Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

L’objectif global de cette procédure est de développer une stratégie simple et efficace pour immobiliser toute protéine d’intérêt sur des hydrogels de poly acrylamide afin de contrôler indépendamment divers paramètres du microenvironnement cellulaire. Pour ce faire, la solution protéique est d’abord étalée sur la surface du tampon PDMS. La deuxième étape consiste à sécher soigneusement la surface structurée du tampon PDMS avec un flux constant d’azote gazeux de haute pureté.

Ensuite, le tampon revêtu de protéines est placé avec une surface structurée en contact avec la surface de l’hydrogel séché et de brefs points de pression sont appliqués sur le dessus du tampon PDMS pour assurer un bon contact entre les micro-caractéristiques du tampon et la surface de l’hydrogel, la dernière étape consiste à retirer délicatement le tampon PDMS de la surface de l’hydrogel et à nettoyer le tampon après l’élimination des zones non imprimées. Avec BSA, les cellules peuvent être installées sur la surface de l’hydrogel à micro-motif. En fin de compte, un microscope à fluorescence inversée est utilisé pour observer les micro-caractéristiques des protéines.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transduction mécano, telles que la contribution relative des propriétés de la matrice extracellulaire, par exemple, la rigidité, la densité cellulaire des ligons ou la nature des protéines. Dans le processus de transaction ano, il est recommandé que cette procédure soit effectuée dans une hotte chimique. Commencez par placer des lamelles circulaires en verre de 25 millimètres de diamètre dans une boîte de Pétri et étalez-y une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire pendant cinq minutes.

Retirez la solution d’hydroxyde de sodium et immergez complètement les lamelles dans le DD H2O stérile, basculez-les doucement pendant 20 minutes sur une plaque à bascule, égouttez les DDH stériles deux O, ajoutez plus de DDH deux O stériles pour immerger complètement les lamelles et basculez doucement pendant encore 20 minutes. Retirez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri. Avec le côté activé vers le haut, sec, le couvercle s’enroule avec un flux constant d’azote gazeux de haute pureté.

Une fois que les lamelles sont sèches, ramenez-les dans le capot de culture stérile et étalez une fine couche de trois triméthylpropylpropyl acrl sur le côté activé de chaque couvercle. Glisser pendant une heure après une heure. Lavez abondamment les lamelles en verre avec du DD H2O stérile.

Plongez ensuite les lamelles dans du DD H2O stérile dans une nouvelle boîte de Pétri. Scellez la boîte de Pétri avec un film para et placez-la sur une plaque à bascule sous une légère agitation pendant 10 minutes. Enfin, utilisez une pince à épiler stérile à pointes fines pour transférer les lamelles du DDH deux O vers une nouvelle boîte de Pétri.

Avec la face vers le haut activée. Couvrez le plat d’une feuille d’aluminium pour éviter que la poussière ne colle aux lamelles et conservez-le à température ambiante dans un endroit sec. Pour commencer cette procédure, préparez cinq millilitres d’une solution stérile d’hydrogel d’hydroxy poly acrylamide et 100 microlitres d’une solution fraîche à 10 % d’ammonium par solution de sulfate.

Comme décrit dans le texte du protocole, ajouter 2,5 microlitres de tétraméthylène diamine et 25 microlitres de solution sulfatée d’ammonium à la solution d’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide. Pour amorcer la polymérisation, mélanger la solution par trois pipetages successifs sans introduction de bulles dans des conditions stériles sous un capot stérile, placer une goutte de 25 microlitres de la solution d’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide sur une lamelle circulaire de 25 millimètres et placer immédiatement une lamelle circulaire en verre de 22 millimètres sur la gouttelette pour presser la solution d’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide. La lamelle en verre de 22 millimètres a été préalablement activée par une exposition de sept minutes dans un nettoyant à l’ozone UV.

Centrez la lamelle de protection en verre à l’aide d’une pince à épiler stérile et lissez les bulles. Laissez l’hydrogel d’hydroxy poly acrylamide polymériser à température ambiante pendant 15 minutes. Inversez manuellement la solution d’hydrogel d’hydroxy poly acrylamide restante dans le tube.

Pour suivre la fin du processus de polymérisation, immergez complètement les lamelles avec du D DH stérile deux o. Séparez soigneusement la lamelle en verre de 22 millimètres en insérant le bord d’une lame de rasoir entre la lamelle de verre de 22 millimètres et la couche d’hydrogel hydroxy poly acrylamide. Lavez l’hydrogel d’hydroxy poly acrylamide trois fois avec du PBS stérile et laissez le gel complètement immergé dans du PBS stérile pour maintenir l’hydratation.

Les micro-tampons en polydiméthyl soane ou PDMS utilisés dans cette procédure ont été fabriqués comme décrit dans le protocole de texte. Placez les micro-tampons PDMS dans une solution d’eau à 50 à 50 éthanol et sonicate pendant 15 minutes. Séchez les timbres avec une vapeur d’azote et placez-les dans un nettoyant à l’ozone UV pendant sept minutes.

Sous une hotte stérile, placez une goutte de 150 microlitres d’une solution protéique souhaitée sur la surface microstructurée de A-P-D-M-S. Le tampon FI nin est utilisé dans cette démonstration. Étalez la solution protéique sur la surface du tampon en la déplaçant avec une pointe de pipette stérile vers chaque coin du tampon.

Laissez la solution protéique absorber sur le tampon PDMS pendant 60 minutes. Sous cette hotte stérile, éteignez les lampes pour éviter d’endommager les protéines. Ensuite, transférez les lamelles recouvertes d’hydrogel hydroxypolyacrylamide dans une nouvelle boîte de Pétri.

Éliminez l’excès de PBS de la surface des substrats d’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide avec le faible flux d’azote dans des conditions stériles. Arrêtez la procédure. Dès qu’aucun signe d’eau stagnante sur la surface du gel n’est observé.

Le gel ne doit pas être complètement séché à ce stade. Séchez soigneusement la surface structurée du tampon PDMS avec un flux constant d’azote gazeux de haute pureté. Saisissez le tampon enduit de protéines à l’aide d’une pince à tissu de pansement et placez une surface structurée en contact avec la surface de l’hydrogel séché.

Appliquez de brefs points de pression avec la pointe de la pince à épiler sur le dessus du tampon PDMS pour assurer un bon contact entre les micro-caractéristiques du tampon et la surface de l’hydrogel, laissez le tampon PDMS sur la surface de l’hydrogel pendant une heure à température ambiante après une heure. Retirez délicatement le tampon PDMS de l’hydrogel d’hydroxy poly acrylamide avec une pince à tissu de pansement et nettoyez le tampon en forniquant dans une solution d’eau à l’éthanol pendant 15 minutes. Lavez abondamment l’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide estampé par trois échanges de PBS dans des conditions stériles pendant 10 minutes par échange.

Après le dernier lavage PBS, ajoutez une solution stérile de BSA et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sous une légère agitation sur une plaque à bascule. Cela permettra d’éliminer les zones non imprimées le lendemain. Lavez abondamment l’hydrogel d’hydroxypolyacrylamide estampé par trois échanges de PBS dans des conditions stériles pendant 10 minutes par échange.

Les hydrogels d’hydroxy poly acrylamide estampés peuvent être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Les résultats montrent une corrélation linéaire entre l’évolution de la rigidité des hydrogels d’hydroxypolyacrylamide et la quantité de réticulation de l’acrylamide bis. Les images fluorescentes de micro-motifs rectangulaires stratifiés déposés sur des hydrogels d’hydroxypolyacrylamide de trois rigidités différentes démontrent l’ajustement indépendant de la géométrie des micromotifs et de la rigidité de la matrice. La densité du ligand cellulaire peut être modulée en faisant varier la concentration de la solution protéique utilisée pour incuber les tampons PDMS.

Voici deux images fluorescentes provenant d’impressions séquentielles par micro-contact. Bandes de fibronectine en rouge et de laminine en vert, croisées à 90 degrés et bandes de fibrine, de laminine et de collagène micro-imprimées séquentiellement sur un substrat d’hydrogel hydroxy poly acrylamide de 25 kiloscal. Lorsque les cellules primaires ont été plaquées sur des surfaces hydrogel hydroxy poly acrylamide à revêtement homogène et à micro-motif, la viabilité cellulaire était d’au moins 80 % jusqu’à trois jours après le placage.

Il a également été observé que les cellules prolifèrent davantage sur les substrats rigides que sur les substrats mous. Lorsqu’ils sont plaqués sur des micro-motifs rectangulaires enrobés de fibronectine déposés sur des hydrogels d’hydroxy poly acrylamide de trois rigidités différentes. Les cellules endothéliales primaires présentent une faible densité de fibres d’actine et un noyau arrondi sur le mou.

Les substrats sur des substrats plus rigides, les fibres d’actine sont plus droites et plus épaisses et le noyau est déformé après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transduction mécanique pour explorer le rôle individuel des paramètres des microenvironnements cellulaires dans un large éventail de systèmes cellulaires tels que les cellules primaires ou souches, au niveau tissulaire, dans les organismes modèles, dans la mode, dans la démographie ou dans les systèmes organiques.