Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l'acrylamide basée hydrogels

Modéliser la compliance tissulaire in vivo à l’aide d’hydrogels d’acrylamide. Ceci est accompli en générant d’abord des lamelles de couverture inférieures réactives et des lamelles de couverture supérieures siliconées. La deuxième étape de la procédure consiste à verser et à créer les hydrogels d’acrylamide.

La troisième étape de la procédure consiste à réticuler la protéine de la matrice extracellulaire de votre choix à l’hydrogel. La dernière étape de la procédure est l’incubation et l’analyse des cellules. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent comment la conformité variable de la matrice extracellulaire in vitro régule le comportement cellulaire par analyse à l’aide de la microscopie d’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel et du western blot.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure de génération et d’utilisation des hydrogels d’acrylamide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la rigidité de notre matrice extracellulaire, réguler la morphologie cellulaire, la signalisation cellulaire et la prolifération. Alors commençons.

Commencez cette procédure en générant des bordereaux de recouvrement réactifs. Placez d’abord une couche de paraforme sur la moitié inférieure d’une boîte de Pétri de 150 millimètres. Transférez ensuite jusqu’à neuf lamelles de couverture autoclave de 25 millimètres sur le film para et recouvrez-les d’un millilitre d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire.

Incuber les lamelles pendant trois minutes Après l’incubation, aspirer l’hydroxyde de sodium à l’aide d’une conduite sous vide en travaillant dans une pipette à capuchon chimique de 0,5 millilitres de triméthyle à profil aminé ou de trois A-P-T-M-S sur chaque lamelle. Incuber les lamelles pendant trois minutes, puis aspirer les trois A-P-T-M-S. Veillez à ne pas incuber trop longtemps pour éviter la formation de mousse sur le couvercle.

Glissements suite au traitement. Rincez une fois les lamelles de couverture avec 20 millilitres d’eau déminéralisée dans le même plat. Retirez les lamelles de recouvrement de la parabole à l’aide d’une pince incurvée et transférez-les sur le côté traité vers le haut dans une nouvelle parabole de 150 millimètres.

Ensuite, lavez à nouveau les lamelles avec de l’eau déminéralisée et placez-les sur le transat pendant 10 minutes. Après l’incubation, retirez l’eau et lavez-le deux fois de plus. Il est très important d’enlever les trois A-P-T-M-S afin qu’ils ne réagissent pas avec le glutaraldéhyde et ne laissent pas un précipité blanc trouble 10 minutes avant l’utilisation du glutaraldéhyde.

À l’aide d’une pince incurvée, transférez les lamelles dans un plat propre recouvert de param et aspirez tout liquide restant à l’aide d’une conduite sous vide, puis couvrez complètement chaque lamelle avec 0,5 millilitre de glutaraldéhyde à 0,5 % dans de l’eau déminéralisée stérile pour réticuler les trois A-P-T-M-S et le gel de poly acrylamide. Incuber les lamelles de recouvrement pendant 30 minutes dans une hotte chimique. Ensuite, aspirez le glutaraldéhyde, rincez et lavez à nouveau les lamelles de couverture avec de l’eau déminéralisée.

Ensuite, séchez complètement les lamelles. Ajouter de nouvelles lamelles dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant une solution d’étanchéité de surface à 10 % dans du chloroforme et de la roche pendant au moins 10 minutes. Décantez la solution d’étanchéité de surface et séchez-la à l’air.

Le couvercle se glisse sur les lingettes Kim dans l’enceinte de sécurité biologique où les hydrogels seront préparés pour commencer la préparation de l’hydrogel. À l’aide d’une pince incurvée, transférez les lamelles du côté réactif vers le haut sur une feuille de paraforme qui a été collée sur la surface de l’enceinte de sécurité biologique. Assurez-vous que les lamelles sont à plat sur la surface du paraforme.

Préparez ensuite une solution saturée et hydroxy de CIN aide ou de NHS dans du toluène en dissolvant une petite quantité de NHS dans suffisamment de toluène. Pour les expériences spécifiques, ajoutez de petites quantités de NHS jusqu’à ce que le NHS ne se dissolve plus. La solution saturée est généralement trouble et rose.

Ensuite, préparez l’acrylamide BIS et un PS pour atteindre le pourcentage d’acrylamide souhaité. Ajoutez les réactifs dans les tubes de micro-utilisation comme indiqué dans le protocole écrit. Puis une aliquote à la fois.

Ajoutez le NHS et la MT me. Vortex le tube brièvement et immédiatement Versez entre trois et cinq gels à l’aide de 140 microlitres par lamelle dans les enceintes de sécurité biologique. Placez rapidement la lamelle SILICONISÉE de 25 millimètres sur chaque gel avant qu’il ne commence à polymériser.

L’ajout de la lamelle de couverture supérieure permettra à l’acrylamide de recouvrir complètement la lamelle de couverture inférieure. Incuber ce sandwich à température ambiante jusqu’à ce que l’acrylamide polymérise pour déterminer quand la polymérisation s’est produite. Vérifiez la solution résiduelle d’acrylamide dans le tube de micro-centrifugeuse.

La polymérisation prendra quelques minutes pour les gels durs et un peu plus longtemps pour les gels mous. Une fois la polymérisation effectuée, ramassez soigneusement le sandwich avec des gants stériles. Faites ensuite glisser la glissière du couvercle supérieur jusqu’à ce qu’elle dépasse du gel polymérisé.

Ensuite, faites levier sur le couvercle. Retirez le gel, jetez la glissière du couvercle supérieur. Placez chaque plaque de couverture de gel inférieure, ci-après appelée hydrogel, dans une plaque à six puits.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS par puits d’une plaque à six puits. Ensuite, lavez les hydrogels avec du PBS et incubez sur une bascule pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois.

Pour commencer l’expérience, couvrez chaque hydrogel avec deux millilitres d’une solution de fibronectine ou d’une autre protéine de la matrice extracellulaire. Incuber la protéine sur l’hydrogel pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour lui permettre de se lier de manière covalente à l’hydrogel après une incubation nocturne, aspirez la solution ECM. Ensuite, bloquez le NHS non réactif avec un milligramme par millilitre d’albumine sérique bovine sans acides gras activés dans un milieu sans sérum et incubez pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, laver les hydrogels une fois avec du PBS stérile. Ensuite, placez les cellules dans le milieu de culture approprié contenant du sérum fœtal bovin. Passons à l’hydrogel ici.

Établir que des fibroblastes embryonnaires de souris sont utilisés. Déterminez le nombre de cellules à ensemencer sur l’hydrogel en fonction du degré de propagation des cellules et de la confluence requise pour l’expérimentation. Environ 10 à cinq cellules nécessaires pour l’analyse par transfert Western et l’analyse PCR quantitative.

Ensuite, incubez les cellules dans les conditions appropriées pour le type de cellule spécifique. Après la période d’incubation. Extrayez la protéine cellulaire ou l’ARNm selon les besoins.

Pipetez 100 gouttelettes de 100 microlitres de tampon de lyse sur une feuille de paraforme sur la paillasse du laboratoire, en laissant environ deux à trois centimètres entre chaque gouttelette. Ensuite, retirez soigneusement chaque hydrogel en soulevant la glissière du couvercle inférieur du puits. À l’aide d’une pince incurvée et en plaçant son côté cellulaire vers le bas sur les gouttelettes.

Incuber les cellules avec le tampon de lyse pendant exactement une minute. Enfin, retirez les lamelles et transférez le tampon de lyse dans un microtube à centrifuger. Alternativement, lors de l’extraction de l’ARN, transférez chaque hydrogel dans une nouvelle plaque à six puits et ajoutez un millilitre de triazole par puits.

Incuber les gels pendant trois minutes après l’incubation. Retirer la solution de triazole pour la conserver dans un microtube à centrifuger. Le lavage minutieux des lamelles après l’ajout de A-P-T-M-S est une étape importante dans la production de lamelles réactives.

Les lamelles correctement lavées et sèches sont exemptes de tout résidu précipité. A-P-T-M-S réagira avec le glutaraldéhyde et produira un précipité blanc et trouble. Si le précipité se produit, toute la procédure doit être répétée car le bordereau de recouvrement n’est plus utilisable.

Après la formation d’hydrogel et l’enrobage avec des protéines ECM, les cellules de nuit sont ensemencées. Il existe une différence distincte entre les cellules qui s’étalent sur des hydrogels rigides et les hydrogels mous, comme on peut le voir par foid dans la coloration, et les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris se propagent dans une plus grande mesure sur des hydrogels rigides par rapport aux hydrogels mous. En effet, la plupart des cellules qui se fixent à un hydrogel mou resteront compactes et se fixeront moins efficacement.

Les résultats quantitatifs représentatifs de la PCR du cycle D un des niveaux d’ARNm dans les fibroblastes embryonnaires de souris montrent que le cycle D one est significativement régulé à la hausse sur une matrice rigide, mais pas sur une matrice molle. Cela suggère que la rigidité matricielle régule la progression du cycle cellulaire in vitro. Nous venons de vous montrer comment générer une rigidité de sectionnement d’hydrogel, modéliser les conditions physiologiques in vivo Lorsque cette procédure est importante, il est important de se rappeler de faire des lamelles de recouvrement réactives supplémentaires car des accidents et des erreurs se produiront.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.