Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Ce protocole utilise un promoteur régulable qui permet l’expression contrôlée des protéines. Dans cette expérience, nous utilisons un plasmide à haute densité de deux microns qui exprime le domaine N deux d’un promoteur répressible de méthionine. Les cellules de levure de type sauvage sont transformées avec cela.

Le plasmide et les transformants sont sélectionnés sur des plaques dépourvues d’uol. Après la croissance pendant la nuit. Dans les milieux sélectifs, les cellules sont synchronisées par aucune croissance médiée par le cortisol. Arrestation.

Enfin, l’expression est induite par le transfert de cellules dans des milieux dépourvus de méthionine au cours de l’expérience au cours de l’expérience. La concentration en protéines est surveillée par western blot et le développement du phénotype morphologique par microscopie. Bonjour, je m’appelle Claudia et je travaille au Département des sciences biologiques de l’Université Purdue.

Je suis de Bari Muji dans l’alar et je suis aussi dans le laboratoire AL. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’analyse du développement d’un phénotype morphologique en fonction de la concentration en protéines dans l’induction corporelle. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les aspects morphologiques et moléculaires d’un phénotype de division cellulaire observé lors de la surexpression du domaine N deux de la protéine adaptative endocytaire absente deux.

Alors commençons. Ce protocole commence par la construction d’une souche de levure qui exprimera la protéine qui vous intéresse. Dans notre cas, nous avons transformé la souche de levure de type sauvage W 3 0 3 avec une copie élevée de l’ADN plasmatique qui contient n° deux sous le contrôle du promoteur répressible de la méthionine, deux suppressions millimolaires de la méthionine ont rencontré 25 activité du promoteur.

Bien que les milieux dépourvus de méthionine permettent une expression maximale, prélevez six colonies dans une plaque contenant des cellules récemment transformées et inoculez dans 50 millilitres de milieux sélectifs avec 0,2 millimolaire de méthionine dans un flacon conique, incubez pendant la nuit à 30 degrés Celsius en agitant à 200 tr/min le lendemain matin. Estimez la densité cellulaire en mesurant la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Transférez l’équivalent de 20 OD 600 nanomètres par millilitre de cellules dans un tube à centrifuger stérile et récoltez par centrifugation.

Remettre en suspension les cellules dans le milieu YPD par vortex pour synchroniser le cycle cellulaire aole à une concentration finale de 15 microgrammes par millilitre à partir d’un stock d’un milligramme par millilitre dans le DMSO. Incuber pendant quatre heures à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Après quatre heures, vérifiez le pourcentage de cellules arrêtées en mitose.

En regardant au microscope et en comptant le nombre de cellules avec des bourgeons de taille égale, passez à l’étape suivante. Seulement si l’arrêt est supérieur à 90 %Récoltez les cellules par centrifugation à 2200 tr/min pendant cinq minutes. Après trois lavages à l’eau glacée, résume, suspend la pastille dans un milieu sélectif dépourvu de méthionine à une densité cellulaire d’environ 0,5 OD 600 nanomètres par millilitre.

Transférez la moitié du volume de cellules dans un nouveau tube stérile et ajoutez de la méthionine à une concentration finale de 0,2 millimolaire. Cela servira de contrôle des effets dus aux niveaux basaux d’expression des protéines. Remettez les deux cultures dans l’incubateur à 30 degrés Celsius.

Les cellules sont analysées pour le développement du phénotype toutes les heures pendant six heures à chaque fois. Point Transférez un millilitre de suspension cellulaire de chaque culture dans un tube de micro-fuge stérile et récoltez les cellules par centrifugation, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 70 microlitres de milieu. Ajoutez ensuite 30 microlitres de bleu de méthylène à partir d’un stock d’un milligramme par millilitre dans de l’eau stérile.

Ensuite, pipetez environ six microlitres de cette suspension sur une lame de verre propre et placez une lamelle sur la goutte. Appuyez doucement sur la lamelle pour former une fine couche uniforme de cellules entre les interfaces en verre. Divisez la couverture en neuf quadrants et prenez trois images par quadrant.

Le nombre de cellules par champ ne doit pas dépasser 30 cellules pour permettre une quantification précise. Comptez le nombre de cellules présentant le phénotype à l’étude, qui dans cet exemple sont des cellules de levure bourgeonnantes avec des bourgeons allongés et/ou concaténés qui ne se séparent pas les uns des autres. On compte également le nombre de cellules mortes identifiées par leur couleur bleue depuis le défaut de division cellulaire induit au nième rang.

Deux surexpressions conduisent à la mort cellulaire pour visualiser à tout moment des défauts spécifiques au phénotype. Pointez un millilitre de culture dans un tube de micro-fuge stérile et récoltez les cellules par centrifugation reus. Mettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres d’un milligramme par millilitre, solution blanche calor dans de l’eau stérile et incubez pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité.

La coloration au blanc calcique permet de visualiser la paroi des cellules e. Lavez la pastille trois fois avec un XPBS. Nous suspendons le granulé final dans 100 microlitres de PBS.

Observez les cellules au microscope et acquérez des images à un grossissement de 100 x à l’aide de l’optique UV pour visualiser la paroi cellulaire. Pour visualiser des images d’acquisition de septine marquées GFP à l’aide d’un filtre FS E, quantifiez le pourcentage de cellules présentant des défauts de paroi cellulaire et une mauvaise localisation de la septine à l’aide de la méthode montrée précédemment en divisant la lamelle en neuf quadrants et en prenant trois images par quadrant pour compter les vidéos TimeLapse. La microscopie de cellules de levure uniques nécessite des lits agros intégrés dans des milieux pour fabriquer un lit agros.

Nettoyez d’abord une lame de verre avec une dépression concave avec 70 % d’alcool et laissez-la sécher à l’air libre pendant que la diapositive sèche à l’air. Faites bouillir 0,06 gramme d’agros dans cinq millilitres de milieu sélectif dépourvu de méthionine au micro-ondes jusqu’à ce que l’agros se dissolve complètement rapidement. Pipette de 200 microlitres de l’agros contenant des milieux dans la lame.

Dépression et renverser un autre verre propre glissez dessus, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est piégée en dessous. Lorsque le gel se solidifie, déplacez doucement la lame sur le dessus pour l’éloigner de la diapositive de dépression, en gardant leurs surfaces parallèles en tout temps. Cela garantit que la surface du lit agros affleure la surface du toboggan de dépression.

Nettoyez la zone de glissement entourant le lit d’agros avec un chiffon délicat. La diapositive est maintenant prête à être utilisée à quatre heures. Transférez un millilitre de cellules de la culture dans un tube de micro-fuge stérile et récoltez par centrifugation.

Aspirez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de milieux sélectifs frais dépourvus de méthionine. Appliquez de la vaseline sur les bords de la lamelle. Placez ensuite une goutte de suspension cellulaire au centre du lit agros et étalez-la uniformément en appuyant doucement une lamelle de couverture dessus.

Scellez les bords de la lamelle et fixez sa position en doublant les bords de vernis à ongles. Une fois que le vernis à ongles est sec, placez la lame sur une platine chauffée d’un microscope. Nous utilisons un microscope Zeiss Axio 200 M équipé d’un camm Zeiss Axio, d’un appareil photo numérique monochrome MRM pour choisir un champ qui ne contient pas plus de 10 cellules espacées de manière adéquate, car le champ sera encombré avec le temps.

Au fur et à mesure que les cellules se divisent, prenez une image du champ toutes les cinq minutes pendant environ cinq heures. Afin d’éviter de réajuster la mise au point à plusieurs reprises. Nous programmons le logiciel d’acquisition d’images pour qu’il acquière automatiquement quelques images Zack à chaque instant donné.

L’image avec la meilleure mise au point sera sélectionnée plus tard pour l’assemblage du film afin d’assurer une chaleur adéquate pour les cellules, une source de chaleur externe en plus des étages chauffants fournis en laissant la lumière blanche transmise du microscope allumée pendant toute la durée de la régression phénotypique de l’imagerie peut être étudiée en assemblant les images dans un film à l’aide du logiciel Image J. Ici, nous montrons des résultats représentatifs de la surexpression de notre protéine d’intérêt. Nième deux.

Tout d’abord, l’expression protéique du nième deux. Au cours de l’expérience, il a été déterminé que les lysats de cellules exprimant HA nth deux ont été analysés par western blot à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-HA, comme le montrent les cellules immuno-blot cultivées en présence de 0,2 millimolaire de méthionine ayant une expression protéique minimale. Cependant, les cellules cultivées dans des milieux dépourvus de méthionine montrent une augmentation constante de la concentration de S deux au cours de l’expérience.

Ensuite, des cellules cultivées en présence ou en absence de méthionine pendant six heures ont été analysées, car une faible concentration de n-énième est incapable d’induire un phénotype de division cellulaire ou seulement la mort cellulaire. Un faible pourcentage de cellules sont mortes, comme l’indique leur couleur bleue après coloration au bleu de méthylène. De même, le nombre de noyaux par cellule, la paroi cellulaire et l’organisation de la septine sont normaux comme prévu.

En revanche, la surexpression de M deux conduit à un défaut massif de division cellulaire et à la mort cellulaire, comme le démontrent de longues chaînes de bourgeons allongés connectés qui conservent la couleur bleue lorsqu’ils sont colorés au bleu de méthylène. La plupart des cellules phénotypiques sont multinucléées, comme l’indique la coloration DPI. La coloration blanche calcior montre des accumulations de plaques anormales de la paroi cellulaire.

De plus, la septine est grossièrement mal localisée et désorganisée. La quantification du phénotype en fonction du temps est illustrée dans ce graphique où les cercles ouverts représentent zéro millimolaire de méthionine et les cercles fermés représentent 0,2 millimolaire de méthionine. Nous voyons ici qu’à mesure que la concentration de deux cellules s’accumule dans les cellules au fil du temps, le pourcentage de cellules présentant le phénotype de division cellulaire augmente également.

Cellules de contrôle cultivées à 0,2. Les milliméthionines montrent que le développement du phénotype est fonction d’une concentration élevée de protéines et non en raison des conditions de culture cellulaire. Enfin, le développement du phénotype lors de la surexpression des nième deux est capturé par vidéomicroscopie en accéléré.

Après quatre heures de nième, deux cellules de surexpression présentent un phénotype de division cellulaire morphologique léger. Au fur et à mesure que le film progresse, nous voyons des périodes anormales et prolongées de croissance des bourgeons apicals, donnant naissance à des bourgeons très allongés. Nous voyons également des événements de l’émergence de nouveaux bourgeons avant qu’un événement de séparation cellulaire n’ait eu lieu.

De plus, on observe que des bourgeons émergent de plusieurs régions de la cellule de la mère, donnant naissance à une branche à l’apparence. Nous venons de vous montrer comment caractériser et analyser le développement d’un phénotype morphologique en fonction de la concentration en protéines dans la liste de bourgeonnement. En effectuant cette procédure, il est important de ne pas oublier de caresser les cellules aux vitesses de centrifugation recommandées, car des vitesses plus rapides pourraient endommager les cellules.

Il est également important de ne pas oublier d’ajouter du bleu de méthylène et du chlorure juste avant l’imagerie, car ils sont toxiques pour les cellules de l’est. Alors merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.