Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Nous étudions comment les cellules en division transmettent fidèlement leurs chromosomes lors de la mitose, en nous concentrant sur les machines moléculaires et les mécanismes qui assurent une ségrégation chromosomique précise. Nous synchronisons les cellules pour étudier les processus moléculaires qui évoluent avec le cycle cellulaire. Sans ces méthodes, les changements clés seraient cachés dans une population cellulaire non synchronisée.

Comparé à d’autres méthodes de synchronisation, l’arrêt par facteur alpha chez les mutants BAR1 offre un arrêt G1 plus propre et réversible, nous permettant de suivre l’évolution synchrone d’une culture de levure dans le cycle. Nos travaux révèlent la localisation dynamique des protéines et les changements d’activité tout au long du cycle cellulaire, éclairant des processus mitotiques clés, tels que la ségrégation des chromosomes et le maintien du fuseau. Pour commencer, inoculez la levure dans 25 millilitres de milieu YPAD, puis incubez toute la nuit pour atteindre une densité optique de 600 nanomètres comprise entre 0,5 et 2,0.

Diluez les cellules de levure à une densité optique de 600 nanomètres de 0,5. Ajoutez le facteur alpha à la culture pour atteindre une concentration finale d’un microgramme par millilitre. À 2,5 à 3,5 heures après l’ajout du facteur alpha, comptez le pourcentage de cellules non bourgeonnées au microscope pour évaluer l’arrêt cellulaire.

Ensuite, centrifugez la culture à 3 000 g pendant trois à cinq minutes à 23 degrés Celsius. Versez soigneusement le surnageant pour enlever le facteur alpha. Reposez la pellete cellulaire dans 25 millilitres de YPAD contenant 1 % de sulfoxyde de diméthyle pour laver les cellules.

Transférez la granule cellulaire dans un tube neuf et répétez les lavages deux fois de plus, pour un total de trois lavages afin d’éliminer tout facteur alpha résiduel. Ensuite, ajoutez du YPAD aux cellules lavées pour porter le volume final à 25 millilitres, puis transférez la suspension dans une nouvelle fiole pour une incubation ou une utilisation ultérieure. Prélever l’échantillon à zéro minute juste après la sortie et fixer l’échantillon.

À 60 minutes après la libération, évaluez la synchronie de la population cellulaire au microscope optique. Si désiré, ajoutez à nouveau le facteur alpha à 60 minutes après la libération à une concentration finale d’un microgramme par millilitre pour bloquer la progression vers le cycle cellulaire suivant. Continuez à collecter des échantillons temporels toutes les 15 minutes jusqu’à 180 minutes ou aussi longtemps que nécessaire.

Pour fixer les cellules de levure, centrifugez un millilitre de culture pendant une minute à vitesse maximale. Aspirez complètement le surnageant. Ensuite, remettez le pellet en suspension dans 500 microlitres de solution fixative et faites couver à 23 degrés Celsius pendant deux à quinze minutes.

Après centrifugation des cellules fixes, aspirez le surnageant et resuspendez le pellet dans 500 microlitres de tampon phosphate de potassium 0,1 molaire à pH 6,4. Avant l’imagerie, centrifugez les cellules fixes à 23 degrés Celsius pendant une minute à vitesse maximale. Une fois le surnageant aspiré, resuspendez le pellet dans 10 à 100 microlitres de solution Triton, DAPI et sorbitol.

Pipette environ 0,8 microlitres de la suspension à cellules colorées directement au centre d’une couche de couverture propre. Utilisez une pointe de pipette pour étaler doucement la gouttelette dans une zone circulaire d’environ un centimètre carré. Placez la gaine de couverture sur une lame de microscopie.

À l’aide d’un kimwipe, pressez doucement autour des bords de la housse pour répartir uniformément l’échantillon. Ensuite, scellez les bords de la gaine avec du vernis à ongles pour fixer l’échantillon. Apportez la lame préparée à un microscope équipé d’un grossissement de 60 fois, d’un objectif d’immersion à l’huile à ouverture numérique de 1,42, ainsi que d’un ensemble laser et filtre rouge, vert, bleu et rouge lointain.

Concentrez le microscope sur les cellules de levure collées à la houle. Une fois la mise au point, ajustez les réglages d’exposition pour chaque canal de fluorescence afin d’obtenir un rapport signal/bruit d’au moins trois pour un. Ajustez les paramètres d’acquisition pour collecter 14 à 20 images z-stack, chaque tranche étant espacée de 0,2 micromètre, couvrant une profondeur z totale de deux à quatre micromètres.

Sur les microscopes équipés de modules de post-traitement, sélectionnez les options de Déconvolution et de Projection Rapide pour chaque image de la pile z. Acquérir des z-stacks de l’échantillon, capturant suffisamment d’images pour enregistrer environ 100 à 200 cellules de levure pour chaque condition expérimentale ou moment donné. Pour analyser, ouvrez les images projetées dans le logiciel ImageJ.

Ajustez la luminosité et le contraste de chaque canal de fluorescence pour améliorer la visibilité. Pour analyser la progression du cycle cellulaire, comptez 100 cellules pour chaque moment et classez-les comme contenant un ou deux noyaux. Pour calculer le pourcentage de cellules affichant Stu2-GFP puncta, standardisez les réglages de luminosité du canal vert sur toutes les images.

Cellules de comptage montrant des points Stu2-GFP qui co-localisent avec les points Spc110-mCherry comme positifs pour la localisation du kinétochore. Ensuite, pour quantifier l’intensité des points protéiques, utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimiter la région d’intérêt autour du signal. Ajoutez la sélection au Gestionnaire de Régions d’Intérêt en appuyant sur T ou en choisissant l’option dans le menu Gestionnaire de ROI.

Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur Mesurer pour calculer l’intensité du puncta. Pour visualiser les changements au fil du temps, tracez l’intensité moyenne avec des intervalles de confiance à 95 % pour chaque moment chronologique. Comptez environ 100 cellules par condition.

Dans les cellules arrêtées par G1, Stu2-GFP s’est localisée sur un seul point proximal du pôle du fuseau avec un signal dispersé supplémentaire le long des microtubules cytoplasmiques. 60 minutes après la sortie, Stu2-GFP s’est localisé sous deux points adjacents à des poteaux de broche dupliqués marqués par Spc110-mCherry. Au bout de 90 minutes, pendant l’anaphase, Stu2-GFP apparaissait à la fois près des pôles de la broche et le long des microtubules couvrant l’axe unique.

Après la sortie mitotique, à 120 minutes, Stu2-GFP réapparaissait sur les microtubules astraux du cytoplasme. La quantification a révélé que l’intensité de Stu2-GFP près des pôles du fuseau a augmenté lors de la mitose précoce, atteignant un pic avant l’anaphase et a diminué par la suite. Le pourcentage de cellules binucléées a atteint un pic d’environ 90 minutes, indiquant une entrée synchronisée en anaphase.