Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

L'objectif général de ces expériences est de cribler rapidement et de caractériser des enzymes pour leur activité antimicrobienne. Le test de diffusion en microplaque et le test de libération de colorant sont utiles pour la découverte fonctionnelle de nouveaux antimicrobiens présentant une activité lytique contre des cibles spécifiques, telles qu'une bactérie pathogène d'intérêt. Les principaux avantages de ces techniques sont leur simplicité d'exécution, la souplesse qu'elles offrent en matière de variation des paramètres expérimentaux, et le fait qu'elles peuvent être réalisées avec du matériel de laboratoire couramment disponible dans la plupart des laboratoires de microbiologie.

Avant de commencer le test de diffusion en microplaque, la concentration de l'enzyme antimicrobienne à évaluer doit être déterminée à l'aide d'un kit de dosage des protéines BCA, conformément au protocole du fabricant. Effectuez une dilution en série de l'enzyme antimicrobienne en utilisant le PBS comme tampon réactionnel. Distribuez la protéine dans des tubes microcentrifugeurs individuels et ajustez les volumes à 20 millilitres à l'aide du PBS.

Ensuite, préparez une solution d'agarose à 0,5 % en dissolvant 0,25 gramme d'agarose dans 50 millilitres de PBS. Chauffez cette solution jusqu'à ébullition jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute. Déterminez la quantité d'eau perdue pendant le processus de fusion par pesée et rajoutez-la à la solution.

Pour inhiber la croissance bactérienne indésirable pendant l'incubation du test, ajouter 15 microlitres de 10 % d'azoture de sodium dans l'eau à la solution d'agarose et régler la température de la solution à 50 degrés Celsius dans un bain-marie. Si des cellules viables sont utilisées comme substrat, omettre l'azoture de sodium dans la solution d'agarose. Décongeler le substrat bactérien inactivé par la chaleur sur de la glace.

Resuspendre le substrat bactérien dans 12 millilitres de la solution d'agarose afin d'obtenir une turbidité approximativement équivalente à celle d'un étalon de turbidité de 2,0 de McFarland. Comparer les turbidités des solutions en visualisant une ligne noire sur fond blanc à travers les solutions, et ajouter du substrat bactérien à l'agarose jusqu'à l'obtention de la turbidité souhaitée. Immédiatement mais soigneusement, prélever trois millilitres de la solution de substrat à l'agarose pour chaque micro-lame, en veillant à ce que la solution ne déborde pas de la micro-lame.

Une fois les lames solidifiées, utilisez un carottier de 4,8 millimètres de diamètre pour percer trois puits dans la couche de substrat d'agarose de chaque micro-lame. Ajoutez 20 microlitres de chaque dilution sérielle de protéine ajustée dans les puits respectifs. Utilisez de l'albumine de sérum bovin dans un puit témoin négatif.

En tant que contrôle positif, utilisez des enzymes bactériolytiques connues, appropriées pour le substrat, telles que la lysozyme. Incubez les lames dans une chambre humide à 37 degrés Celsius, ou à la température optimale d'activité de l'enzyme. La durée de l'incubation dépend de la concentration et de l'activité spécifique de l'enzyme antimicrobienne.

Un temps de réaction typique est d’environ 16 heures. Une fois l’incubation terminée, observer les lames à la lumière indirecte et capturer des images du test en cours de développement. Utiliser un appareil photo numérique reflex doté d’un objectif de 60 millimètres à une distance focale d’environ 30 centimètres.

Dans le test de libération de colorant décrit dans le prochain segment, le substrat est lié de façon covalente au colorant Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Commencez ce protocole en préparant une solution de RBB à 200 millimolaire. Dissolvez 1,25 gramme de RBB dans une solution fraîchement préparée d'hydroxyde de sodium.

Ensuite, resuspendre les cellules bactériennes tuées par la chaleur à une concentration de 0,5 gramme de poids humide dans 30 millilitres de solution RBB. Pour le peptidoglycane purifié, resuspendre le peptidoglycane à une concentration de 0,3 gramme de poids humide dans 30 millilitres de solution RBB. Étant donné que les étapes suivantes sont identiques, quelle que soit la nature du substrat utilisé, l'étiquetage sera illustré uniquement pour les cellules bactériennes.

Incuber le mélange réactionnel sur une plateforme rotative pendant six heures à 37 degrés Celsius avec un mélange doux. Après six heures, transférer le mélange réactionnel dans un incubateur à quatre degrés Celsius et incuber pendant 12 heures supplémentaires avec un mélange doux. Lorsque l'incubation est terminée, récupérer le substrat coloré par centrifugation à 3000 x g pendant 30 minutes.

Versez délicatement la solution de colorant à partir du culot de substrat. Resuspendez soigneusement le culot dans de l'eau de type I, puis centrifugez. Lavez les cellules marquées au colorant trois à cinq fois de cette manière afin d'éliminer le colorant soluble non lié de façon covalente des substrats.

Pour les lavages finaux, transférez la portion de culot qui sera utilisée dans le test de libération de colorant vers des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre. Le surnageant du dernier lavage doit être clair tandis que le substrat reste bleu. Conservez le substrat coloré suspendu dans une quantité minimale d'eau à 20 degrés Celsius jusqu'à son utilisation.

Pour préparer le test de libération de colorant, laissez le substrat coloré congelé revenir à température ambiante et lavez-le deux fois avec le tampon de dosage qui a été déterminé empiriquement pour l'enzyme. Dans ce cas, on utilise du PBS. Calculez le volume de la suspension de substrat nécessaire en multipliant le volume de réaction de 200 microlitres par le nombre de tests de libération de colorant à effectuer.

Pour préparer la suspension de substrat, ajoutez d'abord le substrat coloré au volume approprié de PBS. Effectuez une dilution au demi, puis effectuez une mesure initiale de la densité optique à 595 nanomètres, en utilisant le PBS comme témoin. Ajoutez progressivement des quantités croissantes de substrat coloré à la suspension jusqu'à atteindre une densité optique de 2,0 à 595 nanomètres.

Dans cette démonstration, le test de libération de colorant sera utilisé pour déterminer les conditions d'incubation optimales pour un antimicrobien protéique. Préparez d'abord une suspension mère d'antimicrobien protéique en ajustant la concentration à un milligramme par millilitre à l'aide de PBS, comme décrit dans le texte du protocole. Ensuite, diluez la suspension mère d'antimicrobien protéique à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre.

Cette concentration donne une masse réactionnelle finale d'un microgramme de protéine par volume ajouté à la réaction de dosage. Réalisez les dosages réactionnels dans des tubes microcentrifugeurs de 0,5 millilitre pour la gamme thermique à évaluer. Pour chaque condition thermique, ajoutez 10 microlitres de la solution stock de protéine à 200 microlitres de la suspension de substrat préparée.

Incuber dans un thermocycleur pendant huit heures en mélangeant par retournement une fois par heure. À la fin de l'incubation, arrêter les réactions en ajoutant 25 microlitres d'éthanol à chaque tube microcentrifuge. Pour éliminer le substrat insoluble non digéré, centrifuger à 3000 x g pendant deux minutes.

Ensuite, tout en prenant soin de ne pas perturber le culot de substrat non digéré, transférer 150 microlitres du surnageant de réaction de chaque mélange réactionnel dans une microplaque de 96 puits à fond plat. Pour quantifier l'activité enzymatique, utiliser un spectrophotomètre pour microplaque afin de mesurer l'absorbance du surnageant à 595 nanomètres. L'augmentation de l'absorbance due au colorant soluble libéré dans le surnageant à partir du substrat marqué constitue une mesure quantitative de l'activité enzymatique.

Le test de diffusion en microplaque a été utilisé pour évaluer de manière qualitative l'activité d'une protéine antimicrobienne inconnue contre un substrat entier de cellules inactivées par la chaleur de Salmonella enterica. L'agent antimicrobien a été ajouté en quantités croissantes depuis les puits A jusqu'aux puits F, et le PBS a été utilisé comme témoins négatifs. Après six heures, la taille de la zone claire d'hydrolyse formée autour de chaque puit a été observée.

Une activité enzymatique élevée est qualitativement associée à une zone plus grande, tandis qu'une activité enzymatique faible est qualitativement associée à une zone plus petite. Le dosage quantitatif de libération de colorant a été utilisé pour déterminer la température de réaction optimale d'un antimicrobien protéique. Comme on peut le voir d'après les quantités de couleur bleue présentes dans les surnageants de la réaction et les unités d'activité dérivées des mesures d'absorbance à 595 nanomètres, 35 degrés Celsius est la température optimale.

Le test de libération de colorant a également été utilisé pour déterminer le domaine d'activité d'une protéine antimicrobienne inconnue dirigée contre un substrat de Bacillus subtilis inactivé par la chaleur. Une comparaison avec le domaine d'activité de l'alpha-chymotrypsine a révélé que l'enzyme antimicrobienne inconnue possède une affinité pour le substrat presque deux fois supérieure. De plus, tandis que l'activité de l'alpha-chymotrypsine commence à se stabiliser aux alentours de 0,3 microgrammes, l'activité de l'enzyme inconnue continue d'augmenter à toutes les concentrations enzymatiques testées.

Une fois maîtrisée, l'analyse par diffusion en microplaque peut être réalisée en moins de 30 minutes. L'analyse de libération de colorant peut être effectuée en moins d'une heure. Les temps d'incubation pour chaque analyse dépendront de l'activité enzymatique et des concentrations utilisées.

En s'appuyant sur ces procédures, la méthode de libération de colorant peut être modifiée pour déterminer les influences chimiques affectant l'activité enzymatique de l'enzyme antimicrobienne en modifiant certains paramètres de la réaction, tels que le pH du tampon et la salinité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cribler rapidement et de caractériser des enzymes pour leur activité antimicrobienne à l'aide des tests de diffusion sur microplaque et de libération de colorant.