Name: Multiwell Rigidité Essai pour létude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Apprenez à préparer des gels de polyacrylamide en format multi-puits pour étudier les réponses cellulaires dépendantes de la rigidité. Cette méthode rapide et économique facilite la recherche en biologie cellulaire.

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Ce travail a été financé par des fonds de démarrage fournis à Silviya Zustiak par l’Université de Saint Louis ainsi que par une subvention du Fonds de recherche du président (PRF) accordée à Silviya Zustiak par l’Université de Saint Louis. Nous remercions Naveed Ahmed et Keval Shah pour leur assistance technique.

1. Préparation des solutions et des aliquotes hydrogel associés <ol><li> Préparation de la solution de précurseur de gel de polyacrylamide. <ol><li> Préparer la solution de précurseur de gel de Polyacrylamide en mélangeant acrylamide (A) (40% p / v, M 71,08 g / mol), le bisacrylamide de réticulation (B) (2% p / v, M 154,17 g / mol), et dé- de l&#39;eau ionisée dans les pourcentages en volume indiquées au tableau 1. REMARQUE: Ces solutions peuvent être préparés en grandes séries et stockées à 4 ° C pendant plusieurs mois. <ol><li> ATTENTION: L&#39;acrylamide est toxique par inhalation ou ingestion, en particulier, lorsqu&#39;il est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 40% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (&lt;23 ° C, une zone bien ventilée). </li><li> ATTENTION: Bis-acrylamide est toxique en cas d&#39;inhalation ou d&#39;ingestion, en particulier,lorsqu&#39;elle est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 2% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (&lt;4 ° C de la zone, bien ventilé). </li></ol></li></ol></li><li> La préparation et l&#39;utilisation de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrophénylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, M 492,40 g / mol) des parties aliquotes. ATTENTION: Sulfo-SANPAH provoque une irritation des yeux; Manipuler avec des gants et des lunettes bon ou de protection du visage. Conserver à -20 ° C dès réception et avant aliquotage. <ol><li> Pour stocker sulfo-SANPAH: dissoudre Sulfo-SANPAH dans dimethylsulfoxane (DMSO) à 50 mg / ml. Aliquoter la solution de stock en 50 micro-tubes de centrifugeuse de 20 pi par tube. Un gel rapide sur la glace sèche ou dans l&#39;azote liquide (une étape facultative mais préférée pour préserver l&#39;efficacité de réticulation maximum) et conserver à -80 ° C. REMARQUE: Les aliquotes can être stockés pendant plusieurs mois. </li><li> Pour utiliser sulfo-SANPAH: décongeler brièvement aliquote et diluer dans 480 pi d&#39;eau désionisée. Utiliser immédiatement. Sulfo-SANPAH hydrolyse rapidement dans l&#39;eau: donc prendre la prudence se acquitter de toutes les étapes ci-dessus rapidement. </li></ol></li><li> Préparation de persulfate d&#39;ammonium (M r 228,18 g / mol) des parties aliquotes. REMARQUE: persulfate d&#39;ammonium provoque yeux, la peau et les voies respiratoires. Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation. Manipulez la poudre de persulfate d&#39;ammonium dans une hotte chimique. Conserver la poudre dans un endroit sec, bien ventilé. Une fois aliquotes, la solution diluée peut être utilisé sur la table de travail. <ol><li> Dissoudre le persulfate d&#39;ammonium dans de l&#39;eau désionisée pour obtenir une concentration finale de persulfate d&#39;ammonium à 10% p / v. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Décongeler immédiatement avant l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Préparation de la solution de collagène de type I. <ol><li> Préparer 0,2 mg / ml solution collagène par dilution de la sorte1x lution dans du tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4. Stocker brièvement de glace ou utiliser immédiatement après dilution. </li></ol></li></ol> 2. Préparation d&#39;hydrogel (Voir Figure 1) <ol><li> Préparation des lames de verre hydrophobes. <ol><li> Placez quelques gouttes d&#39;une solution hydrophobe sur une plaque de verre et d&#39;utiliser du papier de soie se propager à travers la surface. Laissez sécher à l&#39;air et essuyer de nouveau avec un mouchoir en papier pour égaliser le revêtement hydrophobe. REMARQUE: solution hydrophobe magasin dans une armoire inflammable à RT. Porter un équipement de protection individuelle lors de la manipulation. Travailler dans un endroit bien ventilé. </li></ol></li><li> Préparation du support en matière plastique souple. <ol><li> Couper le support plastique flexible pour correspondre à la taille de la plaque de verre à revêtement hydrophobe. </li><li> Marquer le côté hydrophobe du support plastique flexible en grattant légèrement la surface avec un outil pointu comme un scalpel. NOTE: Une fois que le gel - qui est totalement transparent - sèche, Les rayures seront aider à distinguer de quel côté de support souple en plastique contient du gel. REMARQUE: Le support plastique flexible a une hydrophobe et un côté hydrophile. Une fois déposé, le polyacrylamide adhère de façon permanente sur le côté hydrophile du support plastique qui facilite la manipulation d&#39;hydrogel ultérieure facile. </li></ol></li><li> Préparation de gel (par exemple les volumes sont donnés pour des solutions de précurseur de gel de 5 ml). NOTE: 5 ml seraient suffisants pour produire ~ 40 gels lorsque le gel épaisseur initiale est de 0,5 mm. Plus gels peuvent être produits si l&#39;épaisseur du gel est réduite. <ol><li> Passer 4972,5 ul de solution de précurseur de polyacrylamide concentration finale désirée (tableau 1) dans un tube conique de 50 ml. Placez dans une chambre de dégazage pendant 30 min avec le couvercle ouvert. NOTE: L&#39;oxygène agit comme un piège à radicaux libres et lorsqu&#39;il est présent, il inhibe la polymérisation. </li><li> Ajouter 25 ul de 10% en poids / volume de persulfate d&#39;ammonium (voir point 1.3) pour obtenir un finaleconcentration en persulfate d&#39;ammonium à 0,05%. </li><li> Ajouter 2,5 pi de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, M 116,24 g / mol) à la solution dégazée de gel pour obtenir une concentration finale de TEMED 0,5%. NOTE: Magasin TEMED dans une armoire inflammable à RT. Manipuler dans une hotte chimique lorsque vous portez un équipement de protection individuelle approprié. Gardez bien fermé sous gaz inerte, car il est très sensible à l&#39;humidité et de l&#39;air. </li><li> Mélanger doucement la solution par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Ne vortex pour éviter la diffusion d&#39;oxygène dans la solution de précurseur de gel. </li><li> Pipeter la solution de gélatine sur le côté hydrophile du support en matière plastique souple et un sandwich avec lame de verre hydrophobe revêtu. Séparer les deux glissières par des entretoises de silicone d&#39;une épaisseur désirée (par exemple, 0,5 mm). Laisser une petite quantité (~ 100 pi) d&#39;une solution de précurseur de polymère dans le tube conique de 50 ml d&#39;utiliser comme indicateur de gélification. REMARQUE:Tout écartement pourrait être utilisé. Par exemple, une seule bande de Parafilm donne une épaisseur de gel gonflé finale de 100 - 120 um. </li><li> Placez une autre plaque de verre au sommet du sandwich en plastique souple support / gel pour assurer une surface plane hydrogel lors de la polymérisation. </li><li> Laisser polymériser le gel pendant 45 minutes, bien que moins de temps peut être utilisé pour des gels supérieur% en poids, si désiré. Pour se assurer que le gel a polymérisé, observer la solution restante dans le tube conique de 50 ml; si la solution restante a gélifié, alors il est probable que la gélification de la plaque de verre a été initié ainsi. Toutefois, notez que l&#39;ouverture prématurée de la moule empêcher la polymérisation complète. </li><li> Une fois que le gel est formé, décoller le support de plastique souple avec le gel de polyacrylamide attaché de manière covalente sur le dessus, et mettre gel côté-up sécher à l&#39;air. REMARQUE: convection ou séchage à la chaleur peuvent aussi être utilisés pour accélérer cette étape. Une fois séché sur le support en matière plastique souple, le gel peut être magasinD indéfiniment. <ol><li> Marquer des taches nues du support de plastique souple, où les gels de polyacrylamide ne font pas en raison de bulles. Mark tandis que le gel est encore hydratée car cela se fondre dans le support de plastique souple une fois que le gel est sec. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Assemblée Multiwell Plate, Collagène revêtement, et stérilisation <ol><li> Assemblage de plaque à puits multiples. <ol><li> Une fois séché, coupé gels PA dans des formes souhaitées. <ol><li> Pour une plaque de 96 puits, utilisez une perforatrice lourd de devoir avec un diamètre de ~ 6 mm. Utilisez un coupe-papier robuste pour couper gels dans des formes carrées ou rectangulaires. Sinon, utilisez des ciseaux. </li></ol></li><li> Préparer environ 500 ul de PDMS par plaque à 96 puits selon les instructions du fabricant. Pour coller les gels au fond d&#39;une plaque à puits multiples, placer une petite goutte (~ 5 pi) de polydiméthylsiloxane (PDMS) au centre de chaque puits. En utilisant des pinces, placer une polyacrylamidegel de e de chaque côté ainsi, flexible support en plastique vers le bas. Pour permettre PDMS pour guérir, laissez la plaque assemblée à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures. </li></ol></li><li> Collagène revêtement de gels de Polyacrylamide. <ol><li> Avec une pipette de transfert, placer une petite quantité (7-8 pi) de sulfo-SANPAH (se reporter au point 1.2.2) dans chaque puits et agiter de droite à gauche pour enrober la surface du gel uniformément. Travaillez rapidement depuis sulfo-SANPAH ne est pas stable dans l&#39;eau. </li><li> Placer la plaque de puits sous une lampe UV à haute intensité (intensité = 37 mW, λ = 302 à 365 nm) pendant 5 min. Rincer les gels avec du PBS pour éliminer sulfo-SANPAH excès. </li><li> Pipette 50 ul de 0,2 mg / ml de collagène de type I solution (voir point 1.4) dans chaque puits. Laissez la plaque couverte à température ambiante pendant au moins 2 heures ou O / N à 4 ° C. NOTE: Pour accélérer le processus de revêtement de collagène, une pipette de transfert peut être utilisé pour ajouter la solution de collagène. Typiquement, 1-2 gouttes de solution devrait être suffisant pour terminerly couvrent la surface du gel. </li><li> Laissez la plaque de puits à température ambiante pendant au moins 2 heures pour permettre la liaison de collagène. </li><li> Rincer avec du PBS pour éliminer l&#39;excès de solution de collagène et stériliser sous UV (λ = 200 nm) dans une hotte de culture tissulaire pendant 2 h. </li><li> Faire tremper les gels dans un milieu complet (voir la section 4.1 pour la composition du milieu) O / N pour hydrater et équilibrer. Utilisez pour la cellule ensemencement immédiatement ou conserver au réfrigérateur jusqu&#39;à 2 jours. </li></ol></li></ol> 4. cellulaire semis sur PA Rigidité Assay REMARQUE: Bien que typique de lignées cellulaires de mammifères communes, le protocole décrit dans cette section est utilisé spécifiquement avec le cancer du sein lignée cellulaire MDA-MB-231 (voir figures 4 et 5). <ol><li> Recueillir les cellules de flacon de culture de tissu par exposition à 5% de trypsine / EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Utilisez ~ 80 pi de trypsine / EDTA pour chaque cm 2 de la culture zone de ballon; par exemple, utiliser 2 ml de trypsine / EDTA fora T25 du ballon de culture de cellules. Remettre en suspension les cellules récoltées dans du milieu complet supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale souhaitée de la cellule. En tenant compte de temps de doublement cellulaire ainsi que la durée pendant laquelle les cellules sont ensemencées sur l&#39;analyse, choisir une concentration cellulaire appropriée sous-confluentes. Assurez-vous que moyen supplémentaire est suffisant pour submerger complètement les hydrogels. NOTE: Depuis les hydrogels ont été pré-équilibrée dans les médias (voir l&#39;étape 3.2.6) un volume de 100 pi devrait être suffisant. Des volumes de taille typiques utilisés pour les plaques multi-puits devraient être suffisants puisque les gels ont été pré-équilibrée dans du support dans l&#39;étape précédente. NOTE: Le test serait approprié pour tout type de fixation des cellules dépendant. <ol><li> Compter le nombre de cellules sous un microscope inversé en utilisant un hémacytomètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire dans chaque port de hémacytomètre et la moyenne du nombre de cellules à partir d&#39;au moins huit quadrants. Pour obtenir leconcentration cellulaire finale, il faut multiplier le nombre de cellules par 10 quatre. REMARQUE: Les meilleurs résultats de comptage cellulaire sont obtenus lorsque le nombre de cellules dans chaque quadrant de hématimètre est 20-50. </li></ol></li><li> Culture des cellules sur le test de rigidité PA dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 à 3 jours. Recueillir les cellules en cas de besoin par une exposition à 5% de trypsine / EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Utilisation ~ 80 pi de trypsine / EDTA par cm2 de flacon de culture tissulaire. Au cours de toutes les étapes de manipulation cellulaire, prenez soin de ne pas perturber la surface d&#39;hydrogel: aspirer ou moyen de pipette en inclinant légèrement la plaque à puits multiples sur le côté et de toucher la pointe de la pipette sur la paroi latérale de chaque puits, par opposition à toucher l&#39;hydrogel. REMARQUE: Sauf pour prendre soin de ne pas endommager la surface d&#39;hydrogel lors de la manipulation de culture tissulaire standard, les cellules ensemencées sur le test de rigidité peut être manipulé de la même manière que si elles ont été ensemencées surd&#39;une plaque multipuits régulière. </li></ol> 5. imagerie des cellules ensemencées sur PA Rigidité Assay <ol><li> cellules image directement sur le test de rigidité PA. NOTE: Toute microscope - inversé, fluorescent ou confocale, peut être utilisé pour l&#39;imagerie cellulaire. REMARQUE: Le support en matière plastique souple utilisée pour construire le test de rigidité est entièrement transparent et ne pas interférer avec ou autofluorescence imagerie cellulaire. Cependant, même si le support en matière plastique souple lui-même est transparente, des capacités d&#39;imagerie seront limités par la distance de travail de l&#39;objectif. Le support en matière plastique souple a une épaisseur de 0,23 mm et une distance de travail typique d&#39;un objectif 10X est ~ 4 mm, diminuant fortement pour des grossissements plus élevés. <ol><li> Pour l&#39;imagerie des cellules vivantes, la position PA rigidité test in support de plaque de microscope et l&#39;image. Les séances d&#39;imagerie sous 2 heures, ou utiliser un microscope équipé d&#39;une chambre environnementale des durées d&#39;imagerie. </li><li> Lorsque im de cellules vivantesvieillissement ne est pas l&#39;objectif, fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde 4% complété avec 0,1% de détergent. Faire tremper les cellules dans un fixateur à température ambiante pendant un minimum de 2 heures. Rincer deux fois avec PBS. Jeter les déchets fixateur dans un conteneur de déchets désignés. NOTE: Les cellules peuvent être visualisés immédiatement ou stockée immergés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique par inhalation et par contact. Manipuler avec des gants dans une hotte chimique. REMARQUE: Cellulaire protocole de fixation doit être choisi sur la base des protocoles de coloration de la cellule et la manipulation ultérieure, parce que certains fixateurs endommagent certaines protéines cellulaires. </li><li> Pour l&#39;imagerie de fluorescence, colorer les cellules avec tache de cellule souhaitée directement dans la plaque multi-puits fixée. Image immédiatement. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les gels de polyacrylamide, initialement mis au point pour l&#39;électrophorèse, 28 sont maintenant couramment utilisés comme substrats de culture cellulaire pour étudier les effets de la rigidité du substrat sur ​​la morphologie cellulaire, la motilité et la communication 3,24,29 parmi d&#39;autres caractéristiques de cellules. Polyacrylamide permet la manipulation de la rigidité du substrat pour englober la rigidité de l&#39;ensemble des tissus mous dans le corps (0,3 à 300 kPa) avec une</su...

La plupart des tissus dans le corps sont des matériaux visco-élastiques souples avec un module d&#39;Young allant de 0,1 kPa pour le cerveau de 100 kPa pour cartilage souple, encore, la plupart de la recherche sur les cellules in vitro est réalisée sur du polystyrène pour culture de tissus (TCP) qui a un module d&#39;environ 1 GPa . 1 Ce décalage de rigidité affecte grandement la façon dont les cellules répondent à leur environnement. Un nombre croissant d&#39;études est ainsi dédiée à élucider l&#39;effet de la rigidité du substrat sur ​​le sort de divers types de cellules, le 2,3 y compris des cellules souches. 4 En conséquence, plusieurs hydrogels ont été développés pour aider à la compréhension de la cellule de rigidité dépendante biologie, y compris polyacrylamide (PA), 5-7 polyéthylène glycol (PEG), 8,9 (PDMS), 10 et 11 alginate. Bien que la preuve que la rigidité du substrat a un impact considérable sur le sort de la cellule est de plus en plus, la plupart des études sont menées sur une petite échelle avec un petit nombre de sexemples. Systématiques, études multidimensionnelles sur l&#39;effet de la rigidité de substrat pour un éventail de types de cellules ou les conditions environnementales sont rares. 12 Plusieurs technologies d&#39;hydrogel à haut débit prometteuses ont été développées, y compris les microréseaux à base de PEG, 13 des dispositifs microfluidiques pour la production de microbilles d&#39;agarose d&#39;hydrogel, 14 ou des micro et nano-tiges où la rigidité est modulée par le diamètre et la hauteur des microrods. 15 Cependant , les technologies de préparer ces substrats sont sophistiqués et disponibles pour nombre limité de laboratoires. Beaucoup de recherches impliquant rigidité modulée réponses cellulaires utilise polyacrylamide (AP) gels qui ne sont pas seulement bon marché et simple à mettre en œuvre, mais présentent également une gamme physiologiquement pertinente de module de Young, à savoir 0,3 -. 300 kPa 16-22 Cependant, les méthodes existantes pour fabriquer PA gels pour la culture cellulaire sont de main-d&#39;œuvre et par conséquent prepARED en petits lots. Certaines des difficultés liées à la préparation de gels PA comme substrats de cellules souches de l&#39;exigence que les gels doivent être préparé: 1) en l&#39;absence d&#39;oxygène pour permettre la polymérisation complète, 2) avec une surface plane et lisse pour permettre cellulaire uniforme l&#39;attachement et la propagation, et 3) fixée en permanence au fond de la boîte de culture cellulaire pour empêcher flottante. Plusieurs groupes ont tenté de produire des gels PA pour la culture cellulaire en grandes séries. Semler et al. Les feuilles épaisses préparées de gels PA qui ont ensuite été &quot;coupée&quot; avec une perforatrice et placés dans des plaques à 96 puits. 23 Cependant, cette méthode est limitée à des gels sévères, ce est à dire,&gt; 1 kPa dans le module de Young, parce que plus doux gels sont &quot;collante&quot;, difficile à couper, et facilement endommagé. Mih et al. A développé une technique plus sophistiquée qui permet aux gels d&#39;être directement polymérisés dans une plaque à puits multiples à fond de verre. <sjusqu&#39;à&gt; 6 Ceci a été réalisé en versant les solutions de gel dans des plaques à fond de verre fonctionnalisés et former des gels par «sandwich» avec une gamme de lamelle personnalisé. 6 même si de légers effets très prometteurs, bord étaient encore observés avec cette technique. De plus, la technique nécessite un réseau conçu sur mesure pas immédiatement accessible à de nombreux laboratoires ainsi que des plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses. Cet article décrit un moyen simple et peu coûteux à assembler gels PA dans une plaque multi-puits qui pourrait être facilement adoptée par ne importe quel laboratoire. Ici, un support plastique flexible est utilisé, qui a deux côtés - un une hydrophobe, qui est répulsif pour gels PA, et un une hydrophile, qui se lie de manière covalente le gel PA lors du dépôt. Une fois les feuilles de gel PA sont déposés et permanente apposée sur le support plastique flexible, il permet une manipulation des gels de toute épaisseur ou la rigidité et les couper en toute forme souhaitée. Cette apprOach produit non seulement personnalisés &quot;lamelles&quot; en plastique de tailles pas autrement disponibles dans le commerce, mais évite également la nécessité de surfaces de verre-prétraiter, soit des lamelles de verre ou les puits de plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses, avec une solution de liaison PA, qui est un fastidieux et une étape de temps. Enfin, feuilles de gels uniformes PA peuvent être préparés en grandes séries et stockés de-hydraté pendant plusieurs mois. En résumé, l&#39;analyse présentée ici est une amélioration par rapport aux méthodes existantes dans plusieurs aspects. Premièrement, le processus de montage de la plaque à puits multiples est efficace, et le coût total des matériaux requis est faible. Deuxièmement, les hydrogels sont produites en grandes quantités dans un film de gel homogène unique. Enfin, seuls des matériaux qui sont disponibles dans le commerce sont tenus. L&#39;utilité de l&#39;essai est illustré par la découverte de l&#39;effet de la rigidité du substrat sur la morphologie cellulaire et la zone d&#39;étalement.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs</strong</td></tr><tr><td>>40 % Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2 % Bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type 1, à partir de la queue de rat, 3,68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Solution hydrophobe &#8212 ; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Détergent : Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 37 % Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kit de blocage de l’adhérence cellulaire à base de BSA &#8212 ; Kit de réseau d’adhérence cellulaire ECM</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>support en plastique flexible &#8212 ; Film GelBond PAG pour gels de polyacrylamide</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de verre</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td> 50 ml Tubes coniques Fisher Scientific 3181345107 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes coniques</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml : 02681258</td><td></td></tr><tr><td>plaque de 96 puits (fond plat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes jetables (1&nbsp ; ml, 2 ml, 5 nbsp ; ml, 10&nbsp ; ml, 25 ml, 50&nbsp ; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml : 13-678-11B, 2 ml ml : 05214038, 5 ml (FALCON) : 357529, 10&nbsp ; ml : 13-678-11F, 25&nbsp ; ML : 13-678-11, 50 po ml : 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4 » : 1367820A, 9 » :136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1-200&nbsp ; &#956 ; L, 101-1000&nbsp ; &#956 ; l)</td><td>Pipettes</td> de transfert jetables standard en plastique Fisher Scientific <td>2707509</td> 13-711-9D <td></td></tr> Fisher <tr><td></td><td>Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp ;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Gants d’examen non poudrés</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Entretoises en silicone &#8212 ; Feuille de silicone, 0,5 mm d’épaisseur/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Matériel de laboratoire grand/non jetable</fort></td></tr><tr><td>Microscope léger et fluorescent (Axiovert 200M)</td>Logiciel <td>de 3820005619</td><td></td>microscope <td>Zeiss</td></tr><tr><td></td><td></td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Four UV</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à vide/dégazeur</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide pour dégazeur</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture tissulaire</td><td>NUAIRE</td><td>NUAIRE NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hotte chimique</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé (Axiovert 25)</td><td>Incubateur 663526</td><td></td><td></td>Zeiss</tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

multiwell rigidité essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Actuellement, la plupart des recherches cellulaires in vitro sont effectuées sur du polystyrène de culture de tissus rigides (~1 GPa), tandis que la plupart des cellules du corps sont attachées à une matrice élastique et beaucoup plus molle (0,1 – 100 kPa). Étant donné qu’un tel décalage de rigidité affecte considérablement les réponses cellulaires, il existe un fort intérêt à développer des matériaux hydrogel qui couvrent une large gamme de rigidité pour servir de substrats cellulaires. Les gels de polyacrylamide, qui sont peu coûteux et couvrent la plage de rigidité de tous les tissus mous du corps, sont l’hydrogel de choix pour de nombreux groupes de recherche. Cependant, la préparation du gel de polyacrylamide est longue, fastidieuse et ne convient qu’aux petits lots. Ici, nous décrivons un test qui, en utilisant un film plastique flexible permanent comme support structurel pour les gels, permet la préparation de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits. La technique est plus rapide, plus efficace et moins coûteuse que les méthodes actuelles et permet de préparer des gels de tailles personnalisées qui ne sont pas disponibles autrement. Comme elle ne nécessite aucun équipement spécialisé, la méthode pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche et serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Polyacrylamide (AP) hydrogels sont largement utilisés pour tester les réponses cellulaires rigidité dépendante. 17,24 En mélangeant différentes concentrations d&#39;acrylamide (A) et bis-acrylamide (B) on peut faire gels PA qui couvrent la gamme de rigidité de la plupart des tissus mous le corps - 0,3 -.. 300 le module de kPa Jeune 1 Cependant, la préparation de gels de polyacrylamide est long et fastidieux, ce qui limite souvent leur utilité dans des applications «à haut débit» comme pour le dépis...

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

L'objectif général de cette procédure est de permettre une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide sous forme de plaque multipuits. Cette méthode consiste d'abord à intercaler la solution précurseur du gel entre une plaque de verre revêtue d'un revêtement hydrophobe et un support souple en plastique adhésif à l'acrylamide. La deuxième étape consiste à détacher le gel de la plaque de verre, auquel il s'est covalemment fixé via le support souple en plastique après polymérisation, puis à le laisser sécher.Ensuite, le gel sec et le support plastique souple sous-jacent sont découpés selon les formes souhaitées et collés, côté plastique vers le bas, sur le fond des puits d'une plaque multi-puits ou tout autre récipient pour culture cellulaire. La dernière étape consiste à recouvrir les gels de polyacrylamide assemblés dans la plaque multi-puits d'un revêtement adhésif pour cellules, tel qu'une monocouche de collagène de type I. Finalement, la microscopie ainsi que d'autres techniques de caractérisation cellulaire sont utilisées pour observer l'effet du substrat de polyacrylamide sous-jacent.En particulier, sa rigidité sur les comportements cellulaires. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de manipuler n'importe quelle rigidité et épaisseur de gels de polyacrylamide, ainsi que leur assemblage dans un format de plaque multi-puits, de manière peu coûteuse et efficace en termes de temps, ce que n'offrent pas les autres méthodes. La démonstration de la procédure sera effectuée par un étudiant de mon laboratoire.Préparez d'abord la solution précursrice de gel de polyacrylamide en mélangeant de l'acrylamide, l'agent de réticulation bis-acrylamide et de l'eau déionisée. Dissolvez le Sul OPA dans le diméthylsulfoxyde à une concentration de 50 milligrammes par millilitre. Répartissez 20 microlitres de la solution mère dans 10 tubes de microcentrifugation. Ensuite, congélez rapidement les solutions dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, dissoudre le persulfate d'ammonium dans de l'eau déionisée afin d'obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium de 10 % poids par volume. Ajouter 25 microlitres de la solution de persulfate d'ammonium dans 10 tubes de microcentrifugation et les conserver à moins 20 degrés Celsius. Préparer une solution de collagène à 0,2 milligramme par millilitre en diluant la solution mère de collagène de type I dans du PBS 1x à un pH de 7,4.Toutes les solutions sont conservées sur de la glace jusqu'à leur utilisation. À ce stade, déposez quelques gouttes d'une solution hydrophobe sur une plaque de verre et utilisez du papier essuie-tout pour l'étaler sur toute la surface. Après avoir laissé sécher la plaque à l'air, passez de nouveau le papier essuie-tout pour uniformiser le revêtement hydrophobe.Découpez un support en plastique souple afin qu'il corresponde à la taille de la plaque de verre revêtue de manière hydrophobe. Ensuite, marquez le côté hydrophobe du support en plastique souple en rayant légèrement la surface avec un outil pointu tel qu'un scalpel. Pour la préparation du gel, ajoutez 4972,5 microlitres de solution précurseur d'acrylamide de la concentration finale souhaitée dans un tube conique de 50 millilitres.Placer le tube dans une chambre de dégazage pendant 30 minutes avec le bouchon ouvert. Ensuite, ajouter 25 microlitres de la solution de persulfate d'ammonium préparée précédemment à la solution de gel DGA afin d'obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium de 0,05 %. Puis ajouter 2,5 microlitres de TM me afin d'obtenir une concentration finale de TM ME de 0,5 %. Mélanger délicatement la solution en aspirant et en expulsant trois à cinq fois à l'aide d'une pipette. Ensuite, placer des entretoises en silicone de l'épaisseur souhaitée sur le côté hydrophile du support plastique flexible.Ensuite, pipeter la solution de gel sur le support en plastique souple entre les entretoises et placer un objectif en verre recouvert d'un revêtement hydrophobe par-dessus. Après avoir laissé le gel polymériser pendant 45 minutes, retirer délicatement le support en plastique souple avec le gel de polyacrylamide covalent qui y est fixé, puis placer le gel, côté gel vers le haut, à l'air libre pour le sécher. Une fois sec, découper le gel de polyacrylamide selon les formes souhaitées.Préparez environ 500 microlitres de polyméthylsoane par plaque de 96 puits selon les instructions du fabricant afin de coller les gels au fond d'une plaque multipuits. Déposez une petite goutte de polyméthylsoane au centre de chaque puits à l'aide de pinces. Placez un gel de polyacrylamide dans chaque puits, côté support plastique souple vers le bas.Après polymérisation du polydiméthylsiloxane, déposer une petite quantité de l'échantillon de cellulose préparé précédemment dans chaque puits à l'aide d'une pipette de transfert, puis agiter latéralement pour recouvrir uniformément la surface du gel. Placer la plaque de puits sous une lampe à UV de haute intensité pendant cinq minutes. Une fois terminé, rincer les gels avec du PBS pour éliminer l'excès de cellulose.À l’aide de cette pipette, introduire environ 50 microlitres de la solution de collagène de type I préparée précédemment dans chaque puits. Laisser le plateau couvert à température ambiante pendant au moins deux heures après un rinçage au PBS afin d’éliminer l’excès de solution de collagène. Stériliser les gels sous lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant deux heures.Enfin, laissez tremper les gels dans du milieu complet toute la nuit afin de les hydrater et de les équilibrer. Utilisez les gels pour le semis cellulaire immédiatement ou conservez-les au réfrigérateur jusqu'à deux jours. Le module de Young en fonction de plusieurs concentrations d'acrylamide et de bis-acrylamide, désignées respectivement par A et B, est présenté ici comme prévu.Le module de conservation G prime et le module de perte G double prime sont tous deux indépendants de la fréquence. Il a également été confirmé que le séchage puis la réhydratation des gels n'avaient aucun effet sur leur module de Young. En utilisant le réticulateur Sulo sampa, il est possible d'obtenir un revêtement uniforme de collagène sur des hydrogels de n'importe quelle rigidité.Il a été observé que, lorsqu'elles étaient ensemencées sur des gels de polyacrylamide pendant 24 heures, les cellules de cancer du sein M-D-A-M-B 2 31 restaient rondes sur les gels mous de 0,5 et un kilopascal, mais étaient capables de s'étaler et de s'allonger sur le gel rigide de 100 kilopascals. De plus, les hydrogels fabriqués sur un support plastique flexible sont transparents et permettent une visualisation aisée ainsi qu'une microscopie facilitée. En outre, le support plastique flexible ne présente pas de fluorescence autofluorescente et n'interfère donc pas avec l'imagerie de cellules marquées par fluorescence.La morphologie cellulaire a été davantage quantifiée en fonction de la surface totale d'expansion cellulaire et de la circularité cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler efficacement et à moindre coût des gels de polyamide dans un format de plaque multi-puits. Pour l'étude de la biologie cellulaire dépendante de la rigidité.

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L'effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être...

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Cette vidéo présente un test permettant d’étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) sur l’infection bactérienne des cellules adhérentes. Des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, recouverts de collagène, sont superposés dans une plaque multi-puits pour imiter la rigidité de l’ECM physiologique. Lors de la superposition de cellules endothéliales humaines sur les hydrogels et de l’infection des cellules avec des bactéries Listeria monocytogenes conçues pour...

Un test pour étudier l’impact de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’infection bactérienne

Cette vidéo présente la microscopie quantitative time-lapse pour évaluer la dissémination de Listeria monocytogenes dépendante de la rigidité de la matrice extracellulaire à travers les cellules endothéliales. Un hydrogel plus mou facilite une dissémination bactérienne plus rapide à travers les cellules endothéliales par rapport à ses homologues plus rigides, mettant en évidence l’influence de la rigidité de la matrice sur la dissémination bactérienne.

Microscopie quantitative à intervalle temporel pour l’évaluation de la dissémination bactérienne dépendante de la rigidité de la matrice extracellulaire

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l'activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Substrats avec raideur dans la gamme kilopascal sont utiles pour étudier la réponse des cellules à physiologiquement pertinente micro-environnement rigidité. À l’aide d’un microscope à fluorescence widefield juste, le module de Young des gels de silicone souple peut être déterminé en utilisant une mise en retrait avec une sphère adaptée.

Mesure de la rigidité des substrats souples en Silicone pour mécanobiologie études utilisant un Microscope à Fluorescence Widefield

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

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Imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE)

Apprenez à préparer des gels de polyacrylamide en format multi-puits pour étudier les réponses cellulaires dépendantes de la rigidité. Cette méthode rapide et économique facilite la recherche en biologie cellulaire.

Multiwell Rigidité Essai pour l'étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

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