Protocoles pour la mise en œuvre d'un Escherichia coli Sur la base du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

L’objectif global de cette procédure est de créer un système d’expression acellulaire basé sur e coli appelé traduction de transcription ou TX tl. Ceci est accompli en fabriquant d’abord trois composants initiaux pour l’extrait de cellule brute TX TL, la solution d’acides aminés et la solution énergétique. La solution d’acides aminés et la solution énergétique seront ensuite combinées pour former le tampon TX TL.

La deuxième étape consiste à calibrer l’extrait de cellule brute pour déterminer les concentrations optimales de magnésium, de potassium et de DTT afin de produire des réactions TX TL avec des niveaux d’expression maximaux. Ensuite, les résultats de l’étalonnage sont utilisés pour fabriquer un système TX TL à trois tubes composé d’extrait de cellule brute tampon et d’ADN. La dernière étape consiste à exécuter une réaction TX TL à l’aide des réactifs qui viennent d’être fabriqués.

En fin de compte, TX TL est utilisé pour démontrer des circuits de biologie synthétique ainsi que des applications d’expression acellulaire traditionnelles. Cette méthode peut aider à tester des circuits dans le domaine de la biologie synthétique en fournissant un environnement égal in vitro, qui émule celui in vivo. Les implications de cette technique s’étendent à l’augmentation de la vitesse de conception biologique synthétique en supprimant la nécessité d’effectuer toutes les étapes de prototypage in vivo.

L’assistance à une procédure sera Claire Hayes, assistante de recherche dans notre groupe. Veuillez noter que cette vidéo ne passera en revue que certaines sections du protocole essentielles au tournage. Le protocole complet est disponible avec l’article texte.

Plus tôt dans ce protocole, des cellules bactériennes ont été cultivées et granulées. Maintenant, les cellules bactériennes vont être lysées à l’aide d’un batteur à billes. Conservez tous les tubes de faucon de 50 millilitres contenant une suspension cellulaire sur de la glace.

Aux fins de cette vidéo, le perlage des billes sera démontré pour un seul tube. Les billes doivent être ajoutées par intermittence au tube Falcon en trois aliquotes utilisant chacune un tiers du total des billes. Ajoutez la première aliquote de perles dans le vortex tubulaire pendant 30 secondes et placez-la sur de la glace.

De la même manière, ajoutez la deuxième aliquote de perles, vortex et placez sur de la glace. Après avoir ajouté la dernière aliquote et le vortex pour s’assurer que les billes sont uniformément réparties, une pâte épaisse doit être formée après la troisième étape de vortex. Placez le tube sur de la glace.

Préparez une pointe de pipette d’un volume de cinq millilitres en utilisant une paire de ciseaux stériles pour couper l’extrémité. Pour créer une ouverture de trois à quatre millimètres, réglez la pipette à deux millilitres. Placez 20 tubes de perles stériles sur de la glace.

Utilisez la pipette modifiée pour vérifier la viscosité élevée de la solution de cellule de bille. Il doit être visqueux au point de sortir à peine de la pointe de la pipette. Lors de l’éjection, retirez la solution de cellule de bille du tube Falcon et transférez-la dans un tube de perle.

Le remplir aux trois quarts à plein essorage extrêmement brièvement dans une mini centrifugeuse. Pour éliminer les bulles d’air sans redistribuer les billes, terminez d’ajouter la solution de cellules de billes dans le tube pour former un ménisque concave. Ensuite, ajoutez une très petite goutte de solution de cellule de billes à l’intérieur d’un capuchon de tube de perles.

Veillez à ne pas mettre la solution dans la lèvre extérieure du capuchon. Sinon, le tube de perle ne se fermera pas suffisamment. Tapotez le capuchon sur une surface plane et vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air au bas du bouchon.

Boucher le tube de battage de perles. S’il est fait correctement, le capuchon doit être hermétiquement fermé. Aucune bulle d’air ne doit être visible et peu ou pas de solution de cellule de bille doit déborder à partir de maintenant, deux personnes sont nécessaires pour accomplir efficacement le bourrelet de bille.

Remettez le tube rempli à un assistant pour le perlage pendant que le premier démonstrateur continue de remplir d’autres tubes de perles avec la solution de cellule de perle restante. Prenez le tube de perles rempli et placez-le sur de la glace. Une fois que deux tubes de perles remplis ont été collectés et sont restés sur la glace pendant au moins une minute.

Commencez le perlage d’un tube pendant 30 secondes à 46 tr/min. Placez-le à l’envers sur de la glace pendant 30 secondes tout en battant l’autre tube. Répétez l’opération de perlage et de glaçage de manière à ce que chaque tube de perle rempli soit battu pendant une minute au total.

Une fois que tous les tubes de perles remplis ont été traités, construisez un appareil de filtration à partir d’un tube de faucon de 15 millilitres. Tout d’abord, ajoutez un nouveau capuchon de perle de perle partie plate face vers le haut vers le bas du tube. Retirez ensuite le capuchon d’un tube de perles traitées et appuyez fermement une colonne de microchromatographie sur l’extrémité du tube de perles traitées jusqu’à ce qu’elle soit complètement scellée.

Cassez l’extrémité elucian de la colonne de microchromatographie et placez-la elucian. Terminez vers le bas dans un tube de perle vide. Placez ce complexe dans le tube de faucon de 15 millilitres.

Construisez les appareils de filtration pour tous les tubes de battage de billes remplis et gardez-les sur de la glace. Une fois la centrifugeuse terminée, l’appareil de filtration décapsule le tube Falcon à 6 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour séparer l’extrait et la pastille des billes. Après la centrifugation, vérifiez que chaque tube de perle a produit un extrait viable.

L’extrait correctement battu ne sera pas trouble et la pastille aura deux couches distinctes comme illustré par le tube de gauche. Les tubes turbides comme le montre l’exemple de droite doivent être jetés. Transférez le surnageant des tubes non turid dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,75 millilitre, en prenant le moins de granulés possible.

Garder sur la glace jusqu’à ce que tous les tubes de perles aient été traités. Ensuite, faites tourner les microtubes à centrifuger et récupérez le surnageant. Après avoir consolidé 500 microlitres de surnageant sans granulés dans un nouveau tube de perles.

Incuber les tubes avec les bouchons retirés à 220 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 80 minutes. Celui-ci digérera les acides nucléiques restants à l’aide d’exonucléases endogènes libérées pendant le processus de perlage. Lorsque l’incubation est terminée, l’extrait doit avoir l’air trouble.

Consolider l’extrait dans des microtubes de centrifugation de 1,75 millilitre jusqu’à 1,5 millilitres par tube centrifuger à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, consolidez le surnageant sans pastilles dans un microtube à centrifuger de 1,75 millilitre pour les petits rendements ou un tube faucon de 15 millilitres pour les plus grands rendements sur glace. Boucher le tube et bien mélanger en l’inversant.

Conservez 10 microlitres de surnageant sur de la glace pour une mesure ultérieure de la concentration en protéines. Déterminez la quantité totale d’extrait produite et hydratez le nombre nécessaire de 10 cassettes de dialyse de coupure de poids moléculaire en les immergeant dans un tampon S 30 B pendant deux minutes. Chargez les cassettes avec jusqu’à 2,5 millilitres d’extrait.

Chaque bécher peut prendre jusqu’à deux cassettes de dialyse en remuant à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Reportez-vous à l’article écrit pour les étapes de traitement après la dialyse. Une réaction de traduction de transcription de base comporte trois parties, l’extrait de cellule brut, le tampon et l’ADN.

Bien que le volume des réactions puisse varier, ce protocole utilise un modèle pré-écrit pour effectuer une réaction de 10 microlitres. Ici. Les éléments en violet indiquent les valeurs saisies par l’utilisateur, et les éléments en bleu indiquent des réactifs supplémentaires à ajouter à la conception de la réaction de l’expérience en sili à l’aide de la section de préparation du mélange principal et de la section de préparation de l’ADN. En général, les constantes peuvent être placées dans la section de préparation du master mix, tandis que les variables peuvent être placées dans la section de préparation de l’ADN.

Minimisez le nombre d’échantillons par expérience pour éviter l’évaporation des échantillons et le biais au moment du début de l’expérience. Un exemple de configuration est présenté dans ce tableau. Pour préparer des échantillons d’ADN pour chaque échantillon, identifiez l’aliquote de l’eau d’ADN indiquée et les éléments fournis par l’utilisateur dans un microtube à centrifuger.

À température ambiante, préparez le mélange principal composé d’un extrait tampon et de tous les articles fournis par l’utilisateur mondial en le gardant sur la glace et le vortex. Après l’ajout de chaque élément, ajoutez la quantité appropriée de mélange maître à chaque échantillon d’ADN et conservez-le à température ambiante. Considérez ceci comme l’heure de début de la réaction.

Vortex chaque échantillon et centrifugeuse à 10 000 G pendant 30 secondes à température ambiante pour faire descendre tout échantillon résiduel et réduire les bulles. Exécutez la réaction dans une plaque à 384 puits à 29 degrés Celsius. La durée d’exécution varie en fonction de l’expérience, mais dure généralement moins de huit heures.

À la fin de l’essai, les données peuvent être lues à partir d’un lecteur de plaques. Cet article présente un protocole de cinq jours pour la préparation d’un système de transcription endogène basé sur la traduction ou l’expression acellulaire TXTL. Les conditions d’expression de ce système ont été optimisées en testant les effets de différentes méthodes de traitement des plasmides et du tampon elucian.

Certaines variables introduites dans le système TXTL doivent être calibrées au préalable pour leur toxicité, par exemple, dans la comparaison des méthodes de traitement des plasmides, la méthode de purification utilise uniquement un mini kit de préparation de spin de préparation kaya prep tandis que dans la méthode de purification deux, le plasmide est préparé à l’aide du même mini kit de préparation, puis post-traitement avec un kayak. Kit de purification PCR rapide. Ce graphique montre la fluorescence du point final après huit heures ainsi que le taux maximal de production de protéines basé sur une moyenne mobile de 12 minutes Les barres d’erreur sont un écart-type de quatre exécutions indépendantes à des jours différents.

La différence d’expression observée est due à la différence de teneur en sel. Cependant, d’autres éléments peuvent ne présenter aucun effet sur TXTL, tels que le tampon elucian. Différentes concentrations de chlorure de TS ont été comparées dans une réaction d’expression acellulaire basée sur l’expression d’une molaire anologique du plasmide.

Les concentrations indiquées sont les concentrations finales de chlorure de tris. Dans la réaction elucian buffer utilisé est de 10 millimolaires de chlorure de tris, les barres d’erreur sont un écart-type de trois cycles indépendants à des jours différents. Cette figure montre des graphiques d’étalonnage typiques pour l’extrait de cellules brutes, calibrés pour des niveaux supplémentaires de glutamate de magnésium, de glutamate de potassium et de DTT.

La fluorescence finale après huit heures ainsi que le taux maximal de production de protéines basé sur une moyenne mobile de 12 minutes sont présentés. Notez que chaque extrait de cellule brute doit être calibré indépendamment pour ces trois variables. En général, les résultats indiquent que l’extrait cellulaire brut est le plus sensible aux niveaux de glutamate de magnésium, suivis des niveaux de glutamate de potassium.

Sur la base de ces graphiques, une plage acceptable de glutamate de magnésium supplémentaire est de quatre millimolaires, le glutamate de potassium est de 60 à 80 millimolaires et le DTT est de zéro à trois millimolaires d’aération sur la face inférieure. L’efficacité finale de chaque préparation d’extrait de cellule brute peut varier en fonction de la compétence de l’utilisateur et des conditions environnementales. Bien que la variation typique du rendement soit comprise entre 5 et 10 %, la fluorescence finale de deux extraits bruts préparés à des dates différentes est illustrée ici.

Les barres d’erreur sont un écart-type de trois exécutions indépendantes à des jours différents. Pour démontrer le système d’expression acellulaire, une boucle de rétroaction négative basée sur la répression de Tet a été construite et testée le même circuit avec et sans TC a montré une expression finale septuple. Changement du rapporteur D-E-G-F-P après huit heures de barres d’erreur d’expression sont un écart-type par rapport à trois exécutions indépendantes à des jours différents.

Le circuit génétique est illustré dans l’encadré. Cette dernière figure illustre l’analyse du coût et de l’expression des extraits de cellules brutes concurrents. Le graphique circulaire présente les coûts de main-d’œuvre et de matériaux du système d’expression acellulaire TX TL en fonction des coûts des réactifs en décembre 2012 et des coûts de main-d’œuvre de 14 par heure.

Le panneau B compare les coûts du système d’expression sans cellule TX par rapport à d’autres systèmes commerciaux. Les coûts sont ventilés par microlitre, bien que les volumes de réaction puissent varier d’un kit à l’autre. Le coût des matériaux pour ce système est d’environ 3 cents par réaction du microlitre, ce qui représente une réduction de 98 % des coûts par rapport aux systèmes commerciaux sans cellules comparables.

Le panneau C montre une comparaison du rendement du système d’expression acellulaire TX TL par rapport à d’autres systèmes commerciaux. Ce système peut produire jusqu’à 0,75 milligramme par millilitre de protéine rapporteure en utilisant soit un promoteur basé sur Sigma 70 avec des opérateurs de phages Lambda, soit un promoteur piloté par T sept. Ces comparaisons indiquent que le système d’expression acellulaire TX TL peut produire des quantités équivalentes de protéines car les systèmes basés sur T sept ajoutent une réduction considérable des coûts à des systèmes commerciaux similaires.

Nous espérons que cette technique ouvrira la voie à la simplification du processus d’ingénierie en biologie synthétique.