Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

L’objectif global de cette procédure est de créer des microréseaux de biomembranes à l’aide d’une méthode de préparation simple. Ceci est accompli en recouvrant d’abord les billes de silice avec des membranes bicouches lipidiques. La deuxième étape de la procédure consiste à déposer les billes recouvertes de lipides sur le substrat de silicone à micropuits.

La troisième étape consiste à retirer les billes qui ne se trouvent pas dans les micro-puits, à l’aide d’une raclette en polyméthyl suboxane. La dernière étape consiste à imager les réseaux de billes recouvertes de lipides par microscopie à fluorescence. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour déterminer les constantes de liaison pour les interactions lipidiques des toxines à l’aide d’une approche d’imagerie en réseau.

Cette méthode peut être utilisée pour créer des réseaux de bicouches lipidiques à support sphérique et de particules membranaires naturelles dérivées de cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’en dehors de la fabrication des micropuits, la technique ne nécessite aucune modification chimique du substrat ou des membranes lipidiques pour créer des réseaux de biomembranes spatialement définis. Les applications de cette technique peuvent être étendues à la détection sans marquage des interactions entre les protéines lipidiques à l’aide du plasma de surface et de la résonance basée sur des réseaux de trous métalliques nanométriques.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des interactions entre les protéines lipidiques, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les études de l’adhésion focale cellulaire, les réseaux de micro-puits et les préparations de raclettes sont détaillées dans le protocole de texte. Cette vidéo commence par la préparation des vésicules. D’abord dans un petit flacon en verre, les lipides constitutifs des vésicules.

Un total d’un demi-milligramme de lipides se trouve dans cette solution sous vide, desséchez le mélange pendant six heures. Ensuite, préparez une solution de chlorure de sodium à 0,1 molaire et ajoutez un demi-millilitre aux lipides séchés. Laissez le mélange incuber toute la nuit à température ambiante.

Le lendemain, faites tourbillonner le mélange pour suspendre les vésicules. Ensuite, sonicez le mélange pendant 20 minutes dans un bain, sonicate à température ambiante. Après la sonication, extrudez la suspension à travers un filtre à membrane en polycarbonate de 100 nanomètres.

Passez la suspension à travers le filtre d’extrusion un total de 17 fois. Conservez ensuite les vésicules extrudées dans un flacon en verre à quatre degrés Celsius. D’abord en utilisant des billes de dioxyde de silicium de 700 nanomètres de diamètre.

Faire une suspension de 15 milliards de billes dans du chlorure de sodium de 0,1 molaire. Vortex la suspension, puis centrifugez-la à 1700 Gs pendant 20 minutes et jetez le surnageant. Répétez le lavage par réusure, en suspendant les billes dans un autre millilitre de solution saline et en les faisant tourner pendant encore 20 minutes.

Répétez ensuite le processus une troisième fois pour former les bicouches lipidiques à support sphérique ou SSB. Mélangez 25 microlitres de suspension de billes de dioxyde de silicium avec 200 microlitres de la suspension vésiculaire de la section précédente. Vortex le mélange et allumez-le, incubez à température ambiante pendant une heure plus tard, centrifugez le mélange à 1700 Gs pendant 20 minutes.

Jetez le surnageant. La pastille est rose jusqu’aux vésicules rompues avec rangée DPPE sur les billes. Mettez-le en suspension dans 225 microlitres de PBS à PH 7,4.

Répétez deux fois les étapes de rotation et de suspension de Resus pour retirer les vésicules non rompues et terminer la création des BLU. Divisez les plaquettes de réseaux de micro-puits en morceaux rectangulaires de quatre à six réseaux chacun. Ensuite, vortex, la suspension SSLB de la section précédente et transfère 10 microlitres à chaque réseau de micro-puits.

Attendez une heure que les boissons sucrées se stabilisent plus tard. Lavez délicatement les puces de la matrice avec du PBS et immergez-la dans le PBS à l’aide de la raclette qui glisse cinq fois sur la surface des puces immergées. Cela élimine les SLP qui ne sont pas à l’intérieur des micro-puits.

Ensuite, saisissez chaque puce de matrice avec une pince à épiler et secouez doucement le PBS. Transférez-le ensuite dans un bain PBS frais. Les surfaces supérieures des copeaux doivent rester humides.

Retirez un éclat du bain et retirez-le. La plupart du PBS avec une lingette de laboratoire. Laissez suffisamment de PBS pour garder le réseau hydraté.

Ajoutez maintenant 200 microlitres de solution BSA au réseau pour bloquer la liaison non spécifique. Laissez le réseau incuber pendant une heure. Dans une boîte humidifiée plus tard, retirez le BSA à l’aide d’une micro-pipette et ajoutez 200 microlitres de solution de toxine cholérique.

Remettez ensuite le réseau dans la chambre humidifiée. Attendez encore une heure, puis lavez le réseau avec du PBS et évacuez l’excès de PBS avec un chiffon sur le genou. Placez ensuite la puce du réseau sur une lame de microscopie standard et fixez une lamelle carrée de 24 x 40 millimètres au réseau et procédez à l’imagerie.

L’analyse d’image peut être effectuée à l’aide de l’image J.Fonctions d’analyse de particules automatisées. Ensuite, pour chaque tableau, résumez les intensités moyennes des BLU individuelles sous forme d’histogrammes. Après avoir utilisé les méthodes décrites, une zone carrée de 100 microns sur un réseau montre 936 BLU.

Les données d’occupation ont été calculées et un histogramme des intensités fluorescentes SSLB a été généré après une semaine de stockage. Le même réseau a été réanalysé de la même manière, et il n’y a eu aucun changement dans les intensités fluorescentes ou l’occupation du réseau. Le dépôt séquentiel de différentes BLU avec différents marqueurs d’identification a également été possible avec les méthodes décrites.

Les deuxièmes BSN ont été déposées à un 10e. La concentration des premières BLU déposées. Une superposition des deux marqueurs est montrée pour une expérience.

Des réseaux ont été fabriqués avec des BSR avec diverses concentrations de GM un et exposés à une concentration fixe de toxine cholérique. L’inverse a également été effectué pour déterminer la constante de dissociation à l’équilibre. Pour GM un.

Les réseaux de liaison à la toxine cholérique peuvent également être fabriqués à partir de biomembranes naturelles, comme ce réseau composé de particules de myéline. Il est marqué avec du fluoro lipophile quatre FM 1 43. Les radeaux lipidiques sont enrichis en cholestérol et en gangliosides tels que le GM

Ainsi, la toxine cholérique conjuguée Alexa 4 88 se lie fortement aux microréseaux de radeaux lipidiques en revanche, Aden dénudé marqué par fluorescence ne se lie pas à ces réseaux. Un réseau a été réalisé en délivrant des radeaux de myéline et de lipides aux micro-puits via une puce microfluidique avec des canaux de 250 microns. Il a été marqué avec des IgM anti-oligodendrocytes et le sulfure S présent dans la myéline a été marqué, mais les radeaux lipidiques ne l’ont pas été.

Pas une fois que les billes enrobées de lipides sont préparées. Cette technique peut être utilisée pour préparer des réseaux en une heure si elle est effectuée correctement, après la création de réseaux de particules à membrane naturelle. D’autres méthodes, telles que le plasma de surface à nano-trous et la résonance, peuvent être utilisées pour la détection sans marquage des interactions biomoléculaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des réseaux de biomembranes à l’aide de billes recouvertes de couche biliaire lipidique et de particules de membrane naturelles.