Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

L'objectif général de cette méthodologie est de créer des motifs spatiaux de protéines bioactives immobilisées pouvant être utilisés pour étudier les réponses cellulaires. Cette méthode permet de recréer des signaux in vivo à l'aide de stratégies basées sur les biomatériaux. Cette technique autorise une imitation précise de certains motifs de signalisation que les méthodes classiques de culture ne permettent pas d'obtenir, tels que les facteurs de croissance séquentiels, la signalisation entre cellules et les indices biochimiques spécifiques spatialement.

Ce protocole revêt une importance particulière par rapport aux méthodes existantes, car il offre une méthode simplifiée pour ajuster la rigidité du substrat et le dessin protéique. Bien que cette méthode puisse faire progresser les technologies d'ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, elle peut également être utilisée pour étudier d'autres systèmes, tels que le développement tissulaire et le destin des cellules souches. Pour commencer, préparez des solutions mères pour le composant principal de l'hydrogel, le diacrylate de polyéthylène glycol, l'amorceur photo, le phényl-2,4,6-triméthylbenzoylephosphinate de lithium, et la protéine de la matrice extracellulaire, la fibronectine, en conditions stériles, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.

Filtrer stérilement chaque solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron avant de l’utiliser ou de stocker les aliquots individuels. Ensuite, envelopper la solution de PEG-DA dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Envelopper la solution mère de l’initiateur photo en papier d’aluminium pour la protéger de la lumière et conserver la solution préparée à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois.

Si la solution mère de fibronectine est congelée, laisser un aliquot stérile dégeler sur de la glace pendant plusieurs heures ou à quatre degrés Celsius toute la nuit. Commencer par stériliser à l'autoclave une feuille de polyester pour chaque moule à gel. Ensuite, faire tremper deux lames de verre et trois entretoises en plastique pour chaque moule à gel dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins deux heures.

En outre, faites tremper cinq pinces à levier pour chaque moule à gel dans de l'éthanol à 70 % pendant 10 minutes. Placez les lames de verre, les entretoises et les pinces à levier sur une petite feuille d'autoclave dans la hotte de culture cellulaire afin de les laisser sécher à l'air pendant plusieurs heures. Ensuite, préparez les moules d'hydrogel en plaçant les entretoises en plastique d'une épaisseur de 0,5 millimètre autour du bord d'une lame de verre.

Placer la deuxième lame de verre par-dessus, puis fixer fermement les entretoises côte à côte à l’aide de pinces agrafes. Enfin, stériliser la surface du moule en le plaçant dans la hotte et en activant la lumière UV pendant 30 minutes avant utilisation. À mi-chemin du processus de stérilisation, retourner le moule afin de bien exposer les deux surfaces.

Préparez les solutions précurseurs du gel comme décrit dans le tableau un du protocole textuel accompagnant. Ensuite, mélangez les volumes de PEG-DA, de fibronectine et d'initiateur photo pour former l'hydrogel. Pipetez vigoureusement la solution afin d'obtenir une solution homogène, mais évitez de créer des bulles.

Prélèvement soigneusement la solution précurseur du gel entre les deux lames de verre du moule à gel. Ensuite, placer le moule sous une lumière UV et l'exposer pendant une à deux minutes afin de former l'hydrogel. Une fois le gel formé, retirer les pinces à ressorts et ôter délicatement la lame de verre supérieure en appliquant une pression opposée sur les deux entretoises latérales.

Ensuite, utiliser un punch à biopsie de taille appropriée pour découper les échantillons d'hydrogel. Découper plusieurs hydrogels à partir du rectangle de gel afin d'obtenir des réplicats et des échantillons témoins. Stériliser le masque photo en le faisant tremper dans de l'éthanol à 70 % pendant 10 minutes.

Ensuite, laissez sécher à l'air libre le masque photographique dans une hotte de culture cellulaire. Puis, ajoutez à l’aide d’une pipette de un à deux microlitres par centimètre carré d’une solution de protéine thiolée sur la surface de chaque hydrogel découpé, afin de réaliser le dessin de surface. Il est important de répartir uniformément la solution de protéine sur la surface de l’hydrogel afin d’assurer une immobilisation homogène de la protéine.

Placez soigneusement le masque photographique sur la surface de l'hydrogel. Appuyez doucement sur le masque afin d'éliminer les bulles d'air éventuelles situées entre le masque et la surface de l'hydrogel. Ensuite, placez l'hydrogel sous la lumière UV et exposez-le à un deuxième cycle de lumière UV pendant 30 à 60 secondes.

Lavez les hydrogels avec du PBS pour éliminer toute espèce non réagie et placez chaque hydrogel dans une cavité de la plaque de manière à ce que la surface du motif soit orientée vers le haut. Ensuite, lavez les gels toute la nuit dans du PBS à quatre degrés Celsius. Retirez le PBS des cavités, puis ajoutez 250 microlitres de milieu basal EGM2 dans chaque cavité et incubez les gels de cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius.

Pendant l'incubation, digérer une plaque de cellules HUVEC presque confluentes en une suspension monocellulaire à l'aide de techniques standard. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire et éliminer soigneusement le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans l'EGM2 basal sans facteurs de croissance ajoutés, puis ajouter une partie de la suspension cellulaire à un hématocytomètre.

Comptez les cellules pour déterminer la concentration. Ensuite, centrifugez la plaque contenant les hydrogels à 300 x G pendant trois minutes, afin de s'assurer que les hydrogels se trouvent au fond des puits et ne flottent pas. Il est essentiel que les hydrogels ne flottent pas dans les puits.

Les hydrogels flottants limiteront la réussite du semis cellulaire et causeront des problèmes lors de l'imagerie des hydrogels. Ajoutez lentement 75 000 cellules par centimètre carré au centre de chaque surface d'hydrogel afin de ne pas perturber les gels. Ensuite, placez la plaque dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius.

Pendant plusieurs jours, retirez périodiquement la boîte pour observer la migration cellulaire en réponse au motif protéique. Renouvelez 50 % du milieu toutes les deux à trois journées. Lors de la formation des hydrogels, diverses concentrations de précurseur de PEG-diacrylate peuvent être utilisées afin d'obtenir la rigidité du substrat souhaitée.

Ici, une solution de PEG-DA à 20 % correspond à une rigidité supérieure à 100 kilopascals. Il est également important de prendre en compte à la fois la concentration de l'initiateur photochimique et la durée d'exposition aux UV, car une augmentation de l'une ou l'autre de ces variables réduira la bioactivité des molécules fixées, représentée ici par la bioactivité de la lysosome. La minimisation de l'exposition aux UV pendant la formation de l'hydrogel est essentielle pour préserver les groupes fonctionnels acrylates libres destinés aux réactions ultérieures d'immobilisation des protéines.

Les hydrogels exposés à la lumière UV pendant plus de deux minutes ne parviennent pas à créer les motifs de protéines immobilisées indiqués en rouge. De plus, à mesure que l'exposition aux protéines augmente, davantage de protéines réagissent avec la surface. Lorsqu'ils sont préparés correctement, les cellules peuvent être cultivées sur ces substrats d'hydrogel structurés afin de manipuler leur comportement.

Ici, des cellules endothéliales ont été uniformément ensemencées à la surface de gels hydrogels PEG présentant un motif de VEGF. Deux jours après l'ensemencement, on a observé que les cellules endothéliales migraient vers les régions spatiales du gel hydrogel contenant la VEGF immobilisée. Après le développement de ce protocole, les chercheurs peuvent l'utiliser pour immobiliser n'importe quelle protéine ou peptide afin d'explorer de nouvelles plateformes bioactives pour des systèmes cellulaires in vitro.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser la concentration de l'initiateur photochimique et la durée d'exposition aux UV afin de préserver l'activité biologique des molécules immobilisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment implanter des protéines et des peptides bioactifs sur des hydrogels à base de PEG, ensemencer des cellules de manière uniforme sur les hydrogels et observer la réponse cellulaire consécutive.