de libération de colorant, laissez le substrat teint congelé revenir à température ambiante et lavez-le deux fois avec le tampon d’essai qui a été déterminé empiriquement pour l’enzyme. Le PBS est utilisé dans ce cas. Calculez le volume de suspension de substrat nécessaire en multipliant le volume de réaction de 200 microlitres par le nombre de tests de libération de colorant à effectuer.

Pour préparer la suspension du substrat, ajoutez d’abord le substrat teint au volume approprié de PBS. Faites une dilution un à un, et prenez une première mesure de la densité optique à 595 nanomètres, en utilisant le PBS comme blanc. Ajoutez des quantités incrémentielles du substrat teint à la suspension jusqu’à ce qu’une densité optique de 2,0 à 595 nanomètres soit atteinte.

Dans cette démonstration, le test de libération de colorant sera utilisé pour déterminer les conditions d’incubation optimales d’un antimicrobien protéique. Tout d’abord, préparez une suspension antimicrobienne de protéines mères en ajustant la concentration à un milligramme par millilitre à l’aide de PBS comme décrit dans le texte du protocole. Diluez ensuite la suspension antimicrobienne de protéine mère à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre.

Cette concentration donne une masse réactionnelle finale d’un microgramme de protéine par volume ajouté à la réaction de dosage. Effectuez les tests de réaction dans des tubes microfuges de 0,5 millilitre pour la plage thermique à évaluer. Pour chaque condition thermique, ajoutez 10 microlitres de protéine mère à 200 microlitres de suspension de substrat préparée.

Incuber dans un thermocycleur pendant huit heures avec mélange par inversion une fois par heure. Après l’incubation, arrêtez les réactions en ajoutant 25 microlitres d’éthanol dans chaque tube de microfuge. Pour éliminer le substrat insoluble non digéré, centrifuger à 3000 x g pendant deux minutes.

Après cela, tout en faisant attention de ne pas perturber la pastille de substrat non digéré, transférez 150 microlitres du surnageant de réaction pour chaque mélange réactionnel dans une microplaque à fond plat de 96 puits. Pour quantifier l’activité enzymatique, utilisez un spectrophotomètre de microplaques pour mesurer l’absorbance du surnageant à 595 nanomètres. L’augmentation de l’absorbance par le colorant soluble libéré dans le surnageant à partir du substrat marqué est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.

L’essai de diffusion sur microlames a été utilisé pour évaluer qualitativement l’activité d’une protéine antimicrobienne inconnue contre le substrat de cellules entières de Salmonella enterica tué par la chaleur. L’antimicrobien a été ajouté en quantités croissantes à partir des puits A à F, et le PBS a été utilisé pour les témoins négatifs. Après six heures, la taille de la zone claire d’hydrolyse qui s’est formée autour de chaque puits a été observée.

Une activité enzymatique élevée se rapporte qualitativement à une zone plus grande, tandis qu’une activité enzymatique faible se rapporte qualitativement à une zone plus petite. Le test quantitatif de libération de colorant a été utilisé pour déterminer la température de réaction optimale pour un antimicrobien protéique. Comme le montrent les quantités de couleur bleue dans les surnageants de réaction et les unités d’activité dérivées des mesures d’absorbance à 595 nanomètres, 35 degrés Celsius est la température optimale.

L’essai de libération de colorant a également été utilisé pour déterminer la plage d’activité d’une protéine antimicrobienne inconnue contre le substrat tué par la chaleur de Bacillus subtilis. Une comparaison avec la gamme d’activité de l’alpha-chymotrypsine a révélé que l’enzyme antimicrobienne inconnue a presque deux fois plus d’affinité pour le substrat. De plus, alors que l’activité de l’alpha-chymotrypsine commence à plafonner autour de 0,3 microgramme, l’activité de l’enzyme inconnue a continué à augmenter pour toutes les quantités d’enzymes.

Une fois maîtrisé, le test de diffusion de microlames peut être réalisé en 30 minutes. Le test de libération de colorant peut être terminé en une heure. Les temps d’incubation de chaque essai dépendent de l’activité enzymatique et de leurs concentrations.

En élargissant ces procédures, la méthode de libération du colorant peut être modifiée pour déterminer les influences chimiques affectant l’activité enzymatique de l’enzyme antimicrobienne en manipulant des aspects de la réaction tels que le pH tampon et la salinité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dépister et de caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes à l’aide des tests de diffusion et de libération de colorants sur microlames.