Name: Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant lacrylamide basée hydrogels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez comment modéliser la rigidité tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide pour étudier le comportement cellulaire. Cette méthode combine microscopie à immunofluorescence, PCR quantitative et western blotting.

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Le travail est notre laboratoire est soutenu par des subventions du National Institutes of Health.

Préparation <ul><li> Lamelles doivent être autoclavés. </li><li> Eau distillée stérile ou déminéralisée doit être utilisée pour préparer des solutions et des lamelles à laver. </li><li> AC (40% p / v) et de bis-secteur (1% p / v) solutions sont stérilisées par filtration 0,2 um. Préparer le persulfate d'ammonium à 10% (APS, l'eau 100μg/ml) peu avant l'utilisation et le filtre stérile. Remplacer la solution APS mensuelle. </li><li> Réactifs chimiques tels que 3-APTMS, le chloroforme, glutaradehyde, NHS, et SurfaSil qui ne peuvent pas être autoclavés sont conservés dans une bouteille assigné utilisés uniquement pour la préparation d'hydrogels. </li><li> Pour de meilleurs résultats, les hydrogels devraient être utilisées au sein d'une couple de jours après la nuit d'incubation avec la protéine appropriée ECM. </li><li> Préparer une solution SurfaSil 10% dans le chloroforme (10 ml est généralement suffisant pour 20 lamelles en haut) dans un tube de 50 ml en polypropylène Falcon avant de couler de l'hydrogel. (Notre laboratoire siliconizes habituellement le couvre-dessus lors de l'étape d'incubation glutaraldéhyde 0,5%). Ajouter les lamelles sur le tube de Falcon et de roche pour au moins 10 min. Décanter la solution SurfaSil et l'air sec sur les lamelles Kimwipes dans l'enceinte de sécurité biologique où les hydrogels sera préparé. </li><li> Préparer la solution de BSA inactivée par la chaleur comme suit: a 20 mg / ml, solution d'acides gras libres dans le PBS BSA est incubé dans un bain d'eau à 68 ° C pendant 30 min. La solution est alors filtré stérile et stocké à 4 ° C. </li></ul> Procédure <ol><li> Placez une couche de parafilm sur la moitié inférieure d'un plat de Pétri de 150 mm. </li><li> Placez jusqu'à 9 lamelles de 25 mm sur le dessus du Parafilm et les couvrir avec 1 ml de NaOH 0,1 M. Incuber pendant 3 min, puis aspirer avec une ligne vide. </li><li> Travailler dans une hotte chimique, placer 0,5 ml 3-APTMS sur chaque lamelle. Incuber pendant 3 min, puis aspirer le APTMS. Si vous attendez trop longtemps, une mousse se forme. </li><li> Rincez les lamelles une fois avec 20 ml d'eau désionisée dans le même plat. Retirez les lamelles de l'antenne en utilisant une pince incurvée et de les transférer, avec leur traité côté vers le haut, à un nouveau plat de 150 mm. Lavez les lamelles avec de l'eau déminéralisée à trois reprises, sur la bascule, pendant 10 min à chaque lavage. Si vous n'arrivez pas à supprimer tous les APTMS, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l'étape suivante et laissez un précipité blanc laiteux (figure 1). </li><li> Décongeler les glutaraldéhyde (~ 10 min avant utilisation). </li><li> En utilisant des pinces courbes, transférer les lamelles dans un plat propre couches de Parafilm et aspirer tout le liquide restant. Utilisez une ligne vide ou Kimwipe pour éponger l'eau restante, au besoin. </li><li> Couvrir chaque lamelle complètement avec 0,5 ml de glutaraldéhyde à 0,5% dans de l'eau déminéralisée stérile et incuber pendant 30 min dans une hotte chimique. Aspirer le glutaraldéhyde. Rincez et lavez les lamelles comme dans l'étape 4. Sécher les lamelles complètement. [Vous pouvez vous arrêter là et laisser les lamelles pendant plusieurs semaines dans un endroit sec]. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à préparer les hydrogels, utilisez une pince incurvée pour transférer les lamelles, jusqu'à côté réactif, d'une feuille de Parafilm qui a été enregistré sur la surface de l'enceinte de sécurité biologique. Assurez-vous que les lamelles sont à plat sur la surface Parafilm. </li><li> Préparez une solution saturée du NHS dans le toluène. (Dissoudre une petite quantité de NHS en assez de toluène pendant l'expérience particulière. Continuez à ajouter peu à peu jusqu'à ce NHS le NHS ne se dissout plus. La solution saturée est généralement nuageux et rose.) </li><li> Ensuite, préparer l'acrylamide, le bis-acrylamide, l'eau et l'APS pour atteindre le pourcentage d'acrylamide désiré. Ajouter les réactifs dans des microtubes comme indiqué ci-dessous pour un volume total de 0,8 ml. </li><li> Ensuite, une aliquote à un moment, ajoutez le NHS et TEMED à la solution 0,8 ml AC, vortex brièvement et verser immédiatement 3-5 gels en utilisant 140 ul par lamelle dans la hotte de sécurité biologique. Autant que possible, toutes les étapes de ce point devrait être effectué dans une enceinte de sécurité biologique. [Note: des lamelles de tailles différentes peuvent être utilisées en fonction des besoins. Si 18 mm lamelles sont utilisées, l'utilisation ~ 33 ul solution CA par lamelle et une lamelle de 18 mm supérieure siliconée.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (rigide) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 (soft) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Placer rapidement l'siliconé de 25 mm lamelle sur le dessus de chaque gel avant qu'il ne commence à se polymériser. Ajout de la lamelle supérieure doit permettre à l'AC pour couvrir complètement la lamelle du bas. Incuber ce «sandwich» à température ambiante jusqu'à ce que le CA se polymérise. (Vérifiez la solution résiduelle AC dans le tube à centrifuger pour déterminer quand la polymérisation s'est produite. Généralement que quelques minutes pour les gels rigides et un peu plus long pour les doux suffira.). </li><li> Soigneusement ramasser les sandwichs (gants stériles sur!) Et faites glisser la lamelle supérieure jusqu'à ce qu'elle surplombe le gel polymérisé. Vous pouvez alors le soulever hors gel. Si vous attendez trop longtemps avant d'enlever la lamelle supérieure, le gel va déchirer que la lamelle est retirée. </li><li> Jeter la lamelle supérieure. Placez le fond de gel des lamelles (ci-après appelé l'hydrogel) dans des plaques 6 puits avec 2 ml de PBS / puits. PBS peuvent être ajoutés avant ou après le gel-lamelle à chaque puits. Lavez les hydrogels avec PBS à trois reprises, sur une bascule, à 5 min par lavage. </li><li> Répétez les étapes 11 à 14 jusqu'à ce que le nombre requis d'hydrogels ont été préparés. </li><li> Couvrir chaque hydrogel avec 2 ml d'une solution de fibronectine (3 pg / ml dans le PBS) ou de protéines ECM d'autres (voir Klein et al. 13 pour plus de détails.). La protéine ECM devient liée de manière covalente à l'hydrogel pendant une nuit d'incubation à 4 ° C. </li><li> Aspirer la solution d'ECM et de bloquer NHS n'ayant pas réagi avec 1mg/ml inactivé à la chaleur des acides gras libres dans le sérum de BSA-médias libres pendant au moins 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. Rincez les hydrogels une fois avec du PBS stérile ou de milieu de culture cellulaire. </li><li> Cellules de la plaque dans le milieu de culture approprié contenant FBS. Le nombre de cellules ensemencées sur l'hydrogel doit être déterminée par l'utilisateur basée sur le degré d'étalement cellulaire et la confluence requis pour l'expérimentation. Environ 10 5 cellules est généralement suffisante pour l'analyse western blot et qPCR. </li><li> Après la période d'incubation, les protéines cellulaires ou ARNm peut être extrait. Les lamelles sont soigneusement retirés du puits en utilisant une pince incurvée et placé (cellule vers le bas) sur le dessus de 100 gouttelettes ul de tampon de lyse qui ont été espacées (2-3cm) le long d'une feuille de parafilm sur la paillasse. (Nous utilisons tampon standard de l'échantillon SDS et TRIzol, respectivement, pour préparer des échantillons pour western blot et d'isoler l'ARN pour qPCR). Incuber les cellules avec le tampon de lyse pour exactement une minute. Retirez les lamelles et le transfert du tampon de lyse à un tube à centrifuger. Sinon, pour l'extraction d'ARN seulement, l'utilisateur peut transférer chaque hydrogel pour un nouveau 6-même assiette et ajouter 1ml de TRIzol / puits. Incuber pendant 3 minutes et retirer la solution pour le stockage dans TRIzol un microtube. </li></ol> Des informations supplémentaires sur les procédures telles que l'immunofluorescence, marquage BrdU, la transfection, etc pour les cellules ensemencées sur des hydrogels est décrite dans Klein et al. 2007 13. Les résultats représentatifs Lavage soigneux des lamelles après addition de APTMS est une étape importante dans la production de «réactive» des lamelles. Si on ne parvient pas à retirer le APTMS complètement, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l'étape suivante et de produire un précipité blanc laiteux comme on le voit dans la figure 1A. Figure 1B montre une lamelle correctement lavés et séchés. Si le précipité se développe, toute la procédure doit être recommencé depuis le début que la lamelle n'est plus utilisable. Après la formation d'hydrogel et le revêtement avec des protéines ECM nuit, les cellules peuvent être ensemencées le jour suivant. Comme la figure 2 montre, il ya une nette différence entre les cellules épandage sur des hydrogels raides et douces. Comme peut être vu par coloration phalloïdine dans des fibroblastes de souris embryonnaires (MEF), les cellules réparties à une plus grande mesure sur les raides par rapport aux hydrogels mous. En effet, la plupart des cellules attachant à un hydrogel mou restera compact et attachent moins efficacement. Bien que la morphologie du MEF est montré dans la figure 2, la différence dans la cellule d'épandage est uniforme à travers plusieurs autres lignées cellulaires testées 11-12,14. Les secrets du succès <ol><li> Une fois la procédure est lancée, il est très important de garder les lamelles avec le «réactif» vers le haut et garder à l'esprit de quel côté a été enduit. </li><li> Les gants doivent être portés à tout moment pendant la procédure d'offrir un environnement de travail qui est aussi stérile que possible. </li><li> La plupart des étapes initiales sont effectuées entre une hotte et la table de laboratoire. Toutes les étapes ultérieuresà éliminer l'excès de glutaraldéhyde les lamelles doivent être exécutées sous une enceinte de sécurité biologique. </li><li> En raison de différences dans la cellule d'étalement (figure 2), nous recommandons l'ensemencement du double du nombre de cellules sur des hydrogels mous par rapport aux hydrogels raide. </li><li> Le procédé de polymérisation AC est extrêmement rapide. Pour les utilisateurs de première fois, on peut diminuer la quantité de l'APS ou TEMED dans la solution de prolonger le processus de polymérisation. Ne pas essayer de préparer plus d'un couvre-rares à la fois. </li><li> Dans les études du cycle cellulaire où la synchronisation dans G0 est nécessaire, nous avons l'habitude de sérum affamer les cellules dans des boîtes de culture en plastique, trypsiniser les cellules et les réensemencer sur les hydrogels de conformités différente en présence de mitogènes (FBS et / ou facteurs de croissance). Cette procédure garantit que la population de départ de G0-synchronisés cellules est identique dans tous les échantillons. Cependant, de nombreuses études de transduction du signal, la période de stimulation mitogène requise ne peut être suffisamment longue pour permettre l'attachement et la propagation des cellules. Dans ce cas, nous sérum affamer les cellules sur les hydrogels et ensuite directement les stimuler avec des mitogènes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Figure 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1a"> Figure 1A. Mal lavés lamelle. Après ajout de APTMS, lamelle a été lavé pendant 1-2 minutes avant l'addition de la solution de glutaraldéhyde. Un précipité se forme sur la lamelle qui n'a pas été lavés selon les étapes décrites dans la procédure. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Figure 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1b"> Figure 1B. Correctement lavés lamelle. Après l'addition des APTMS, lamelle a été lavé trois fois de 10 minutes chacune, avant addition de la solution de glutaraldéhyde. Aucun précipité se forme sur la lamelle. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Morphologie des cellules sur des hydrogels de différentes raideurs. Établie FAE ont été ensemencées sur fibronectine revêtement hydrogels de rigidité élevée ou basse pendant 9 heures. Après la période d'incubation, les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec FITC-phalloïdine qui se lie à la F-actine. FAE sur des gels présentent une grande rigidité des fibres de stress et sont bien réparties par rapport à celles ensemencées sur les hydrogels faible rigidité. Barre d'échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant la PCR quantitative raison des niveaux de la cycline D1 souris ARNm. Sérum fibroblastes de souris affamée embryonnaires ont été plaquées sur élevé (3% d'acrylamide) ou faible rigidité des hydrogels (0,3% d'acrylamide) et stimulées avec du FBS à 10% pour 9 heures. Suite à l'extraction d'ARN, analyse en temps réel de PCR quantitative a été réalisée pour D1 niveaux d'ARNm cycline (normalisée à l'ARN 18S). G0 représente cycline D1 ARNm de cellules quiescentes. Niveaux d'ARNm cycline D1 augmenter de manière significative sur les hydrogels raides mais pas sur des hydrogels mous. Données sont des moyennes + / - SD de réactions PCR en double.

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</ol>

Un élément crucial du processus de polymérisation hydrogel est d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air qui permettent aux cellules de se lier à la lamelle de verre plutôt que l&#39;hydrogel ECM revêtement lui-même. Ceci peut être évité en prenant soin de pipetage la solution de polymérisation après vortex et visuellement en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont devenus piégés dans le gel. Nous recommandons toujours la préparation supplémentaires &quot;réactive&quot; des lamelles et des hydrogels pour s...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldéhyde, 70 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Conserver à -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-aminopropyltriméthoxysilane, 97 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Liquide silonisant SurfaSil</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>NHS (ester de N-hydroxysuccinimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C. Remplacer mensuellement</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin, essentiellement dépourvue d'acides gras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lames couvre-objets (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

La rigidité des tissus est un déterminant important de la fonction cellulaire, et des changements dans la rigidité des tissus sont couramment associés à la fibrose, le cancer et les maladies cardiovasculaires 1-11. Des approches traditionnelles de cellules biologiques à l&#39;étude de la fonction cellulaire impliquent la culture de cellules sur un substrat rigide (plats en plastique ou en lamelles de verre) qui ne peuvent pas rendre compte de l&#39;effet d&#39;un ECM élastique ou les variations de la raideur d&#39;ECM entre les tissus. Pour le modèle in vivo les conditions de conformité des tissus in vitro, nous et d&#39;autres utilisent ECM enduits hydrogels. Dans notre laboratoire, les hydrogels sont à base de polyacrylamide qui peut imiter la gamme de tissus conformités vu biologiquement 12. «Réactive» lamelles sont générés par une incubation avec NaOH suivie par l&#39;addition de 3-APTMS. Le glutaraldéhyde est utilisé pour réticuler la 3-APTMS et le gel de polyacrylamide. Une solution d&#39;acrylamide (AC), le bis-acrylamide (Bis-AC) et le persulfate d&#39;ammonium est utilisé pour la polymérisation de l&#39;hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) est incorporé dans la solution CA pour réticuler ECM de protéines pour l&#39;hydrogel. Après la polymérisation de l&#39;hydrogel, la surface du gel est recouvert d&#39;une protéine d&#39;ECM de choix tels que la fibronectine, vitronectine, collagène, etc La rigidité d&#39;un hydrogel peut être déterminé par la rhéologie ou la microscopie à force atomique (AFM) et ajustée en faisant varier le pourcentage de CA et / ou le bis-AC dans la solution 12. De cette manière, la rigidité du substrat peut être adaptée à la rigidité des tissus biologiques qui peuvent également être quantifiés à l&#39;aide de rhéologie ou AFM. Les cellules peuvent ensuite être ensemencées sur ces hydrogels et cultivée en fonction des conditions expérimentales nécessaires. Imagerie des cellules et leur récupération pour l&#39;analyse moléculaire est simple. Pour cet article, nous définissons des substrats souples que ceux ayant modules d&#39;élasticité (E) &lt;3000 Pascal et substrats rigides / tissus comme ceux avec E&gt; 20 000 Pascal.

L&#39;effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être modélisé<em&gt; In vitro</em&gt; En utilisant des hydrogels de polyacrylamide de différentes conformités.

La rigidité tissulaire est un déterminant important de la fonction cellulaire, et les modifications de la rigidité tissulaire sont couramment associées à la fibrose, au cancer et...

Pour modéliser la compliance tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide. Cette approche est réalisée en premier lieu en générant des lamelles inférieures réactives et des lamelles supérieures silanisées. La deuxième étape de la procédure consiste à verser et former les hydrogels d'acrylamide.La troisième étape de la procédure consiste à réticuler la protéine de matrice extracellulaire choisie au sein de l'hydrogel. La dernière étape de la procédure est l'incubation et l'analyse des cellules. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant comment la compliance variable de la matrice extracellulaire in vitro régule le comportement cellulaire par des analyses réalisées au moyen de microscopie d'immunofluorescence, de PCR quantitative en temps réel et de western blotting.Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de fabrication et d'utilisation des hydrogels d'acrylamide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la rigidité de la matrice extracellulaire régule la morphologie cellulaire, la signalisation cellulaire et la prolifération. Commençons donc.Commencez cette procédure en préparant des lamelles réactives. Placez d'

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Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d'ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Cette vidéo présente un test permettant d’étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) sur l’infection bactérienne des cellules adhérentes. Des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, recouverts de collagène, sont superposés dans une plaque multi-puits pour imiter la rigidité de l’ECM physiologique. Lors de la superposition de cellules endothéliales humaines sur les hydrogels et de l’infection des cellules avec des bactéries Listeria monocytogenes conçues pour...

Un test pour étudier l’impact de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’infection bactérienne

Nous présentons une nouvelle hydrogel de polyacrylamide, appelé hydroxy-PAAm, qui permet une liaison directe de protéines de la MEC avec un coût ou une expertise minimale. La combinaison de l'hydroxy-PAAm hydrogels avec l'impression microcontact facilite le contrôle indépendant de nombreux indices du microenvironnement cellulaire naturel pour l'étude mechanostransduction cellulaire.

Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d'hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Préparation de l&#39;ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Nous avons synthétisé et caractérisé un substrat à base de gélatine accordable pour la culture de cellules endothéliales vasculaires (CE) dans des conditions de flux vasculaire pertinentes. Cette surface biomimétique reproduit à la fois des conditions physiologiques et pathologiques, permettant d’étudier les forces mécaniques sur le comportement des CE et de faire progresser notre compréhension de la santé vasculaire et des mécanismes de la maladie.

Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

Bien que la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) soit un régulateur clé du comportement cellulaire, les mécanismes sous-jacents de détection et de transduction restent flous. Pour y remédier, nous proposons des protocoles permettant de créer des substrats à base de polyacrylamide et de silicone avec une rigidité réglable afin de faire progresser notre compréhension de la diaphonie cellulaire-ECM.

Génération de substrats de matrice extracellulaire en polyacrylamide et silicone avec rigidité définie pour des applications en biologie cellulaire

Découvrez comment modéliser la rigidité tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide pour étudier le comportement cellulaire. Cette méthode combine microscopie à immunofluorescence, PCR quantitative et western blotting.

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l'acrylamide basée hydrogels

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