Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

L’objectif global de cette méthodologie est de créer des modèles de protéines spatiales bioactives immobilisées qui seront utilisés pour étudier les réponses cellulaires. Cette méthode permet de récapituler les signaux in-vivo à l’aide de stratégies de biomatériaux. Cette technique permet d’imiter avec précision certains motifs de signalisation qui ne peuvent pas être obtenus à l’aide de méthodes de culture standard telles que les facteurs de croissance séquentiels, la signalisation des cellules cellulaires et les indices biochimiques spécifiques à l’espace.

Ce protocole est important pour les méthodes existantes car il fournit une méthode simpliste pour ajuster la rigidité du substrat et la structuration des protéines. Bien que cette méthode puisse faire progresser les technologies d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres systèmes tels que le développement des tissus et le destin des cellules souches. Pour commencer, préparez des solutions mères pour le principal composant de l’hydrogel, le diacrylate de polyéthylène glycol, le photo-initiateur, le phényl-2, 4, 6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium et la protéine ECM, la fibronectine, dans des conditions stériles décrites dans le protocole de texte ci-joint.

Stérilisez chaque solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron avant d’utiliser ou de stocker les aliquotes individuelles. Ensuite, enveloppez la solution PEG-DA avec une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière. Enveloppez la solution mère de l’initiateur de photos dans une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière et conservez la solution préparée à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois au maximum.

Si la solution mère de fibronectine est congelée, laissez décongeler l’aliquote stérile sur de la glace pendant plusieurs heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Commencez par autoclaver une feuille de polyester pour chaque moule en gel. Ensuite, trempez deux lames de verre dans trois entretoises en plastique pour chaque moule en gel dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins deux heures.

De plus, trempez cinq pinces à liant pour chaque moule en gel dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes. Placez les lames de verre, les entretoises et les pinces à liant sur une petite feuille d’autoclave dans le capot de culture cellulaire pour leur permettre de sécher à l’air libre pendant plusieurs heures. Ensuite, préparez les moules à hydrogel en plaçant les entretoises en plastique de 0,5 millimètre d’épaisseur sur le bord d’une lame de verre.

Placez la deuxième lame de verre sur le dessus, puis fixez fermement les entretoises les unes à côté des autres à l’aide de pinces à liant. Enfin, stérilisez la surface du moule en le plaçant dans la hotte et en allumant la lumière UV pendant 30 minutes avant de l’utiliser. À mi-chemin du processus de stérilisation, retournez le moule pour qu’il soit plus exposé afin d’exposer les deux surfaces.

Créez les solutions de précurseurs de gel comme décrit dans le tableau un du protocole de texte ci-joint. Ensuite, mélangez les volumes de PEG-DA, de fibronectine et de photo-initiateur pour créer l’hydrogel. Pipetez vigoureusement la solution pour obtenir une solution homogène, mais évitez de créer des bulles.

Pipetez soigneusement la solution de précurseur de gel entre les deux lames de verre du moule en gel. Ensuite, placez le moule sous une lumière UV et exposez-le pendant une à deux minutes pour former l’hydrogel. Une fois gélifié, retirez les pinces de reliure et retirez délicatement la glissière de verre supérieure en appliquant une pression opposée sur les deux entretoises latérales.

Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie de taille appropriée, vous découpez les échantillons d’hydrogel. Découpez plusieurs hydrogels du rectangle de gel pour servir de répétitions et d’échantillons de contrôle. Stérilisez le masque photo en le trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes.

Ensuite, laissez le masque photo sécher à l’air libre dans une hotte de culture cellulaire. Ensuite, pipetez un à deux microlitres par centimètre carré d’une solution de protéine thiolée à la surface de chaque hydrogel découpé pour le motif de surface. Il est important de répartir uniformément la solution protéique sur toute la surface de l’hydrogel pour assurer une immobilisation uniforme des protéines.

Placez délicatement le masque photo sur la surface de l’hydrogel. Appuyez doucement sur le masque pour éliminer les bulles qui se forment entre le masque et la surface de l’hydrogel. Ensuite, placez l’hydrogel sous la lumière UV et exposez-le à une deuxième série de lumière UV pendant 30 à 60 secondes.

Lavez les hydrogels avec du PBS pour éliminer toutes les espèces qui n’ont pas réagi et placez chaque hydrogel à l’intérieur de la plaque du puits de manière à ce que la surface du motif soit tournée vers le haut. Ensuite, lavez les gels pendant la nuit dans du PBS à quatre degrés Celsius. Retirez le PBS des puits, puis ajoutez 250 microlitres d’EGM2 basal dans chaque puits et incubez les gels pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Pendant l’incubation, la trypsine digère une plaque de HUVECs presque confluents en une suspension unicellulaire en utilisant des techniques standard. Ensuite, faites tourner la suspension cellulaire et retirez soigneusement le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire et l’EGM2 basal sans facteurs de croissance ajoutés et ajoutez une partie de la suspension cellulaire à un hémocytomètre.

Comptez les cellules pour déterminer la concentration. Ensuite, faites tourner la plaque contenant les hydrogels à 300 x G pendant trois minutes, pour vous assurer que les hydrogels sont situés au fond du puits et ne flottent pas. Il est essentiel que les hydrogels ne flottent pas dans les puits.

Les hydrogels flottants limiteront le succès de l’ensemencement cellulaire et poseront des problèmes d’imagerie d’hydrogel. Pipetez lentement 75 000 cellules par centimètre carré au centre de chaque surface d’hydrogel afin de ne pas perturber les gels. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.

Pendant plusieurs jours, retirez périodiquement la boîte pour observer la migration cellulaire en réponse au motif protéique. Échangez 50 % des médias tous les deux à trois jours. Lors de la formation des hydrogels, diverses concentrations de diacrylate de PEG précurseurs peuvent être utilisées pour obtenir la rigidité souhaitée du substrat.

Illustrée ici, la solution 20 % PEG-DA est corrélée à la rigidité de plus de 100 kilopascals. Il est également important de tenir compte à la fois de la concentration du photo-initiateur et du temps d’exposition aux UV, car une augmentation de l’une ou l’autre variable diminuera la bioactivité des molécules attachées, représentée ici par la bioactivité du lysosome. La minimisation de l’exposition aux UV lors de la formation de l’hydrogel est essentielle pour maintenir les groupes fonctionnels de l’acrylate libre pour les réactions ultérieures d’immobilisation des protéines.

Les hydrogels exposés à la lumière UV pendant plus de deux minutes sont incapables de créer des motifs protéiques immobilisés indiqués en rouge. De plus, à mesure que l’exposition aux UV au motif protéique augmente, davantage de protéines réagissent à la surface. Lorsqu’elles sont préparées correctement, les cellules peuvent être cultivées sur ces substrats d’hydrogel à motifs pour manipuler leur comportement.

Ici, les cellules endothéliales ont été uniformément ensemencées à la surface d’hydrogels PEG à motif VEGF. Deux jours après l’ensemencement, on a observé que les cellules endothéliales migraient vers les régions spatiales de l’hydrogel qui contenait le VEGF immobilisé. Suite à la mise au point de ce protocole, les chercheurs pourront l’utiliser pour immobiliser n’importe quelle protéine ou peptide afin d’explorer de nouvelles plateformes bioactives pour les systèmes cellulaires in vitro.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser la concentration du photo-initiateur et le temps d’exposition aux UV pour maintenir la bioactivité des molécules immobilisées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modeler les protéines et les peptides bioactifs sur les hydrogels PEG, d’ensemencer uniformément les cellules sur les hydrogels et d’observer la réponse cellulaire qui en résulte.