Multiwell Rigidité Essai pour l'étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

L’objectif global de cette procédure est de permettre une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multi-puits. Ceci est accompli en prenant d’abord en sandwich la solution de précurseur de gel entre une plaque de verre à revêtement hydrophobe et un support en plastique flexible adhésif acrylamide. La deuxième étape consiste à décoller le gel de la plaque de verre, qui s’est fixée de manière covalente au support en plastique flexible lors de la polymérisation, et à le laisser sécher.

Ensuite, le gel sec et le support en plastique flexible sous-jacent sont découpés dans les formes souhaitées et collés côté plastique vers le bas au fond d’une plaque multi-puits ou de tout autre récipient de culture cellulaire. La dernière étape consiste à enduire les gels de polyacrylamide assemblés par plaques multi-puits d’un revêtement adhésif cellulaire, tel qu’une monocouche de collagène de type un. En fin de compte, la microscopie, ainsi que d’autres techniques de caractérisation cellulaire, sont utilisées pour observer l’effet du substrat de polyacrylamide sous-jacent.

En particulier, sa rigidité sur les comportements cellulaires. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet de traiter toute rigidité et épaisseur de polygels ainsi que leur assemblage dans un format de plaque multi-puits, d’une manière peu coûteuse et rapide, non offerte par d’autres méthodes. La démonstration de la procédure se fera en tant qu’étudiant dans mon laboratoire.

Tout d’abord, préparez la solution de précurseur du gel de polyacrylamide en mélangeant l’acrylamide, l’agent de réticulation bis acrylamide et l’eau désionisée pour dissoudre Sul OPA dans le diméthylsulfox à 50 milligrammes par millilitre. Aliquote 20 microlitres de la solution mère dans 10 microtubes à centrifuger. Ensuite, flashez, congelez les solutions dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, dissolvez l’ammonium par sulfate dans de l’eau désionisée pour obtenir une concentration finale d’ammonium par sulfate de 10 % en poids par volume. Eloqua 25 microlitres d’ammonium par solution sulfatée dans 10 microtubes à centrifuger, et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Préparez une solution de collagène de 0,2 milligramme par millilitre en diluant la solution mère de collagène de type un dans un XPBS à pH 7,4.

Toutes les solutions sont conservées sur de la glace jusqu’à leur utilisation. À ce stade, placez quelques gouttes d’une solution hydrophobe sur une plaque de verre et utilisez du papier de soie pour étaler sur la surface. Après avoir laissé la plaque sécher à l’air, essuyez à nouveau avec du papier de soie pour uniformiser le revêtement hydrophobe.

Découpez un support en plastique flexible pour qu’il corresponde à la taille de la plaque de verre à revêtement hydrophobe. Marquez ensuite le côté hydrophobe du support en plastique souple en grattant légèrement la surface avec un outil tranchant tel qu’un scalpel. Pour la préparation du gel, ajouter 4972,5 microlitres de solution de précurseur de polyacrylamide de la concentration finale souhaitée dans un tube conique de 50 millilitres.

Placez le tube dans une chambre de dégazage pendant 30 minutes avec le bouchon ouvert. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de la solution d’ammonium par sulfate préalablement préparée à la solution de gel DGA pour obtenir une concentration finale d’ammonium par sulfate de 0,05 %, puis ajoutez 2,5 microlitres de TM ME pour obtenir une concentration finale de TM ME de 0,5 %Mélangez doucement la solution en pipetant de haut en bas trois à cinq fois. Placez ensuite les entretoises en silicone de l’épaisseur souhaitée sur le côté hydrophile du support en plastique flexible.

Ensuite, pipetez la solution de gel sur le support en plastique flexible entre les entretoises et le sandwich avec une lampe à lame en verre à revêtement hydrophobe. Après avoir laissé le gel polymériser pendant 45 minutes, décollez le support en plastique flexible avec le gel de polyacrylamide fixé de manière covalente sur le dessus et laissez sécher le gel vers le haut pour qu’il sèche à l’air. Une fois séché, coupez le gel de poly acrylamide dans les formes souhaitées.

Préparez environ 500 microlitres de polyméthylsoane par plaque de 96 puits selon les instructions du fabricant pour coller les gels au fond d’une plaque multi-puits. Placez une petite gouttelette de Polymethyl soane au centre de chaque puits à l’aide d’une pince. Placez un gel de polyacrylamide dans chaque support en plastique bien souple côté vers le bas.

Après avoir durci le polydiméthyl suboxane, placez une petite quantité de sampa de cellulose préalablement préparée dans chaque puits avec une pipette de transfert et tournez d’un côté à l’autre pour enrober uniformément la surface du gel. Placez la plaque de puits sous une lampe UV à haute intensité pendant cinq minutes. Une fois terminé, rincez les gels avec du PBS pour éliminer l’excès de violoncelle.

Après cette pipette, environ 50 microlitres du collagène préalablement préparé tapez une solution dans chacune. Eh bien, laissez la plaque couverte à température ambiante pendant au moins deux heures après le rinçage avec du PBS pour éliminer l’excès de solution de collagène. Stérilisez les gels sous lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant deux heures.

Enfin, faites tremper les gels dans un milieu complet pendant la nuit pour hydrater et équilibrer. Utilisez immédiatement des gels pour l’assise cellulaire ou conservez-les au réfrigérateur jusqu’à deux jours le module de la jeune fille en fonction de plusieurs acrylamide et bis. Les concentrations d’acrylamide désignées respectivement A et B sont indiquées ici comme prévu.

Le module de stockage G prime et le module de perte G double prime sont indépendants de la fréquence. Il a également été confirmé que le séchage puis la réhydratation des gels n’affectaient pas le module de leurs petits. En utilisant le Crosslinker Sulo sampa, il est possible d’obtenir un revêtement uniforme de collagène sur les hydrogels de n’importe quelle rigidité.

Il a été observé que lorsqu’elles étaient ensemencées sur des gels de polyacrylamide pendant 24 heures, les cellules du cancer du sein M-D-A-M-B 2 31 restaient rondes sur les gels mous de 0,5 et un kilo pascal, mais étaient capables de s’étendre et de s’allonger sur le gel rigide de 100 kilogrammes. De plus, les hydrogels fabriqués sur le support en plastique flexible sont transparents et permettent une visualisation et une microscopie faciles. De plus, le support en plastique flexible n’est pas auto-fluorescent et n’interfère donc pas avec l’imagerie des cellules marquées par fluorescence.

La morphologie cellulaire a été quantifiée en termes de surface d’étalement cellulaire globale et de circularité cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’efficacité et du coût de l’assemblage des gels de polyamide dans un format de plaque multi-puits. Pour l’étude de la biologie cellulaire dépendante de la rigidité.