Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l'étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

L’objectif global de cette procédure est d’extraire les protéines de levure tout en préservant la structure native, les interactions fonctionnelles et les modifications post-traductionnelles. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules pour induire l’expression de la protéine d’intérêt. Ensuite, les cellules de levure récoltées sont homogénéisées dans un tampon approprié pour extraire les protéines.

Ensuite, les protéines d’intérêt sont purifiées à partir de l’extrait de cellule entière clarifié à l’aide d’une affinité de résine. La dernière étape de la procédure consiste à échapper aux protéines purifiées de la résine d’affinité pour une analyse plus approfondie ou des applications en aval. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des modifications et des interactions avec la purification des protéines sur la base de l’analyse par transfert Western.

La démonstration de la procédure sera faite par Eva’s Ky, une diplômée de William et Mary qui a passé les deux dernières années en tant que chercheuse de premier cycle dans mon laboratoire. Le principal avantage du perlage par rapport aux autres méthodes existantes est le traitement et la lyse rapides de plusieurs échantillons dans des conditions qui préservent les interactions entre les fonctions des protéines et les modifications post-traductionnelles. Pour commencer à transformer les cellules d’une souche de levure positive au gal avec un plasmide codant pour un six inductible au galactose, sa protéine de choix marquée inoculer des transformants dans cinq millilitres de milieu sélectif approprié tel que l’uracile SD, contenant 2 % de saccharose et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit avec rotation le lendemain diluer la culture de nuit dans un milieu sélectif avec 2 % de saccharose jusqu’à un volume final de 33 millilitres de sorte que la densité optique à 600 Les nanomètres mesurent 0,3, se développent dans un incubateur à 30 degrés Celsius et 150 tr/min.

Lorsque la culture a atteint une DO 600 de 0,8 à 1,5, induire l’expression de la protéine souhaitée en ajoutant 17 millilitres de trois XYEP avec 6 % de galactose pour une concentration finale d’un XYEP avec 2 % de galactose placés dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius pendant cinq à six heures supplémentaires. Après avoir mesuré la DO 600 de la centrifugeuse de culture induite environ 150 à 200 unités OD 600 de cellules pendant cinq minutes à 5 000 tr/min à quatre degrés Celsius, puis utilisez un millilitre de glace froide un XPBS avec un cocktail d’inhibiteur de protéase x pour remettre en suspension le palais cellulaire et le transférer dans un tube à bouchon à vis de deux millilitres centrifuger les cellules pendant une minute à 15, 000 tr/min et quatre degrés Celsius. Après décantation, congelez la pastille de cellule dans de l’azote liquide jusqu’à la pastille de cellule congelée.

Ajoutez 200 microlitres de billes de verre lavé à l’acide et 500 microlitres de tampon de lyse glacée. Garder les tubes sur la glace en tout temps. À l’aide d’une pointe de pipette avec la coupure d’extrémité, pipetez brièvement de haut en bas à quatre degrés Celsius.

Placez les tubes de cellules dans le verrou d’équilibrage du broyeur à billes et faites fonctionner la machine selon les instructions du fabricant pendant 20 secondes à 5,5 mètres par seconde. Placez ensuite les tubes sur de la glace fondue pendant une minute. Répétez l’opération six fois au total pour vider la centrifugeuse des protéines extraites pendant 15 minutes à 15 000 tr/min à quatre degrés Celsius.

Ensuite, pour préparer un échantillon de l’extrait cellulaire entier ou WCE pour western blot et WCE correspondant à deux OD 600 unités de cellules à 800 microlitres d’acide trichloracétique à 20 % ou vortex TCA à mélanger. Pour purifier un échantillon de WCE transparent à 50 à 100 microlitres de résine d’affinité dans un nouveau tube de micro-centrifugation, lavez et équilibrez la résine en ajoutant un millilitre de tampon de lavage et inversez le haut sur le bas jusqu’à ce que la résine soit remise en suspension. Après avoir essoré pendant une minute à 5 000 tr/min et quatre degrés Celsius, aspirez le surnageant pour lier la protéine pour la purification par affinité à 100 à 200 microlitres de lysat clair sur les billes lavées et utilisez un tampon de lyse pour porter le volume total à un millilitre.

Incuber avec mutation ou balancement à quatre degrés Celsius pendant deux à cinq heures. Utilisez de l’azote liquide pour congeler les aliquotes restantes de l’eau de l’eau de l’ouest et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à nouvel ordre, pendant que la solution de lysat de betterave est en cours d’incubation pour l’échantillon de transfert de Western de l’ECW sur de la glace. Après avoir essoré pendant deux minutes et demie à 15 000 tr/min à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant en prenant soin de retenir le granulé, ajoutez 800 microlitres de TCA à 2 % au granulé et tourbillonnez le tube avant de répéter le spin de deux minutes et demie.

Après avoir soigneusement décanté le surnageant, ajoutez 100 microlitres de tampon d’échantillon TCA et un vortex pour dissoudre la pastille avant d’incuber l’échantillon. Dans un bloc de chaleur de 100 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes, il faut une deuxième fois pour dissoudre complètement tous les restes de la pastille, qui peut être difficile à dissoudre et à stocker à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser. Une fois l’échantillon de billes de lysat incubé, après avoir essoré à 5 000 tr/min et quatre degrés Celsius pendant une minute, utilisez un tampon de lavage pour laver la résine cinq fois afin d’éluer les protéines.

Ajoutez 150 microlitres de tampon d’élution dans le mélange de résine à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner pendant une minute à 5 000 tr/min et quatre degrés Celsius et enregistrez le surnageant dans un nouveau tube. Enfin, préparer un échantillon pour le western blot à 25 microlitres de deux tampons d’échantillon de sulfate de sodium de lithium x avec deux microlitres de BME à 25 microlitres d’échantillon de protéine UD.

Comme le montre cette figure, une large gamme de protéines peut être extraite de manière reproductible des cellules de levure. Des bandes discrètes sur une gamme de poids moléculaires sont indicatives d’extraits de protéines de haute qualité. La qualité des extraits peut être confirmée par western blot pour des protéines spécifiques marquées à l’épitope.

Voici un résultat représentatif pour le galactose surexprimé V cinq marqué Sumo Ligase est celui qui migre à environ 120 kilodaltons. En général, les protéines partiellement dégradées se présentent sous la forme de plusieurs fragments en dessous du poids attendu, mais ici, seules les protéines de pleine longueur sont observées. De plus, les ajouts de poids moléculaire élevé d’une protéine donnée peuvent indiquer des modifications post-traductionnelles.

Par exemple, ici, vous pouvez voir le lactose sur le sumo exprimé lié à S un delta quatre 40 et un SIS pleine longueur. Comme le montre ce transfert de Western, des modifications peuvent également être préservées sur S one exprimé de manière endogène. Cette figure montre que deux protéines enrichies nucléaires, SLX five et CS one, delta quatre 40, ont été purifiées avec succès de notre ws.

Notamment, une protéine marquée à six sifflements peut être purifiée par affinité à partir de W’S, à la fois dans des conditions natives et dénaturantes. En revanche, SLX 5G ST et CS un delta quatre 40 ha n’ont pas d’épitope à six sifflements, mais dans des conditions natives, ils interagissent toujours avec la résine d’affinité métallique de manière sensible. Nous proposons que CIS one et dans une moindre mesure SLX five soient capables de lier la résine d’affinité métallique via leur domaine cyclique de coordination métallique.

Bien qu’à notre connaissance, ce phénomène particulier n’ait pas encore été rapporté, une situation similaire a été décrite dans laquelle la sous-unité B de la toxine cholique se lie à la résine d’affinité Nicola d’une manière médiée par ses résidus naturels d’histamine. Cette observation suggère que les protéines de l’ECER, au moins en partie, se sont repliées nativement pour l’étude de la fonction des protéines. Il est important de montrer que les complexes protéiques restent intacts dans les extraits de cellules entières.

Des données représentatives ont révélé que CS un, un delta quatre, 40 SLX cinq, et P GK un, une protéine cytosolique qui sert de contrôle de charge, étaient présents dans WS cis one. Delta 40 a été purifié à partir de ces extraits en raison de sa capacité inhérente à se lier aux résines d’affinité métallique. De plus, lorsque SLX cinq et SIS un étaient co-exprimés dans les cellules de levure, les niveaux de SLX cinq dans les EITs ont été augmentés, ce qui soulève la possibilité que SLX cinq puisse interagir avec SIS un.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et de traiter les cellules de levure afin d’extraire, de purifier et de visualiser les protéines de levure dans des conditions natives.