Multiwell Rigidité Essai pour l'étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

L'objectif général de cette procédure est de permettre une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide sous forme de plaque multipuits. Cette méthode consiste d'abord à intercaler la solution précurseur du gel entre une plaque de verre revêtue d'un revêtement hydrophobe et un support souple en plastique adhésif à l'acrylamide. La deuxième étape consiste à détacher le gel de la plaque de verre, auquel il s'est covalemment fixé via le support souple en plastique après polymérisation, puis à le laisser sécher.

Ensuite, le gel sec et le support plastique souple sous-jacent sont découpés selon les formes souhaitées et collés, côté plastique vers le bas, sur le fond des puits d'une plaque multi-puits ou tout autre récipient pour culture cellulaire. La dernière étape consiste à recouvrir les gels de polyacrylamide assemblés dans la plaque multi-puits d'un revêtement adhésif pour cellules, tel qu'une monocouche de collagène de type I. Finalement, la microscopie ainsi que d'autres techniques de caractérisation cellulaire sont utilisées pour observer l'effet du substrat de polyacrylamide sous-jacent.

En particulier, sa rigidité sur les comportements cellulaires. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de manipuler n'importe quelle rigidité et épaisseur de gels de polyacrylamide, ainsi que leur assemblage dans un format de plaque multi-puits, de manière peu coûteuse et efficace en termes de temps, ce que n'offrent pas les autres méthodes. La démonstration de la procédure sera effectuée par un étudiant de mon laboratoire.

Préparez d'abord la solution précursrice de gel de polyacrylamide en mélangeant de l'acrylamide, l'agent de réticulation bis-acrylamide et de l'eau déionisée. Dissolvez le Sul OPA dans le diméthylsulfoxyde à une concentration de 50 milligrammes par millilitre. Répartissez 20 microlitres de la solution mère dans 10 tubes de microcentrifugation. Ensuite, congélez rapidement les solutions dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, dissoudre le persulfate d'ammonium dans de l'eau déionisée afin d'obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium de 10 % poids par volume. Ajouter 25 microlitres de la solution de persulfate d'ammonium dans 10 tubes de microcentrifugation et les conserver à moins 20 degrés Celsius. Préparer une solution de collagène à 0,2 milligramme par millilitre en diluant la solution mère de collagène de type I dans du PBS 1x à un pH de 7,4.

Toutes les solutions sont conservées sur de la glace jusqu'à leur utilisation. À ce stade, déposez quelques gouttes d'une solution hydrophobe sur une plaque de verre et utilisez du papier essuie-tout pour l'étaler sur toute la surface. Après avoir laissé sécher la plaque à l'air, passez de nouveau le papier essuie-tout pour uniformiser le revêtement hydrophobe.

Découpez un support en plastique souple afin qu'il corresponde à la taille de la plaque de verre revêtue de manière hydrophobe. Ensuite, marquez le côté hydrophobe du support en plastique souple en rayant légèrement la surface avec un outil pointu tel qu'un scalpel. Pour la préparation du gel, ajoutez 4972,5 microlitres de solution précurseur d'acrylamide de la concentration finale souhaitée dans un tube conique de 50 millilitres.

Placer le tube dans une chambre de dégazage pendant 30 minutes avec le bouchon ouvert. Ensuite, ajouter 25 microlitres de la solution de persulfate d'ammonium préparée précédemment à la solution de gel DGA afin d'obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium de 0,05 %. Puis ajouter 2,5 microlitres de TM me afin d'obtenir une concentration finale de TM ME de 0,5 %. Mélanger délicatement la solution en aspirant et en expulsant trois à cinq fois à l'aide d'une pipette. Ensuite, placer des entretoises en silicone de l'épaisseur souhaitée sur le côté hydrophile du support plastique flexible.

Ensuite, pipeter la solution de gel sur le support en plastique souple entre les entretoises et placer un objectif en verre recouvert d'un revêtement hydrophobe par-dessus. Après avoir laissé le gel polymériser pendant 45 minutes, retirer délicatement le support en plastique souple avec le gel de polyacrylamide covalent qui y est fixé, puis placer le gel, côté gel vers le haut, à l'air libre pour le sécher. Une fois sec, découper le gel de polyacrylamide selon les formes souhaitées.

Préparez environ 500 microlitres de polyméthylsoane par plaque de 96 puits selon les instructions du fabricant afin de coller les gels au fond d'une plaque multipuits. Déposez une petite goutte de polyméthylsoane au centre de chaque puits à l'aide de pinces. Placez un gel de polyacrylamide dans chaque puits, côté support plastique souple vers le bas.

Après polymérisation du polydiméthylsiloxane, déposer une petite quantité de l'échantillon de cellulose préparé précédemment dans chaque puits à l'aide d'une pipette de transfert, puis agiter latéralement pour recouvrir uniformément la surface du gel. Placer la plaque de puits sous une lampe à UV de haute intensité pendant cinq minutes. Une fois terminé, rincer les gels avec du PBS pour éliminer l'excès de cellulose.

À l’aide de cette pipette, introduire environ 50 microlitres de la solution de collagène de type I préparée précédemment dans chaque puits. Laisser le plateau couvert à température ambiante pendant au moins deux heures après un rinçage au PBS afin d’éliminer l’excès de solution de collagène. Stériliser les gels sous lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant deux heures.

Enfin, laissez tremper les gels dans du milieu complet toute la nuit afin de les hydrater et de les équilibrer. Utilisez les gels pour le semis cellulaire immédiatement ou conservez-les au réfrigérateur jusqu'à deux jours. Le module de Young en fonction de plusieurs concentrations d'acrylamide et de bis-acrylamide, désignées respectivement par A et B, est présenté ici comme prévu.

Le module de conservation G prime et le module de perte G double prime sont tous deux indépendants de la fréquence. Il a également été confirmé que le séchage puis la réhydratation des gels n'avaient aucun effet sur leur module de Young. En utilisant le réticulateur Sulo sampa, il est possible d'obtenir un revêtement uniforme de collagène sur des hydrogels de n'importe quelle rigidité.

Il a été observé que, lorsqu'elles étaient ensemencées sur des gels de polyacrylamide pendant 24 heures, les cellules de cancer du sein M-D-A-M-B 2 31 restaient rondes sur les gels mous de 0,5 et un kilopascal, mais étaient capables de s'étaler et de s'allonger sur le gel rigide de 100 kilopascals. De plus, les hydrogels fabriqués sur un support plastique flexible sont transparents et permettent une visualisation aisée ainsi qu'une microscopie facilitée. En outre, le support plastique flexible ne présente pas de fluorescence autofluorescente et n'interfère donc pas avec l'imagerie de cellules marquées par fluorescence.

La morphologie cellulaire a été davantage quantifiée en fonction de la surface totale d'expansion cellulaire et de la circularité cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler efficacement et à moindre coût des gels de polyamide dans un format de plaque multi-puits. Pour l'étude de la biologie cellulaire dépendante de la rigidité.