Name: Protocoles pour la mise en œuvre dun Escherichia coli Sur la base du système dexpression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Découvrez la mise en œuvre du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL basé sur Escherichia coli pour la biologie synthétique. Cette méthode permet de synthétiser des protéines in vitro et d'accélérer le prototypage des circuits génétiques.

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Nous remercions Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, et Enoch Yeung à l&#39;aide de rationaliser le protocole, et Clare Chen et Lee Barclay pour l&#39;assistance dans les premiers stades du projet. Ce matériau est basé sur les travaux pris en charge en partie par l&#39;Agence pour les projets de recherche avancée de défense (DARPA / MTO) programme Living Fonderies, numéro de contrat HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS est également soutenue par un scientifique médical UCLA / Caltech bourse du programme de formation et par un DoD, la Force aérienne Bureau de la recherche scientifique, des sciences de la Défense nationale et études supérieures en génie (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Les points de vue et les conclusions contenues dans ce document sont celles des auteurs et ne doit pas être interprété comme représentant officiellement politiques, que ce soit expressément ou implicitement, de l&#39;Advanced Research Projects Agency Défense ou le gouvernement des États-Unis.

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<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La base de Escherichia coli endogène TX-TL système d&#39;expression acellulaire décrit ici est une réaction facile à terme de trois tube qui peut prendre moins de huit heures de mise en place pour la collecte des données. Le processus de création tous les réactifs nécessite cinq temps total de «jours (avec les exigences de travail importantes sur un seul jour), mais produit extrait brut pour 3000 et les réactions tampon fabrication des réactifs pour 10 000 réactions (figure 1). En outre, l&#39;extrait brut et tampon de décision réactifs sont stables pendant au moins 1 an à -80 ° C, ce qui permet des utilisations multiples d&#39;une préparation 4. Lors de 0,11 $ par 10 réaction de pi ($ 0,26 y compris le travail), les coûts sont de 98% inférieurs à ceux comparable systèmes commerciaux (Figure 2). Il existe certaines limitations non résolus, cependant, dans le système. L&#39;efficacité de chaque préparation d&#39;extrait cellulaire brut final peut varier en fonction du mode d&#39;aptitude et des conditions environnementales, bien que typical variation du rendement est compris entre 5 à 10% (figure 4b). Par conséquent, la variabilité lot à lot à la fois dans l&#39;expression du point final et dans la dynamique d&#39;expression sont à prévoir. Ces variations devraient rester jusqu&#39;à ce que l&#39;extrait est entièrement caractérisée ou jusqu&#39;à ce que la création d&#39;extrait est entièrement automatisé. Si le système d&#39;expression acellulaire est utilisé pour mener des expériences quantitatives sensibles, il est recommandé d&#39;effectuer toutes les expériences avec le même lot d&#39;extrait cellulaire brut. Le rendement d&#39;un seul lot d&#39;extrait cellulaire brut, environ 3000 réactions, devrait être suffisant pour les cours expérimentaux typiques. Bien que nous soupçonnons variation peut être éliminé par l&#39;intensification et l&#39;automatisation de la procédure, de telles tentatives impliquerait un investissement substantiel de ressources. En outre, bien que les niveaux de point final expression sont relativement faciles à déterminer, encore du travail à faire pour comprendre la dynamique intrinsèque au système acellulaire. Il est connu que les deux CONCURRENC des ressourcesn et ressources limitation peut affecter la dynamique d&#39;expression. Par exemple, Sigma endogène limité 70 peut se traduire par un régime de saturation avec augmentation de la production de matrice d&#39;ADN d&#39;un profil d&#39;expression analogue à celle de nucléotides ou d&#39;acides aminés épuisement. 9,27 Toutefois, la dynamique n&#39;ont pas à être entièrement comprise à utiliser le système. Pour les augmentations pures de rendement, l&#39;optimisation peut se faire par des approches d&#39;apprentissage automatique. 28 Questions de compétition pour les ressources et la limitation peuvent être traitées par des modèles mathématiques vérifiée à l&#39;aide des données expérimentales. Le protocole présenté ici est optimisé pour une souche BL21-Rosetta2, mais est généralisable à d&#39;autres E. souches de E. coli. Des modifications dans BL21-Rosetta2, telles que la suppression du gène codant pour la protéase lon et l&#39;addition de gènes codant pour des ARNt rares, permettent une production maximale de protéine. Nous avons essayé le protocole avec deux autres souches d&#39;extraction - BL21 seulement et un BL21 trxA KO-und trouvé le rendement en protéines de 50% de moins. Nous émettons l&#39;hypothèse que les rendements diminuent de même lors de l&#39;utilisation d&#39;autres souches. D&#39;autres changements dans les paramètres, tels que la commutation du milieu de croissance LB et 2xYT pour d&#39;autres bouillons riches, ont donné lieu à une diminution du rendement en protéines. Systèmes d&#39;expression sans cellules utilisant à la fois des machines de transcription-traduction endogène et exogène et les mécanismes de régulation ont de larges applications dans les protéines et l&#39;expression de métabolite et de la biologie synthétique. 3,29 lieu d&#39;être limité à des circuits de T7-réglementé, on peut envisager de réaliser des biomolécules complexes dans un environnement contrôlable par l&#39;utilisateur en utilisant un mélange de natif E. promoteurs coli et les mécanismes de transcription et de régulation exogène fournis. Sans limitation de la division cellulaire et du métabolisme, de la variabilité dans les circuits de synthèse tels que la repressilator ou en ingénierie des voies métaboliques telles que celles artémisinine production peut être réduit ou mieux comprise. 30,31 Nous VHAe utilisé ces avantages à mettre en œuvre des commutateurs génétiques, ainsi que de comprendre facteur sigma séquestration 9,32 Cette technologie peut également former l&#39;épine dorsale de «minime» ou cellules &quot;artificielles&quot; -. petite, bien caractérisé et les unités incorporées autonomes de extrait. 33,34 En fin de compte, nous nous attendons à des usages immédiats de ce système d&#39;expression acellulaire endogène comme un environnement de prototypage pour la biologie synthétique. Surnommée la &quot;planche à pain biomoléculaire TX-TL,&quot; le système d&#39;expression acellulaire fournit un environnement contrôlable où les circuits de synthèse en fin de compte destinés à l&#39;expression in vivo peut subir tours de prototypage - cycles d&#39;essais sur le plasmide de base, linéaire, ou d&#39;ADN synthétisé chimiquement, puis par l&#39;analyse et la modification rapide. Tours de prototypage peuvent être aidés par des modèles mathématiques prédictifs en cours de développement. En supprimant le clonage et des manipulations in vivo pour les circuits non-finales, nous prévoyons ingénieurstemps de cycle de nierie à être réduits à 1-3 jours au lieu de la norme de la semaine en cours.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Technologie d&#39;expression acellulaire a commencé dans les années 1950 comme purement translationnelle, avançant ans plus tard pour englober des mécanismes de transcription-traduction couplées en utilisant l&#39;ADN du bactériophage T7. 11,12 Depuis lors, de nombreux efforts ont été faits pour optimiser la création de l&#39;extrait cellulaire brut (ou E . extrait coli S30). 13,14 Ces optimisations incluent prolonger la synthèse des protéines sans cellule grâce à la régénération de l&#39;ATP ou modifications de contrainte, et la réduction du temps de protocole et de coût. 15-17 Autres systèmes d&#39;expression sans cellules existent qui utilisent reconstitué composants en lieu et place de brut extrait de cellules pour l&#39;expression. Tant 5 extrait cellulaire brut et des procédés de reconstitution ont été développés pour une utilisation commerciale. Avec l&#39;avènement de la biologie synthétique, il ya un besoin accru pour une plate-forme bien caractérisé de tester et d&#39;exprimer modules et circuits biologiques fabriqués. 18,19 Cette plate-forme doit êtrepolyvalent, bien caractérisé, simple à manipuler, et mis l&#39;accent sur les éléments fournis par l&#39;utilisateur. En dépit d&#39;être mis au point d&#39;un demi-siècle plus tôt, les systèmes exempts de cellules basées sur E. coli part intrinsèquement à ces exigences, car elles sont une représentation simplifiée en vitro de processus cellulaires, sans la complexité de la croissance et du métabolisme. En outre, toutes les connaissances de base de travail en vivo sur E. coli s&#39;applique facilement à E. systèmes sans cellules coli. Bien que les systèmes d&#39;expression sans cellules peuvent avoir des applications dans la biologie synthétique, à ce jour, l&#39;objectif de la plupart des systèmes d&#39;expression sans cellule a été la maximisation de la protéine et le rendement de métabolite. Ceci est accompli en utilisant le bactériophage T7 transcription de séquences commandés par des promoteurs T7. Bien que 20 l&#39;expression est efficace et robuste, ces systèmes ont un but hautement spécialisé. méthodes de régulation cellulaire sont limitées, des modèles d&#39;ADN cibles doivent êtrerepensées pour inclure des promoteurs T7, et certaines séquences telles que les complexes ribosomiques ne peuvent être transcrites et assemblées. 21,22 systèmes d&#39;expression sans cellules existantes sont incapables de maintenir des rendements élevés tout en conservant les mécanismes de régulation endogènes, une polyvalence nécessaire pour la biologie synthétique. Nous avons développé un E. endogène coli système d&#39;expression acellulaire qui préserve l&#39;efficacité de l&#39;expression de la protéine démontré par les systèmes précédents, mais ajoute à la polyvalence supplémentaire en permettant l&#39;expression et la réglementation fondée sur deux (T7 ou autres) des mécanismes endogènes et exogènes. Le protocole décrit ici est à l&#39;origine basé sur Kigawa et al. (2004) et Liu et al. (2005), mais a des modifications importantes. Il utilise Mg et K-glutamate sur Mg et K-acétate pour une efficacité accrue, élimine le 2-mercaptoéthanol, et lyse des cellules à l&#39;aide d&#39;un cordon-batteur. 17,23,24 Bead-coups est choisi sur l&#39;homogénéisation,procédés basés sur la pression, ou sonication en raison de son faible coût et des rendements comparables aux systèmes concurrents. 23 l&#39;acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) est utilisé comme source d&#39;énergie comme il a été constaté pour donner des rendements en protéines supérieure par rapport à la créatine phosphate et phosphoénolpyruvate. 4,25 Notre système peut produire jusqu&#39;à 0,75 mg / ml de protéine rapporteur utilisant un promoteur à base sigma70-avec les opérateurs de lambda-phage ou un promoteur T7-entraîné, rendement similaire à ceux d&#39;autres systèmes commerciaux. 4,6 Cinq jours sont nécessaires pour produire tous les réactifs nécessaires (figure 1). En outre, il permet une réduction des coûts de 98% par rapport aux systèmes sans cellules commerciales comparables - les coûts matériels sont de 0,11 $ par 10 réaction de pi, qui s&#39;élève à 0,26 $ et le travail inclus (Figure 2).

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>² ;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bacto-gélose</td><td>BD Diagnostics</td><td>214010</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes à billes (microflacons en polypropylène)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Perles, 0,1 mm de diamètre.</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli souche</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>²</td></tr><tr><td>Bradford BSA Kit de dosage des protéines</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>° ;</td></tr><tr><td>Cuvettes, 1.5ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>TNT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>°</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mg-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Micro Bio-Rad</td><td></td><td>732-6204</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>° ;</td></tr><tr><td>Nunc 384 plaques de fond optiques</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité Nunc</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium solution monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>ARNt (provenant de E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>² ;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouteille de centrifugeuse 1L</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Ceci est spécifique pour la série Avanti J ; obtenez une taille équivalente pour la centrifugeuse en cours d’utilisation.</td></tr><tr><td>Erlenmeyer 4L Flasque</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>Ou l’équivalent d’une centrifugeuse capable de 1L.</td></tr><tr><td>Forma 480 Agitateur orbital</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>Ou équivalent à un shaker 6x4L de la taille d’une poitrine.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>ou 1L-capable, équivalent rotor 5000 x g pour centrifugeuse.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">Matériel supplémentaire 1. Recettes pour Items. 
Chloramphénicol, 34 mg/ml : Préparez 0,51 g de chloramphénicol et ajoutez de l’éthanol à 15 ml. Stérilisation par filtre (0,22 &mu ; M), aliquote sur des tubes de 1 ml, conserver à -20 &deg ; C pour une utilisation ultérieure. 
2xYT+P+Cm gélose : Préparez 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de solution dibasique de phosphate de potassium @ 1 M, 0,88 ml de solution monobasique de phosphate de potassium @ 1 M, 0,6 g de gélose et de l’eau à 40 ml. Laisser refroidir à 50 &deg ; C et ajouter 40 &mu ; l Cm. Aliquote 25 ml dans une boîte de Pétri de 100x15 mm, et laisser refroidir pendant une heure. 
2xYT+P milieu : Préparez 124 g de solution dibasique de phosphate de potassium 2xYT, 160 ml de phosphate de potassium dibasique @ 1 M, 88 ml de solution monobasique de phosphate de potassium @ 1 M et de l’eau à 4 L. Aliquote en 2 x 1,88 L et 0,24 L. Autoclave. 
base Tris, 2 M : Préparez 60,57 g de base Tris et arrosez à 250 ml. Stériliser, conserver chez RT pour une utilisation ultérieure. 
DTT, 1 M : Préparez 2,31 g de DTT et arrosez à 15 ml. Stérilisation par filtre (0,22 &mu ; M), aliquote sur des tubes de 1 ml, conserver à -20 &deg ; C pour une utilisation ultérieure. 
Tampon S30A : Préparez 10,88 g de Mg-glutamate et 24,39 g de K-glutamate, 50 ml de Tris à 2M, d’acide acétique (à pH 7,7) et d’eau à 2 L. Autoclave, conserver à 4 &deg ; C, ajouter 4 ml 1 M de DTT avant utilisation. 
Tampon S30B : Préparez 10,88 g de Mg-glutamate et 24,39 g de K-glutamate, Tris à 2 M (à pH 8,2), et de l’eau à 2 L. Autoclave, conserver à 4 &deg ; C, ajouter 2 ml 1 M de DTT avant utilisation. 
HEPES : Préparez 1,91 g de HEPES (MW 238.21), de KOH (à pH 8) et de l’eau à 4 ml 
ARNt : Préparez 30 mg d’ARNt et de l’eau à 600 &mu ;l. 
CoA : Préparez 30 mg de CoA (MW 767.53) et de l’eau à 600 &mu ;l. 
NAD : Ajouter 34,83 mg de NAD (MW 663,43), Tris à 2 M (à pH 7,5-8) et de l’eau à 300 &mu ;l. (Ajouter 27 &mu ;l. l de Tris à 2 M pour amener la solution à pH 7,5-8). 
AMPc : Ajouter 42,80 mg de cAMP (MW 329,22), Tris à 2 M (jusqu’à pH 8) et de l’eau à 200 &mu ;l. (Ajouter 73 &mu ; l de Tris à 2 M pour amener la solution à pH 8). 
Acide folinique (33,9 mM) : À 20 mg de sel de calcium d’acide folinique solide (MW 511.5), ajoutez 1,15 ml d’eau. 
Spermidine : Préparer 23.55 &mu ; l de spermidine (MW 145,25) et d’eau à 150 &mu ;l. Préparer à température ambiante après avoir fondu brièvement à 37 °C 
3-PGA : Ajouter 1,03 g de 3-PGA (MW 230.02), de Tris à 2 M (jusqu’à pH 7,5) et d’eau à 3,2 ml. (Ajouter 1,73 ml de Tris à 2 M pour amener la solution à pH 7,5). 
mélange de nucléotides : Ajouter 145 mg de sel dipotassique ATP dihydraté (MW 619.4), 133 mg de sel disodique GTP (MW 567.14), 79,4 mg de sel disodique CTP dihydraté (MW 563.16), 82,6 mg de sel trisodique UTP dihydraté (MW 586.12), KOH à 15 % de dilution (à pH 7,5) et de l’eau à 1,5 ml. (Ajouter 353 &mu ; l de KOH à 15 % de dilution pour amener la solution à pH 7,5). 
Matériel supplémentaire 2. Bradford Assay.
<ol>
	<li>Supprimer l’agent Bradford de 4 &deg ; C et réglé à température ambiante.</li>
	<li>Préparez 50 &mu ; l BSA standard à 1 mg/ml et à 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Préparez 40 &mu ; l Dilution 20x de l’extrait à partir de l’étape 1.47.</Li>
	<li>Add 800 &mu ; l eau à 7 cuvettes. </li>
	<li>Préparez des cuvettes étalons pour 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu ; l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu ; l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu ; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu ; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>Préparer des cuvettes expérimentales pour 2 &mu ; l de l’échantillon et 4 &mu ; l de l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter 200 &mu ; l d’agent Bradford dans chaque cuvette et bien mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Produisez une courbe standard à OD 595nm à l’aide des cuvettes de l’étape 6.5. Rejeter la courbe standard si r2 < 0.95.</li>
	<li> Déterminez la concentration de l’extrait à OD 595nm à l’aide des cuvettes de tep 6.6.</li>
</OL>
Matériel supplémentaire 3. Feuille de calcul d’étalonnage de la mémoire tampon. 
<a href="http ://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx » target="_blank"> Voir TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
Matériel supplémentaire 4. Expression sans cellule exécuter spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx » target="_blank">Voir TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

protocoles pour la mise en œuvre d'un escherichia coli sur la base du système d'expression cellulaire gratuit tx-tl pour la biologie synthétique

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Systèmes d&#39;expression sans cellules idéales peuvent théoriquement émuler un environnement cellulaire in vivo dans un contrôle dans la plate-forme vitro. 1 Ceci est utile pour exprimer des protéines et des circuits génétiques d&#39;une manière contrôlée, ainsi que pour fournir un environnement de prototypage pour la biologie synthétique. 2,3 Pour atteindre ce dernier objectif, les systèmes d&#39;expression sans cellules qui préservent les mécanismes de transcription-traduction endogène Escherichia coli sont capables de refléter plus fidèlement la dynamique cellulaire in vivo que ceux basés sur l&#39;ARN polymérase T7 transcription. Nous décrivons la préparation et l&#39;exécution d&#39;un endogène E. efficace transcription-traduction basée coli (TX-TL) système d&#39;expression acellulaire qui peut produire des quantités équivalentes de protéines comme des systèmes à base de T7 à une réduction de coût de 98% pour les systèmes commerciaux similaires. 4,5 La préparation des tampons et extrait cellulaire brut sont décrit, ainsi que l&#39;exécution d&#39;untrois tube, de réaction TX-TL. Le protocole complet dure cinq jours pour préparer et donne suffisamment de matière pour un maximum de 3000 réactions simples dans une préparation. Une fois préparé, chaque réaction a moins de 8 heures de configuration à la collecte et l&#39;analyse des données. Mécanismes de régulation et de transcription exogène à E. coli, telles que des répresseurs lac / tet et la T7 ARN polymerase, peut être complétée. six propriétés endogènes, telles que l&#39;ARNm et les taux de dégradation de l&#39;ADN, peut également être ajustée. 7 Le système d&#39;expression acellulaire TX-TL a été démontré pour de gros ensemble à l&#39;échelle du circuit, explorer des phénomènes biologiques, et l&#39;expression de protéines dans les deux promoteurs T7 et endogènes. 6,8 modèles mathématiques d&#39;accompagnement sont disponibles. 9,10 Le système résultant a des applications uniques dans la biologie synthétique comme un environnement de prototypage, ou «TX- TL biomoléculaire maquette. &quot;

Nous avons présenté un protocole de cinq jours pour la préparation d'un Escherichia coli endogène fondé TX-TL système d'expression acellulaire. Un calendrier de l'échantillon pour créer les réactifs - extrait cellulaire brut et tampons - peut être trouvé dans la figure 1. Une fois créés, ceux-ci peuvent être stockés à -80 ° C pendant jusqu'à un an. Après réactifs sont créés, expérimental et l'exécution peut être fait en moins de 8 heures. En outre, nous avons optimisé les conditions d'expression du système d'expression acellulaire TX-TL. Autres ajouts fournies par l'utilisateur, tels que des tampons ou des solutions d'ADN, doivent être calibrés pour la toxicité au préalable. Par exemple, les différentes méthodes de transformation conduisent à des plasmides d'expression différents en raison de la teneur en sel. Nous avons également testé l'effet de tampon d'élution de Tris-Cl sur l'efficacité de réaction (figure 5). Un exemple d'étalonnage de brut extrait cellulaire, l'étape de renvoi 4.1 à 4.9, est illustréla figure 4a. En général, nos expériences montrent que l'extrait cellulaire brut est le plus sensible à des niveaux de Mg-glutamate, suivie de niveaux K-glutamate. Pour démontrer le système d'expression acellulaire, nous avons construit et testé une boucle de rétroaction négative fondée sur tet répression. 26 (figure 6). Dans le système d'expression acellulaire, le même circuit course avec et sans ATC montre un point final changement d'expression 7 fois de deGFP journaliste après huit heures d'expression. Bien que cette expérience ne nécessite pas des inducteurs ou des répresseurs mondiaux, si nécessaire, ils peuvent être ajoutés sous la rubrique «Master Mix Préparation." <img alt="Figure 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> Figure 1. Chronologie de l'extrait cellulaire brut, une solution d'acide aminé, et de l'énergie préparation de la solution. Timelin A cinq jours e pour une exécution typique du protocole est donnée ci-dessus, optimisé pour des incubations d'une nuit et les phases de travail pendant la journée. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> Figure 2. Coût et analyse de l'expression des extraits cellulaires bruts concurrence. a) Répartition des coûts de main-d'œuvre et les matériaux du système d'expression acellulaire TX-TL. Sur la base de coûts de réactifs que de Décembre 2012, et les coûts de main-d'œuvre de 14 $ par heure. B) Comparaison de TX-TL coûts du système de la libre expression des cellules contre d'autres systèmes commerciaux. Les coûts sont ventilés par ml, bien que les volumes de réaction peuvent varier selon le kit. C) Comparaison de TX-TL rendement du système de la libre expression des cellules par rapport aux autres systèmes commerciaux. rendement d'expression de la protéine déterminée par les normes du fabricant./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> Figure 3. Chargement en cours et le traitement d'un tube de perles de battre. a) Démonstration de viscosité correcte de solution cellulaire perle. Solution Cell-perle aura une viscosité dépend de nombreux facteurs, y compris quantité de tampon S30A ajouté, la quantité de billes ajoutées, et le temps passé sur la glace. B) Chargement de tube de perles à-coups avant rapide table centrifugation. La centrifugation élimine les bulles accumulées pendant le chargement. C) Bulles de surfaçage après centrifugation table. La taille des bulles varie, ils peuvent être sauté ou éliminées à l'aide d'une pipette d) le tube complètement rempli de billes de battre avant bouchage.. Un ménisque est formé dans le bourrelet battant t-ube, et le bouchon a assez pour couvrir et provoquer de petites quantités à remplir. e) appareil de filtre correctement chargé. Ceux-ci peuvent être réutilisés. F) Comparaison de correctement contre le tube mal traitées de perles battre. Le tube sur la gauche est un tube bien-beat - il dispose d'une petite et bien délimitée couche supérieure, et un surnageant clair. Le tube situé sur la droite est sous-optimale, en fonction de la plus grande, et la deuxième couche trouble du surnageant trouble. Tubes qui sont sous-optimale ne devraient pas subir de traitement supplémentaire. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> Figure 4. Propriétés des préparations d'extraits brut. a) les parcelles d'étalonnage typiques pour l'extrait cellulaire brut. Extrait brut est calibré pour Mg-glutamate supplémentaire, K-glutamate, et les niveaux de DTT, dans cet ordre. Montré est extrémité fluorescence après 8 h, ainsi que le taux maximal de production de protéines basée sur une moyenne mobile de 12 minutes. Sur la base de ces parcelles, une gamme acceptable de plus Mg-glutamate est de 4 mm, K-glutamate est de 60-80 mM, et la TNT est de 0-3 mM. Notez que chaque extrait brut doit être calibré indépendamment de ces trois variables. B) Variation de préparations d'extraits. Endpoint fluorescence de deux extraits bruts préparés à des dates différentes est montré; barres d'erreur sont une déviation standard de trois essais indépendants sur différents jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> Figure 5. Effets de la solution d'ADN sur l'efficacité de l'expression. a) Comparaison de deux purification différentdes procédés pour le traitement de plasmides. 1 nM de pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 est préparé en utilisant uniquement un kit QiaPrep Spin Miniprep (méthode de purification 1) ou post-traitement avec un kit de purification PCR QiaQuick (méthode de purification 2). Montré est extrémité fluorescence après 8 h, ainsi que le taux maximal de production de protéines sur la base d'une moyenne mobile de 12 minutes. Les barres d'erreur sont une déviation standard de quatre essais indépendants sur des jours différents. b) Effet de tampon d'élution (Tris-Cl). Différentes concentrations de Tris-Cl sont comparées dans une réaction d'expression sans cellule sur la base de l'expression de 1 nM de pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Les concentrations indiquées sont des concentrations finales de Tris-Cl dans la réaction; tampon d'élution utilisé est 10 mM Tris-Cl. Les barres d'erreur sont une déviation standard de trois essais indépendants sur différents jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <p class="jove_content" fo:garder-together.within page='"always"&gt;' alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg"> Figure 6. Échantillon TX-TL terme d'une boucle de rétroaction négative. a) installation de démonstration d'une réaction d'exécution acellulaire. Tests "sur" vs état ​​"off" de la boucle de rétroaction négative, avec des contrôles positifs et négatifs. B) la carte de plasmide de boucle de rétroaction négative. C) Les résultats représentatifs. Les données reflètent l'expérience en a) et b), avec un contrôle négatif soustrait le signal. Circuit génétique montre insert. Les barres d'erreur sont une déviation standard de trois essais indépendants sur différents jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Concentration </td><td> Montant </td><td> Stérilisation </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> Chloramphénicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml dans l'éthanol </td><td> 1 ml </td><td> Stériliser par filtration (0,22 uM) </td><td> Peut être fait dans de plus grands volumes stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + plaque de gélose cm </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de phosphate de potassium dibasique, 22 mM de phosphate de potassium monobasique, 34 ug / ml de chloramphenicol </td><td> 1 plaque </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P médias </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de phosphate de potassium dibasique, 22 mM de phosphate de potassium monobasique </td><td> 4 L </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs pour jour 1 de la cellule brut protocole d'extraction. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Concentration </td><td> Montant </td><td> Stérilisation </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Stériliser par filtration (0,22 uM) ou autoclave </td><td> Peut être conservé à température ambiante. </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Stériliser par filtration (0,22 uM) </td><td> Peut être fait dans des volumes plus importants et stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </td></tr><tr><td> Tampon S30A </td><td> 14 mM Mg-glutamate, 60 mM de K-glutamate, Tris 50 mM, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Pour atteindre un pH de 7,7, titrer avec de l'acide acétique. Ajouter du DTT à 2 mM de concentration finale juste avant utilisation. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampon S30B </td><td> 14 mM Mg-glutamate, 60 mM de K-glutamate, ~ mM Tris, pH 8,2 5 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Pour atteindre un pH de 8,2, titrer avec 2MTris. Ajouter du DTT à 1 mM de concentration finale juste avant utilisation. Stocker à 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs pour le jour 2 de la cellule brut protocole d'extraction. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Faucon </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vide de 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon avec culot (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masse Pellet (50 ml Falcon avec culot - vide de 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volume tampon S30A pour ajouter (masse de granulés * 0,9) (ml) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La masse totale de billes à ajouter (masse de granulés * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Tampon S30A et perle calculateur de masse, pour le jour 3 de la cellule brut protocole d'extraction. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Concentration </td><td> Montant </td><td> Stérilisation </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8, </td><td> 4 ml </td><td> Aucun </td><td> Pour atteindre un pH de 8, titrer avec KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> MM ATP 156 et GTP, CTP 94 mM et UTP, pH 7,5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Aucun </td><td> Pour atteindre un pH de 7,5, titrer avec KOH. </td></tr><tr><td> ARNt </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 pl </td><td> Aucun </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 pl </td><td> Aucun </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 pl </td><td> Aucun </td><td> Pour atteindre un pH 7,5-8, titrer avec Tris à 2 M. </td></tr><tr><td> AMPc </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 pl </td><td> Aucun </td><td> Pour atteindre un pH de 8, titrer avec Tris à 2 M. </td></tr><tr><td> Acide folinique </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 pl </td><td> Aucun </td><td> Bien que seulement 300 pi est nécessaire, recette supplémentaire est de 1,15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidine </td><td> 1 M </td><td> 150 pl </td><td> Aucun </td><td> Conserver à 4 ° C, la chaleur à 37 ° C pour faire fondre. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Aucun </td><td> Pour atteindre un pH de 7,5, titrer avec Tris à 2 M. </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Réactifs pour préparer protocole Energy Solution. Matériel supplémentaire 1. Recettes pour des articles. Chloramphénicol, 34 mg / ml: Préparer 0,51 g chloramphénicol et ajouter de l'éthanol à 15 ml. Stériliser par filtration (0,22 uM), aliquote de 1 ml tubes, conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. YT 2x + P + Cm plaque de gélose: Préparer 1,24 g 2xYT, solution dibasique 1,6 ml de phosphate de potassium 1 M @, 0,88 ml de solution de phosphate de potassium monobasique @ 1 M, 0,6 g d'agar et de l'eau à 40 ml. Autoclave. Laisser refroidir à 50 ° C et ajouter 40 ul cm. Aliquote de 25 ml dans une boîte de 100 x 15 mm Petri, et laisser refroidir pendant une heure. 2xYT + P médias: Préparez 124 g 2xYT, solution dibasique 160 ml de phosphate de potassium @ 1 M, 88 ml solution de phosphate de potassium monobasique @ 1 M, et de l'eau à 4 L. Aliquot sortir dans 2 x 1,88 L et 0,24 L. autoclave. Tris base, 2 M: Préparez 60,57 g de Tris base et de l'eau à 250 ml. Stériliser, magasin à la température ambiante pour une utilisation ultérieure. TNT, 1 M: Préparer 2,31 g TNT et de l'eau à 15 ml. Stériliser par filtration (0,22 uM), aliquote de 1 ml tubes, conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Tampon S30A: Préparer 10,88 g Mg-glutamate et 24,39 g K-glutamate, 50 ml de Tris à 2M, de l'acide acétique (à pH 7,7), et de l'eau à 2 L. autoclave, conserver à 4 ° C, ajouter 4 ml 1 M DTT avant utilisation. Tampon S30B: Préparer 10,88 g Mg-glutamate et 24,39 g K-glutamate, Tris à 2 M (pH 8,2), et de l'eau à 2 L. autoclave, conserver à 4 ° C, ajouter 2 ml 1 M DTT avant utilisation. HEPES: Préparation de 1,91 g d'HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8), et de l'eau à 4 ml. ARNt: Préparer 30 mg de l'ARNt et de l'eau à 600 pi. CoA: Préparer 30 mg de CoA (MW 767,53) et de l'eau à 600 pi. NAD: Ajouter 34,83 ​​mg de NAD (MW 663,43), Tris à 2 M (pH 7,5-8), et de l'eau à 300 pi. (Ajouter 27 ul de Tris à 2 M pour amener la solution à un pH de 7,5 à 8). AMPc: Ajouter 42,80 mg de l'AMPc (MW 329.22), Tris à 2 M (pH 8), et de l'eau à 200 pi. (Ajouter 73 ul de Tris à 2 M pour amener la solution à pH 8). Acide folinique (33,9 mm): à 20 mg de sel de calcium d'acide folinique solide (511,5 MW), ajouter 1,15 ml d'eau. Spermidine: Préparer 23,55 pi de spermidine (MW 145.25) et de l'eau à 150 pi. Préparer à la température ambiante après la fusion brièvement à 37 ° C. 3-PGA: ajouter 1,03 g de 3-PGA (MW 230,02), au Tris 2 M (pH de 7,5), et de l'eau à 3,2 ml. (Ajouter 1,73 ml de Tris à 2 M pour amener la solution à un pH de 7,5). Nucleotide Mix: Ajouter 145 mg de sel de dihydrate de l'ATP (MW 619,4), 133 mg de GTP sel disodique (MW 567,14), 79,4 mg de CTP sel disodique dihydraté (MW 563,16), 82,6 mg de dihydrate UTP trisodique de sel (MW 586,12) , KOH à 15% de dilution (à pH 7,5), et de l'eau à 1,5 ml. (Ajouter 353 ul de KOH à 15% de dilution pour amener la solution à un pH de 7,5). Matériel supplémentaire 2. Dosage de Bradford. <ol><li> Éliminer l'agent Bradford de 4 ° C et mis à température ambiante. </li><li> Préparer 50 ul de BSA standard à 1 mg / ml et à raison de 0,1 mg / ml. </li><li> Préparer 40 ul 20x dilution de l'extrait de l'étape 1.47. </li><li> Ajouter 800 ul d'eau pour 7 cuvettes. </li><li> Préparer cuvettes standard pour 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul de 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul de 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ul de 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 pi de 1 mg / ml BSA). </li><li> Préparer cuves expérimentales pour 2 ul d'échantillon et 4 ul d'échantillon. </li><li> Ajouter 200 ul d'agent Bradford à chaque cuvette et mélangez bien by pipetage. Incuber à température ambiante pendant au moins 10 min. </li><li> Produire courbe standard à DO 595 nm en utilisant des cuves de l'étape 6.5. Rejeter courbe standard si r 2 &lt;0,95. </li><li> Déterminer la concentration d'extrait à DO 595 nm en utilisant des cuves de l'étape 6.6. </li></ol> Matériel supplémentaire 3. Tampon calibrage feuille de calcul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Voir TXTL_e (modèle) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Matériel supplémentaire 4. Expression acellulaire feuille de calcul exécuté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Voir TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Ce protocole de cinq jours décrit toutes les étapes, de l&#39;équipement et des logiciels supplémentaires nécessaires pour la création et l&#39;exécution d&#39;une Escherichia coli endogène efficace basé TX-TL système d&#39;expression acellulaire à partir de zéro. Avec des réactifs, le protocole prend 8 heures ou moins de configurer une réaction, collecter et traiter les données.

Protocoles pour la mise en œuvre d'un Escherichia coli Sur la base du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

L’objectif global de cette procédure est de créer un système d’expression acellulaire basé sur e coli appelé traduction de transcription ou TX tl. Ceci est accompli en fabriquant d’abord trois composants initiaux pour l’extrait de cellule brute TX TL, la solution d’acides aminés et la solution énergétique. La solution d’acides aminés et la solution énergétique seront ensuite combinées pour former le tampon TX TL.La deuxième étape consiste à calibrer l’extrait de cellule brute pour déterminer les concentrations optimales de magnésium, de potassium et de DTT afin de produire des réactions TX TL avec des niveaux d’expression maximaux. Ensuite, les résultats de l’étalonnage sont utilisés pour fabriquer un système TX TL à trois tubes composé d’extrait de cellule brute tampon et d’ADN. La dernière étape consiste à exécuter une réaction TX TL à l’aide des réactifs qui viennent d’être fabriqués.En fin de compte, TX TL est utilisé pour démontrer des circuits de biologie synthétique ainsi que des applications d’expression acellulaire traditionnelles. Cette méthode peut aider à tester des circuits dans le domaine de la biologie synthétique en fournissant un environnement égal in vitro, qui émule celui in vivo. Les implications de cette technique s’étendent à l’augmentation de la vitesse de conception biologique synthétique en supprimant la nécessité d’effectuer toutes les étapes de prototypage in vivo.L’assistance à une procédure sera Claire Hayes, assistante de recherche dans notre groupe. Veuillez noter que cette vidéo ne passera en revue que certaines sections du protocole essentielles au tournage. Le protocole complet est disponible avec l’article texte.Plus tôt dans ce protocole, des cellules bactériennes ont été cultivées et granulées. Maintenant, les cellules bactériennes vont être lysées à l’aide d’un batteur à billes. Conservez tous les tubes de faucon de 50 millilitres contenant une suspension cellulaire sur de la glace.Aux fins de cette vidéo, le perlage des billes sera démontré pour un seul tube. Les billes doivent être ajoutées par intermittence au tube Falcon en trois aliquotes utilisant chacune un tiers du total des billes. Ajoutez la première aliquote de perles dans le vortex tubulaire pendant 30 secondes et placez-la sur de la glace.De la même manière, ajoutez la deuxième aliquote de perles, vortex et placez sur de la glace. Après avoir ajouté la dernière aliquote et le vortex pour s’assurer que les billes sont uniformément réparties, une pâte épaisse doit être formée après la troisième étape de vortex. Placez le tube sur de la glace.Préparez une pointe de pipette d’un volume de cinq millilitres en utilisant une paire de ciseaux stériles pour couper l’extrémité. Pour créer une ouverture de trois à quatre millimètres, réglez la pipette à deux millilitres. Placez 20 tubes de perles stériles sur de la glace.Utilisez la pipette modifiée pour vérifier la viscosité élevée de la solution de cellule de bille. Il doit être visqueux au point de sortir à peine de la pointe de la pipette. Lors de l’éjection, retirez la solution de cellule de bille du tube Falcon et transférez-la dans un tube de perle.Le remplir aux trois quarts à plein essorage extrêmement brièvement dans une mini centrifugeuse. Pour éliminer les bulles d’air sans redistribuer les billes, terminez d’ajouter la solution de cellules de billes dans le tube pour former un ménisque concave. Ensuite, ajoutez une très petite goutte de solution de cellule de billes à l’intérieur d’un capuchon de tube de perles.Veillez à ne pas mettre la solution dans la lèvre extérieure du capuchon. Sinon, le tube de perle ne se fermera pas suffisamment. Tapotez le capuchon sur une surface plane et vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air au bas du bouchon.Boucher le tube de battage de perles. S’il est fait correctement, le capuchon doit être hermétiquement fermé. Aucune bulle d’air ne doit être visible et peu ou pas de solution de cellule de bille doit déborder à partir de maintenant, deux personnes sont nécessaires pour accomplir efficacement le bourrelet de bille.Remettez le tube rempli à un assistant pour le perlage pendant que le premier démonstrateur continue de remplir d’autres tubes de perles avec la solution de cellule de perle restante. Prenez le tube de perles rempli et placez-le sur de la glace. Une fois que deux tubes de perles remplis ont été collectés et sont restés sur la glace pendant au moins une minute.Commencez le perlage d’un tube pendant 30 secondes à 46 tr/min. Placez-le à l’envers sur de la glace pendant 30 secondes tout en battant l’autre tube. Répétez l’opération de perlage et de glaçage de manière à ce que chaque tube de perle rempli soit battu pendant une minute au total.Une fois que tous les tubes de perles remplis ont été traités, construisez un appareil de filtration à partir d’un tube de faucon de 15 millilitres. Tout d’abord, ajoutez un nouveau capuchon de perle de perle partie plate face vers le haut vers le bas du tube. Retirez ensuite le capuchon d’un tube de perles traitées et appuyez fermement une colonne de microchromatographie sur l’extrémité du tube de perles traitées jusqu’à ce qu’elle soit complètement scellée.Cassez l’extrémité elucian de la colonne de microchromatographie et placez-la elucian. Terminez vers le bas dans un tube de perle vide. Placez ce complexe dans le tube de faucon de 15 millilitres.Construisez les appareils de filtration pour tous les tubes de battage de billes remplis et gardez-les sur de la glace. Une fois la centrifugeuse terminée, l’appareil de filtration décapsule le tube Falcon à 6 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour séparer l’extrait et la pastille des billes. Après la centrifugation, vérifiez que chaque tube de perle a produit un extrait viable.L’extrait correctement battu ne sera pas trouble et la pastille aura deux couches distinctes comme illustré par le tube de gauche. Les tubes turbides comme le montre l’exemple de droite doivent être jetés. Transférez le surnageant des tubes non turid dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,75 millilitre, en prenant le moins de granulés possible.Garder sur la glace jusqu’à ce que tous les tubes de perles aient été traités. Ensuite, faites tourner les microtubes à centrifuger et récupérez le surnageant. Après avoir consolidé 500 microlitres de surnageant sans granulés dans un nouveau tube de perles.Incuber les tubes avec les bouchons retirés à 220 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 80 minutes. Celui-ci digérera les acides nucléiques restants à l’aide d’exonucléases endogènes libérées pendant le processus de perlage. Lorsque l’incubation est terminée, l’extrait doit avoir l’air trouble.Consolider l’extrait dans des microtubes de centrifugation de 1,75 millilitre jusqu’à 1,5 millilitres par tube centrifuger à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, consolidez le surnageant sans pastilles dans un microtube à centrifuger de 1,75 millilitre pour les petits rendements ou un tube faucon de 15 millilitres pour les plus grands rendements sur glace. Boucher le tube et bien mélanger en l’inversant.Conservez 10 microlitres de surnageant sur de la glace pour une mesure ultérieure de la concentration en protéines. Déterminez la quantité totale d’extrait produite et hydratez le nombre nécessaire de 10 cassettes de dialyse de coupure de poids moléculaire en les immergeant dans un tampon S 30 B pendant deux minutes. Chargez les cassettes avec jusqu’à 2,5 millilitres d’extrait.Chaque bécher peut prendre jusqu’à deux cassettes de dialyse en remuant à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Reportez-vous à l’article écrit pour les étapes de traitement après la dialyse. Une réaction de traduction de transcription de base comporte trois parties, l’extrait de cellule brut, le tampon et l’ADN.Bien que le volume des réactions puisse varier, ce protocole utilise un modèle pré-écrit pour effectuer une réaction de 10 microlitres. Ici. Les éléments en violet indiquent les valeurs saisies par l’utilisateur, et les éléments en bleu indiquent des réactifs supplémentaires à ajouter à la conception de la réaction de l’expérience en sili à l’aide de la section de préparation du mélange principal et de la section de préparation de l’ADN. En général, les constantes peuvent être placées dans la section de préparation du master mix, tandis que les variables peuvent être placées dans la section de préparation de l’ADN.Minimisez le nombre d’échantillons par expérience pour éviter l’évaporation des échantillons et le biais au moment du début de l’expérience. Un exemple de configuration est présenté dans ce tableau. Pour préparer des échantillons d’ADN pour chaque échantillon, identifiez l’aliquote de l’eau d’ADN indiquée et les éléments fournis par l’utilisateur dans un microtube à centrifuger.À température ambiante, préparez le mélange principal composé d’un extrait tampon et de tous les articles fournis par l’utilisateur mondial en le gardant sur la glace et le vortex. Après l’ajout de chaque élément, ajoutez la quantité appropriée de mélange maître à chaque échantillon d’ADN et conservez-le à température ambiante. Considérez ceci comme l’heure de début de la réaction.Vortex chaque échantillon et centrifugeuse à 10 000 G pendant 30 secondes à température ambiante pour faire descendre tout échantillon résiduel et réduire les bulles. Exécutez la réaction dans une plaque à 384 puits à 29 degrés Celsius. La durée d’exécution varie en fonction de l’expérience, mais dure généralement moins de huit heures.À la fin de l’essai, les données peuvent être lues à partir d’un lecteur de plaques. Cet article présente un protocole de cinq jours pour la préparation d’un système de transcription endogène basé sur la traduction ou l’expression acellulaire TXTL. Les conditions d’expression de ce système ont été optimisées en testant les effets de différentes méthodes de traitement des plasmides et du tampon elucian.Certaines variables introduites dans le système TXTL doivent être calibrées au préalable pour leur toxicité, par exemple, dans la comparaison des méthodes de traitement des plasmides, la méthode de purification utilise uniquement un mini kit de préparation de spin de préparation kaya prep tandis que dans la méthode de purification deux, le plasmide est préparé à l’aide du même mini kit de préparation, puis post-traitement avec un kayak. Kit de purification PCR rapide. Ce graphique montre la fluorescence du point final après huit heures ainsi que le taux maximal de production de protéines basé sur une moyenne mobile de 12 minutes Les barres d’erreur sont un écart-type de quatre exécutions indépendantes à des jours différents.La différence d’expression observée est due à la différence de teneur en sel. Cependant, d’autres éléments peuvent ne présenter aucun effet sur TXTL, tels que le tampon elucian. Différentes concentrations de chlorure de TS ont été comparées dans une réaction d’expression acellulaire basée sur l’expression d’une molaire anologique du plasmide.Les concentrations indiquées sont les concentrations finales de chlorure de tris. Dans la réaction elucian buffer utilisé est de 10 millimolaires de chlorure de tris, les barres d’erreur sont un écart-type de trois cycles indépendants à des jours différents. Cette figure montre des graphiques d’étalonnage typiques pour l’extrait de cellules brutes, calibrés pour des niveaux supplémentaires de glutamate de magnésium, de glutamate de potassium et de DTT.La fluorescence finale après huit heures ainsi que le taux maximal de production de protéines basé sur une moyenne mobile de 12 minutes sont présentés. Notez que chaque extrait de cellule brute doit être calibré indépendamment pour ces trois variables. En général, les résultats indiquent que l’extrait cellulaire brut est le plus sensible aux niveaux de glutamate de magnésium, suivis des niveaux de glutamate de potassium.Sur la base de ces graphiques, une plage acceptable de glutamate de magnésium supplémentaire est de quatre millimolaires, le glutamate de potassium est de 60 à 80 millimolaires et le DTT est de zéro à trois millimolaires d’aération sur la face inférieure. L’efficacité finale de chaque préparation d’extrait de cellule brute peut varier en fonction de la compétence de l’utilisateur et des conditions environnementales. Bien que la variation typique du rendement soit comprise entre 5 et 10 %, la fluorescence finale de deux extraits bruts préparés à des dates différentes est illustrée ici.Les barres d’erreur sont un écart-type de trois exécutions indépendantes à des jours différents. Pour démontrer le système d’expression acellulaire, une boucle de rétroaction négative basée sur la répression de Tet a été construite et testée le même circuit avec et sans TC a montré une expression finale septuple. Changement du rapporteur D-E-G-F-P après huit heures de barres d’erreur d’expression sont un écart-type par rapport à trois exécutions indépendantes à des jours différents.Le circuit génétique est illustré dans l’encadré. Cette dernière figure illustre l’analyse du coût et de l’expression des extraits de cellules brutes concurrents. Le graphique circulaire présente les coûts de main-d’œuvre et de matériaux du système d’expression acellulaire TX TL en fonction des coûts des réactifs en décembre 2012 et des coûts de main-d’œuvre de 14 par heure.Le panneau B compare les coûts du système d’expression sans cellule TX par rapport à d’autres systèmes commerciaux. Les coûts sont ventilés par microlitre, bien que les volumes de réaction puissent varier d’un kit à l’autre. Le coût des matériaux pour ce système est d’environ 3 cents par réaction du microlitre, ce qui représente une réduction de 98 % des coûts par rapport aux systèmes commerciaux sans cellules comparables.Le panneau C montre une comparaison du rendement du système d’expression acellulaire TX TL par rapport à d’autres systèmes commerciaux. Ce système peut produire jusqu’à 0,75 milligramme par millilitre de protéine rapporteure en utilisant soit un promoteur basé sur Sigma 70 avec des opérateurs de phages Lambda, soit un promoteur piloté par T sept. Ces comparaisons indiquent que le système d’expression acellulaire TX TL peut produire des quantités équivalentes de protéines car les systèmes basés sur T sept ajoutent une réduction considérable des coûts à des systèmes commerciaux similaires.Nous espérons que cette technique ouvrira la voie à la simplification du processus d’ingénierie en biologie synthétique.

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