Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

L’objectif global de cette procédure est de développer des micro-canaux endothéliales circulaires à section transversale multi-profondeurs sur une puce, qui imitent la géométrie 3D des microvaisseaux in vivo et fonctionnent sous un flux de profusion continu contrôlé. Ceci est accompli en fabriquant d’abord par photolithographie un moule maître avec un réseau de microcanaux à section transversale semi-circulaire à l’aide d’une résine photosensible reformatable positive. La deuxième étape consiste à utiliser le moule maître pour reproduire deux microcanaux en polydiméthyl soane, les aligner et les lier pour créer un réseau de microcanaux cylindriques.

Ensuite, les cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine sont placées à l’intérieur du réseau de microcanaux avant de cultiver les cellules dans des conditions de perfusion continue contrôlée pendant une période comprise entre quatre jours et deux semaines. En fin de compte, une monocouche de cellules de confluence indiquée par la position de la membrane et les noyaux sous les microscopes est développée le long de la surface interne du réseau de microcanaux. Cependant, les tests conventionnels de micro-vaisseaux individuels tels que les tests de migration cellulaire anso, les tests de formation et les tests d’anneau droit et mobile sont limités à la recréation de micro-récipients individuels en ce qui concerne la géométrie tridimensionnelle et le contrôle de flux continu.

Le principal avantage de nos techniques, notre méthode de microfabrication existante, est qu’elle peut fabriquer de manière conventionnelle un réseau de canaux microfluidiques multi-profondeurs qui imite les géométries 3D complexes de micro-récipients in vivo qui ont des sections transversales arrondies. Il permet également de concevoir des systèmes biomagnétiques microvasculaires, qui obéissent approximativement plus lentement et maintiennent le débit de fluide à un niveau requis de sorte que la résistance globale du canal est faible et que le débit que nous avons perdu est plus uniforme dans tout le réseau, démontrant que la procédure sera un étudiant diplômé de mon laboratoire. Cette procédure commence par la fabrication d’un moule maître de résine photosensible composé de micro-canaux d’un diamètre compris entre 30 microns et 60 microns, comme détaillé dans le protocole textuel, transfère brièvement la résine photorésine de refusion du réfrigérateur à quatre degrés Celsius à la salle blanche 24 heures avant de l’utiliser et laisse-la se réchauffer à température ambiante.

Commencez par revêtir par centrifugation la couche de résine photosensible à refusion positive sur un substrat de silicium pré-nettoyé en suivant la procédure décrite dans le protocole texte. Ensuite, exposez la résine photosensible à la lumière UV à travers un masque à motifs avant de développer les micro-canaux à motifs. Enfin, après la refusion, créez un réseau de microcanaux transversal semi-circulaire.

Une fois que le moule maître est prêt, préparez une solution de polyméthyl soane ou de PDMS à raison de 10 pour une base à l’agent de durcissement et mélangez-la soigneusement à l’aide d’un mélangeur centrifuge planétaire. Coulez la solution PDMS sur le moule maître de résine photo refondu. Placez le PDMS coulé dans une dessiccation pendant 15 minutes jusqu’à ce qu’il soit dégazé.

Utilisez de l’azote gazeux pour éliminer les bulles restantes si nécessaire. Faites cuire le PDMS dans un four à une température de 60 degrés Celsius pendant trois heures pour lui permettre de durcir. Retirez ensuite la couche PDMS durcie du moule maître.

À l’aide d’un poinçonneur aiguisé, créez des trous d’entrée et de sortie en perçant des trous dans le réseau de canaux. Nettoyez la surface du PDMS à l’aide d’azote gazeux. Traitez deux couches de PDMS avec du plasma d’oxygène pendant 30 secondes à l’intérieur d’un nettoyeur plasma à une pression de fonctionnement de 45 milato et à un débit d’oxygène de 3,5 pieds cubes par minute.

Alignez ensuite les surfaces du PDMS manuellement à l’aide d’un microscope optique. Utilisez une goutte d’eau si nécessaire pour un meilleur contrôle de l’alignement. Enfin, faites cuire l’appareil dans un four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes pour obtenir une culture de liaison permanente.

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine ou EV dans un milieu de culture avec de la L-glutamine complétée par 10 % de sérum fœtal bovin. Traitez l’appareil avec du plasma d’oxygène pendant cinq minutes avec une pression de fonctionnement de 45 milits et un débit d’oxygène de 3,5 pieds cubes par minute. Chargez ensuite l’appareil avec de l’eau désionisée et traitez-le avec une lumière UV pendant huit heures dans une cagoule de biosécurité laminaire pour la stérilisation.

Un jour avant que les cellules ne soient prêtes, lavez l’appareil avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS, puis enduisez-le de fibronectine. Incuber au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Une fois que les cellules sont confluentes, récoltez-les en rinçant d’abord les cellules avec une solution saline tamponnée en tas, puis en traitant les cellules avec de la trypsine EDTA après ajout de trypsine.

Incuber les cellules pendant deux à six minutes à 37 degrés Celsius. Une fois la trypsine terminée, neutralisez les tripsin EDTA avec une solution neutralisante tripsin. Comptez les cellules, puis centrifugez-les avant de les récupérer.

La suspension dans le milieu de culture avec 8 % de dextrine est utilisée pour augmenter la viscosité du milieu afin d’améliorer l’assise et la fixation des cellules après le revêtement FI enc ENC. Lavez l’appareil avec un XPBS, puis chargez-le avec du milieu de culture avant de l’incuber à une température de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Les cellules suivantes dans un milieu de culture à 8 % de dextrine à une concentration de trois à 4 millions de cellules par millilitre sont chargées dans le dispositif.

Placez une gouttelette de 20 microlitres de cellules à une entrée de l’appareil et inclinez-la pour introduire les cellules dans le canal microfluidique. Après 15 à 20 minutes, les cellules commenceront à se fixer aux parois latérales des canaux. Faites pivoter l’appareil toutes les 15 minutes pour créer une distribution plus uniforme des cellules.

Si nécessaire, un chargement supplémentaire peut être effectué. Après cinq à six heures de culture statique, les cellules attachées commenceront à se disperser complètement. Mettez en place une perfusion à long terme à l’aide d’un système de pompe à seringue télécommandé avec un débit constant de 10 microlitres par heure, la perfusion peut être ajustée pour un débit plus élevé et peut durer entre quatre jours et deux semaines.

Lorsque les cellules atteignent la confluence à l’intérieur de l’appareil, lavez d’abord l’appareil avec un XPBS pour bien retirer le support. Chargez ensuite l’appareil avec un colorant rouge dilué après l’incubation de l’appareil dans l’obscurité pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez-le avec un milieu de culture pour arrêter les taches.

Une longue incubation du colorant peut provoquer une toxicité cellulaire et une désadhésion. Chargez ensuite l’appareil avec un colorant bleu dilué avec un XPBS, incubez dans l’obscurité pendant cinq minutes à température ambiante avant de laver soigneusement l’appareil avec un XPBS. Examinez la coloration cellulaire à l’aide d’un microscope optique inversé.

Si la coloration est bonne, chargez les microcanaux avec un support de fixation, puis immergez l’appareil dans un support de fixation et couvrez-le complètement d’une feuille d’aluminium. Conservez l’appareil au réfrigérateur à une température de quatre degrés Celsius pour éviter que l’appareil ne se dessèche et ne blanchisse L’appareil fixe est maintenant prêt pour l’imagerie confocale, qui peut être effectuée par un microscope confocal à balayage laser, la microscopie électronique à balayage et la microscopie optique. Ils ont été utilisés pour caractériser la résine photosensible de refusion et le canal PDMS répliqué avant et après la progression de la refusion.

Les caractéristiques géométriques du réseau de microcanaux PDMS ont été caractérisées et présentées ici. Les sections transversales circulaires des moules PDMS montrent les dimensions des canaux à chaque niveau de ramification. Les résultats montrent que la technique de refusion de photorésine peut créer des réseaux de canaux ramifiés multi-profondeurs dans une approche plus pratique par des techniques de refusion de photorésine et permettre la conception de systèmes biomimétiques microvasculaires, qui obéissent approximativement à la loi de Murray montrée ici sont des images de microscopie utilisant un colorant de membrane cellulaire fluorescent en rouge et un colorant nucléaire cellulaire en bleu.

Les vues en coupe transversale circulaire ont révélé que l’EV tapissait la surface interne d’un réseau de microcanaux cylindriques à différentes régions de ramification. En raison des géométries complexes des micro-vaisseaux in vivo, la surveillance en temps réel de ces petits vaisseaux est difficile. La puce développée à base de P DM S offre de bonnes propriétés optiques et permet une imagerie de haute qualité et en temps réel des microcanaux endothéliaux, comme le montre ce film confocal de la paroi cellulaire le long du réseau de canaux circulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de la refusion pour ce mode de masse. Créez un réseau de micro-canaux PDMS à section efficace circulaire, chargez les cellules endocellulaires dans les dispositifs et configurez une profusion de milieux à long terme. En résumé, les microcanaux endosérialisés développés sur une puce offrent une approche rapide et reproductible pour créer des réseaux de microcanaux multi-profondeurs à section transversale circulaire, qui imitent la géométrie des micro-vaisseaux InVivo.

Cette procédure illustre l’utilisation de capacités uniques dans les technologies de micro-fabrication et de micro-alimentation avancées pour créer un modèle microvasculaire avec un contrôle de perfusion continu à long terme, ainsi qu’une capacité d’imagerie de haute qualité et en temps réel avec l’utilité croissante des canaux micro-alimentaires pour les applications de biologie cellulaire, d’ingénierie tissulaire et de bio-ingénierie. Les micro-canaux endo-sérialisés sur une puce sont un essai potentiel pour la recherche microvasculaire.