Name: Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant lacrylamide basée hydrogels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez comment modéliser la rigidité tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide pour étudier le comportement cellulaire. Cette méthode combine microscopie à immunofluorescence, PCR quantitative et western blotting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le travail est notre laboratoire est soutenu par des subventions du National Institutes of Health.

Préparation <ul><li> Lamelles doivent être autoclavés. </li><li> Eau distillée stérile ou déminéralisée doit être utilisée pour préparer des solutions et des lamelles à laver. </li><li> AC (40% p / v) et de bis-secteur (1% p / v) solutions sont stérilisées par filtration 0,2 um. Préparer le persulfate d'ammonium à 10% (APS, l'eau 100μg/ml) peu avant l'utilisation et le filtre stérile. Remplacer la solution APS mensuelle. </li><li> Réactifs chimiques tels que 3-APTMS, le chloroforme, glutaradehyde, NHS, et SurfaSil qui ne peuvent pas être autoclavés sont conservés dans une bouteille assigné utilisés uniquement pour la préparation d'hydrogels. </li><li> Pour de meilleurs résultats, les hydrogels devraient être utilisées au sein d'une couple de jours après la nuit d'incubation avec la protéine appropriée ECM. </li><li> Préparer une solution SurfaSil 10% dans le chloroforme (10 ml est généralement suffisant pour 20 lamelles en haut) dans un tube de 50 ml en polypropylène Falcon avant de couler de l'hydrogel. (Notre laboratoire siliconizes habituellement le couvre-dessus lors de l'étape d'incubation glutaraldéhyde 0,5%). Ajouter les lamelles sur le tube de Falcon et de roche pour au moins 10 min. Décanter la solution SurfaSil et l'air sec sur les lamelles Kimwipes dans l'enceinte de sécurité biologique où les hydrogels sera préparé. </li><li> Préparer la solution de BSA inactivée par la chaleur comme suit: a 20 mg / ml, solution d'acides gras libres dans le PBS BSA est incubé dans un bain d'eau à 68 ° C pendant 30 min. La solution est alors filtré stérile et stocké à 4 ° C. </li></ul> Procédure <ol><li> Placez une couche de parafilm sur la moitié inférieure d'un plat de Pétri de 150 mm. </li><li> Placez jusqu'à 9 lamelles de 25 mm sur le dessus du Parafilm et les couvrir avec 1 ml de NaOH 0,1 M. Incuber pendant 3 min, puis aspirer avec une ligne vide. </li><li> Travailler dans une hotte chimique, placer 0,5 ml 3-APTMS sur chaque lamelle. Incuber pendant 3 min, puis aspirer le APTMS. Si vous attendez trop longtemps, une mousse se forme. </li><li> Rincez les lamelles une fois avec 20 ml d'eau désionisée dans le même plat. Retirez les lamelles de l'antenne en utilisant une pince incurvée et de les transférer, avec leur traité côté vers le haut, à un nouveau plat de 150 mm. Lavez les lamelles avec de l'eau déminéralisée à trois reprises, sur la bascule, pendant 10 min à chaque lavage. Si vous n'arrivez pas à supprimer tous les APTMS, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l'étape suivante et laissez un précipité blanc laiteux (figure 1). </li><li> Décongeler les glutaraldéhyde (~ 10 min avant utilisation). </li><li> En utilisant des pinces courbes, transférer les lamelles dans un plat propre couches de Parafilm et aspirer tout le liquide restant. Utilisez une ligne vide ou Kimwipe pour éponger l'eau restante, au besoin. </li><li> Couvrir chaque lamelle complètement avec 0,5 ml de glutaraldéhyde à 0,5% dans de l'eau déminéralisée stérile et incuber pendant 30 min dans une hotte chimique. Aspirer le glutaraldéhyde. Rincez et lavez les lamelles comme dans l'étape 4. Sécher les lamelles complètement. [Vous pouvez vous arrêter là et laisser les lamelles pendant plusieurs semaines dans un endroit sec]. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à préparer les hydrogels, utilisez une pince incurvée pour transférer les lamelles, jusqu'à côté réactif, d'une feuille de Parafilm qui a été enregistré sur la surface de l'enceinte de sécurité biologique. Assurez-vous que les lamelles sont à plat sur la surface Parafilm. </li><li> Préparez une solution saturée du NHS dans le toluène. (Dissoudre une petite quantité de NHS en assez de toluène pendant l'expérience particulière. Continuez à ajouter peu à peu jusqu'à ce NHS le NHS ne se dissout plus. La solution saturée est généralement nuageux et rose.) </li><li> Ensuite, préparer l'acrylamide, le bis-acrylamide, l'eau et l'APS pour atteindre le pourcentage d'acrylamide désiré. Ajouter les réactifs dans des microtubes comme indiqué ci-dessous pour un volume total de 0,8 ml. </li><li> Ensuite, une aliquote à un moment, ajoutez le NHS et TEMED à la solution 0,8 ml AC, vortex brièvement et verser immédiatement 3-5 gels en utilisant 140 ul par lamelle dans la hotte de sécurité biologique. Autant que possible, toutes les étapes de ce point devrait être effectué dans une enceinte de sécurité biologique. [Note: des lamelles de tailles différentes peuvent être utilisées en fonction des besoins. Si 18 mm lamelles sont utilisées, l'utilisation ~ 33 ul solution CA par lamelle et une lamelle de 18 mm supérieure siliconée.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (rigide) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 (soft) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Placer rapidement l'siliconé de 25 mm lamelle sur le dessus de chaque gel avant qu'il ne commence à se polymériser. Ajout de la lamelle supérieure doit permettre à l'AC pour couvrir complètement la lamelle du bas. Incuber ce «sandwich» à température ambiante jusqu'à ce que le CA se polymérise. (Vérifiez la solution résiduelle AC dans le tube à centrifuger pour déterminer quand la polymérisation s'est produite. Généralement que quelques minutes pour les gels rigides et un peu plus long pour les doux suffira.). </li><li> Soigneusement ramasser les sandwichs (gants stériles sur!) Et faites glisser la lamelle supérieure jusqu'à ce qu'elle surplombe le gel polymérisé. Vous pouvez alors le soulever hors gel. Si vous attendez trop longtemps avant d'enlever la lamelle supérieure, le gel va déchirer que la lamelle est retirée. </li><li> Jeter la lamelle supérieure. Placez le fond de gel des lamelles (ci-après appelé l'hydrogel) dans des plaques 6 puits avec 2 ml de PBS / puits. PBS peuvent être ajoutés avant ou après le gel-lamelle à chaque puits. Lavez les hydrogels avec PBS à trois reprises, sur une bascule, à 5 min par lavage. </li><li> Répétez les étapes 11 à 14 jusqu'à ce que le nombre requis d'hydrogels ont été préparés. </li><li> Couvrir chaque hydrogel avec 2 ml d'une solution de fibronectine (3 pg / ml dans le PBS) ou de protéines ECM d'autres (voir Klein et al. 13 pour plus de détails.). La protéine ECM devient liée de manière covalente à l'hydrogel pendant une nuit d'incubation à 4 ° C. </li><li> Aspirer la solution d'ECM et de bloquer NHS n'ayant pas réagi avec 1mg/ml inactivé à la chaleur des acides gras libres dans le sérum de BSA-médias libres pendant au moins 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. Rincez les hydrogels une fois avec du PBS stérile ou de milieu de culture cellulaire. </li><li> Cellules de la plaque dans le milieu de culture approprié contenant FBS. Le nombre de cellules ensemencées sur l'hydrogel doit être déterminée par l'utilisateur basée sur le degré d'étalement cellulaire et la confluence requis pour l'expérimentation. Environ 10 5 cellules est généralement suffisante pour l'analyse western blot et qPCR. </li><li> Après la période d'incubation, les protéines cellulaires ou ARNm peut être extrait. Les lamelles sont soigneusement retirés du puits en utilisant une pince incurvée et placé (cellule vers le bas) sur le dessus de 100 gouttelettes ul de tampon de lyse qui ont été espacées (2-3cm) le long d'une feuille de parafilm sur la paillasse. (Nous utilisons tampon standard de l'échantillon SDS et TRIzol, respectivement, pour préparer des échantillons pour western blot et d'isoler l'ARN pour qPCR). Incuber les cellules avec le tampon de lyse pour exactement une minute. Retirez les lamelles et le transfert du tampon de lyse à un tube à centrifuger. Sinon, pour l'extraction d'ARN seulement, l'utilisateur peut transférer chaque hydrogel pour un nouveau 6-même assiette et ajouter 1ml de TRIzol / puits. Incuber pendant 3 minutes et retirer la solution pour le stockage dans TRIzol un microtube. </li></ol> Des informations supplémentaires sur les procédures telles que l'immunofluorescence, marquage BrdU, la transfection, etc pour les cellules ensemencées sur des hydrogels est décrite dans Klein et al. 2007 13. Les résultats représentatifs Lavage soigneux des lamelles après addition de APTMS est une étape importante dans la production de «réactive» des lamelles. Si on ne parvient pas à retirer le APTMS complètement, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l'étape suivante et de produire un précipité blanc laiteux comme on le voit dans la figure 1A. Figure 1B montre une lamelle correctement lavés et séchés. Si le précipité se développe, toute la procédure doit être recommencé depuis le début que la lamelle n'est plus utilisable. Après la formation d'hydrogel et le revêtement avec des protéines ECM nuit, les cellules peuvent être ensemencées le jour suivant. Comme la figure 2 montre, il ya une nette différence entre les cellules épandage sur des hydrogels raides et douces. Comme peut être vu par coloration phalloïdine dans des fibroblastes de souris embryonnaires (MEF), les cellules réparties à une plus grande mesure sur les raides par rapport aux hydrogels mous. En effet, la plupart des cellules attachant à un hydrogel mou restera compact et attachent moins efficacement. Bien que la morphologie du MEF est montré dans la figure 2, la différence dans la cellule d'épandage est uniforme à travers plusieurs autres lignées cellulaires testées 11-12,14. Les secrets du succès <ol><li> Une fois la procédure est lancée, il est très important de garder les lamelles avec le «réactif» vers le haut et garder à l'esprit de quel côté a été enduit. </li><li> Les gants doivent être portés à tout moment pendant la procédure d'offrir un environnement de travail qui est aussi stérile que possible. </li><li> La plupart des étapes initiales sont effectuées entre une hotte et la table de laboratoire. Toutes les étapes ultérieuresà éliminer l'excès de glutaraldéhyde les lamelles doivent être exécutées sous une enceinte de sécurité biologique. </li><li> En raison de différences dans la cellule d'étalement (figure 2), nous recommandons l'ensemencement du double du nombre de cellules sur des hydrogels mous par rapport aux hydrogels raide. </li><li> Le procédé de polymérisation AC est extrêmement rapide. Pour les utilisateurs de première fois, on peut diminuer la quantité de l'APS ou TEMED dans la solution de prolonger le processus de polymérisation. Ne pas essayer de préparer plus d'un couvre-rares à la fois. </li><li> Dans les études du cycle cellulaire où la synchronisation dans G0 est nécessaire, nous avons l'habitude de sérum affamer les cellules dans des boîtes de culture en plastique, trypsiniser les cellules et les réensemencer sur les hydrogels de conformités différente en présence de mitogènes (FBS et / ou facteurs de croissance). Cette procédure garantit que la population de départ de G0-synchronisés cellules est identique dans tous les échantillons. Cependant, de nombreuses études de transduction du signal, la période de stimulation mitogène requise ne peut être suffisamment longue pour permettre l'attachement et la propagation des cellules. Dans ce cas, nous sérum affamer les cellules sur les hydrogels et ensuite directement les stimuler avec des mitogènes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Figure 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1a"> Figure 1A. Mal lavés lamelle. Après ajout de APTMS, lamelle a été lavé pendant 1-2 minutes avant l'addition de la solution de glutaraldéhyde. Un précipité se forme sur la lamelle qui n'a pas été lavés selon les étapes décrites dans la procédure. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Figure 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1b"> Figure 1B. Correctement lavés lamelle. Après l'addition des APTMS, lamelle a été lavé trois fois de 10 minutes chacune, avant addition de la solution de glutaraldéhyde. Aucun précipité se forme sur la lamelle. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Morphologie des cellules sur des hydrogels de différentes raideurs. Établie FAE ont été ensemencées sur fibronectine revêtement hydrogels de rigidité élevée ou basse pendant 9 heures. Après la période d'incubation, les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec FITC-phalloïdine qui se lie à la F-actine. FAE sur des gels présentent une grande rigidité des fibres de stress et sont bien réparties par rapport à celles ensemencées sur les hydrogels faible rigidité. Barre d'échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant la PCR quantitative raison des niveaux de la cycline D1 souris ARNm. Sérum fibroblastes de souris affamée embryonnaires ont été plaquées sur élevé (3% d'acrylamide) ou faible rigidité des hydrogels (0,3% d'acrylamide) et stimulées avec du FBS à 10% pour 9 heures. Suite à l'extraction d'ARN, analyse en temps réel de PCR quantitative a été réalisée pour D1 niveaux d'ARNm cycline (normalisée à l'ARN 18S). G0 représente cycline D1 ARNm de cellules quiescentes. Niveaux d'ARNm cycline D1 augmenter de manière significative sur les hydrogels raides mais pas sur des hydrogels mous. Données sont des moyennes + / - SD de réactions PCR en double.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

Un élément crucial du processus de polymérisation hydrogel est d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air qui permettent aux cellules de se lier à la lamelle de verre plutôt que l&#39;hydrogel ECM revêtement lui-même. Ceci peut être évité en prenant soin de pipetage la solution de polymérisation après vortex et visuellement en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont devenus piégés dans le gel. Nous recommandons toujours la préparation supplémentaires &quot;réactive&quot; des lamelles et des hydrogels pour s...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldéhyde, 70 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Conserver à -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-aminopropyltriméthoxysilane, 97 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Liquide silonisant SurfaSil</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>NHS (ester de N-hydroxysuccinimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C. Remplacer mensuellement</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin, essentiellement dépourvue d'acides gras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lames couvre-objets (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

La rigidité des tissus est un déterminant important de la fonction cellulaire, et des changements dans la rigidité des tissus sont couramment associés à la fibrose, le cancer et les maladies cardiovasculaires 1-11. Des approches traditionnelles de cellules biologiques à l&#39;étude de la fonction cellulaire impliquent la culture de cellules sur un substrat rigide (plats en plastique ou en lamelles de verre) qui ne peuvent pas rendre compte de l&#39;effet d&#39;un ECM élastique ou les variations de la raideur d&#39;ECM entre les tissus. Pour le modèle in vivo les conditions de conformité des tissus in vitro, nous et d&#39;autres utilisent ECM enduits hydrogels. Dans notre laboratoire, les hydrogels sont à base de polyacrylamide qui peut imiter la gamme de tissus conformités vu biologiquement 12. «Réactive» lamelles sont générés par une incubation avec NaOH suivie par l&#39;addition de 3-APTMS. Le glutaraldéhyde est utilisé pour réticuler la 3-APTMS et le gel de polyacrylamide. Une solution d&#39;acrylamide (AC), le bis-acrylamide (Bis-AC) et le persulfate d&#39;ammonium est utilisé pour la polymérisation de l&#39;hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) est incorporé dans la solution CA pour réticuler ECM de protéines pour l&#39;hydrogel. Après la polymérisation de l&#39;hydrogel, la surface du gel est recouvert d&#39;une protéine d&#39;ECM de choix tels que la fibronectine, vitronectine, collagène, etc La rigidité d&#39;un hydrogel peut être déterminé par la rhéologie ou la microscopie à force atomique (AFM) et ajustée en faisant varier le pourcentage de CA et / ou le bis-AC dans la solution 12. De cette manière, la rigidité du substrat peut être adaptée à la rigidité des tissus biologiques qui peuvent également être quantifiés à l&#39;aide de rhéologie ou AFM. Les cellules peuvent ensuite être ensemencées sur ces hydrogels et cultivée en fonction des conditions expérimentales nécessaires. Imagerie des cellules et leur récupération pour l&#39;analyse moléculaire est simple. Pour cet article, nous définissons des substrats souples que ceux ayant modules d&#39;élasticité (E) &lt;3000 Pascal et substrats rigides / tissus comme ceux avec E&gt; 20 000 Pascal.

L&#39;effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être modélisé<em&gt; In vitro</em&gt; En utilisant des hydrogels de polyacrylamide de différentes conformités.

La rigidité tissulaire est un déterminant important de la fonction cellulaire, et les modifications de la rigidité tissulaire sont couramment associées à la fibrose, au cancer et...

Pour modéliser la compliance tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide. Cette approche est réalisée en premier lieu en générant des lamelles inférieures réactives et des lamelles supérieures silanisées. La deuxième étape de la procédure consiste à verser et former les hydrogels d'acrylamide.La troisième étape de la procédure consiste à réticuler la protéine de matrice extracellulaire choisie au sein de l'hydrogel. La dernière étape de la procédure est l'incubation et l'analyse des cellules. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant comment la compliance variable de la matrice extracellulaire in vitro régule le comportement cellulaire par des analyses réalisées au moyen de microscopie d'immunofluorescence, de PCR quantitative en temps réel et de western blotting.Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de fabrication et d'utilisation des hydrogels d'acrylamide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la rigidité de la matrice extracellulaire régule la morphologie cellulaire, la signalisation cellulaire et la prolifération. Commençons donc.Commencez cette procédure en préparant des lamelles réactives. Placez d'abord une couche de parafilm sur la moitié inférieure d'une boîte de Pétri de 150 millimètres. Transférez ensuite jusqu'à neuf lamelles de 25 millimètres stérilisées à l'autoclave sur le parafilm et recouvrez-les d'un millilitre de soude à 0,1 molaire.Incuber les lamelles pendant trois minutes. Après l'incubation, aspirer l'hydroxyde de sodium à l'aide d'une ligne sous vide en travaillant sous hotte chimique, puis pipeter 0,5 millilitre de triméthylsilylpropylamine ou 3-A-P-T-M-S sur chaque lamelle. Incuber les lamelles pendant trois minutes, puis aspirer le 3-A-P-T-M-S. Prendre garde de ne pas prolonger l'incubation afin d'éviter la formation d'écume sur la lamelle.Préparations après traitement. Rincer les lamelles une fois avec 20 millilitres d'eau déionisée dans le même plat. Retirer les lamelles du plat à l'aide de pinces courbes et les transférer, côté traité vers le haut, dans un nouveau plat de 150 millimètres.Ensuite, lavez à nouveau les lamelles avec de l'eau déionisée et placez-les sur l'agitateurbasculant pendant 10 minutes. Après l'incubation, retirez l'eau et effectuez deux lavages supplémentaires. Il est très important d'éliminer complètement le A-P-T-M-S afin qu'il ne réagisse pas avec le glutaraldéhyde et ne forme pas de précipité blanc trouble 10 minutes avant l'utilisation du glutaraldéhyde.À l’aide de pinces courbes, transférer les lamelles dans une boîte propre recouverte de paraffine et aspirer tout liquide résiduel à l’aide d’une ligne sous vide. Recouvrir ensuite complètement chaque lamelle de 0,5 millilitre de glutaraldéhyde à 0,5 % dans de l’eau stérile déionisée afin de réticuler les trois A-P-T-M-S et le gel de polyacrylamide. Incuber les lamelles pendant 30 minutes dans une hotte chimique. Puis aspirer la solution de glutaraldéhyde et laver à nouveau les lamelles avec de l’eau déionisée.Ensuite, séchez complètement les lamelles. Ajoutez de nouvelles lamelles dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant une solution de scellement de surface à 10 % dans du chloroforme et agitez pendant au moins 10 minutes. Versez délicatement la solution de scellement de surface et laissez sécher à l'air. Placer les lamelles sur des essuie-tout Kim dans la hotte de sécurité biologique où seront préparés les hydrogels, afin de commencer la préparation des hydrogels. Utiliser des pinces courbes pour transférer les lamelles, côté réactif vers le haut, sur une feuille de paraforme fixée avec du ruban adhésif à la surface de la hotte de sécurité biologique. Veiller à ce que les lamelles soient bien à plat sur la surface de la paraforme.Préparez ensuite une solution saturée d'aide CIN hydroxy ou de NHS dans le toluène en dissolvant une petite quantité de NHS dans suffisamment de toluène. Pour les expériences spécifiques, ajoutez de petites quantités de NHS jusqu'à ce que le NHS ne se dissolve plus. La solution saturée est généralement trouble et rose.Ensuite, préparez l'acrylamide, le BIS acrylamide, l'eau et un PS pour atteindre le pourcentage d'acrylamide souhaité. Ajoutez les réactifs aux tubes de micro-utilisation selon le protocole écrit. Ensuite, un aliquot à la fois.Ajouter le NHS et le TM me. Vortexer brièvement le tube, puis verser immédiatement entre trois et cinq gels en utilisant 140 microlitres par lame dans les hottes de sécurité biologique. Placer rapidement la lame de 25 millimètres SILICONÉE sur chacun des gels avant qu'il ne commence à polymériser.L'ajout de la lame couvre-object supérieure permettra à l'acrylamide de recouvrir complètement la lame couvre-object inférieure. Incuber ce sandwich à température ambiante jusqu'à ce que l'acrylamide polymérise afin de déterminer quand la polymérisation s'est produite. Vérifier la solution d'acrylamide résiduelle dans le tube de microcentrifugation.La polymérisation prendra quelques minutes pour les gels rigides et un peu plus longtemps pour les gels mous. Une fois la polymérisation terminée, soulevez délicatement le sandwich en portant des gants stériles. Ensuite, faites glisser la lame supérieure jusqu'à ce qu'elle dépasse le gel polymérisé.Ensuite, soulevez le couvercle. Retirez le gel et jetez la lame supérieure. Placez chaque lame inférieure du gel, appelée par la suite hydrogel, dans une plaque de six puits.Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS par puits d'une plaque à six puits. Lavez ensuite les hydrogels avec du PBS et incubez-les sur un agitateur rotatif pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois.Pour commencer l'expérience, recouvrez chaque hydrogel de deux millilitres d'une solution de fibronectine ou d'une autre protéine de la matrice extracellulaire. Incubez la protéine sur l'hydrogel toute la nuit à quatre degrés Celsius afin de permettre sa liaison covalente à l'hydrogel ; après une incubation nocturne, aspirez la solution de matrice extracellulaire. Bloquez ensuite les groupes NHS non réagis avec une solution d'albumine sérique bovine sans acide gras, activée par chauffage, à une concentration d'un milligramme par millilitre dans un milieu sans sérum, et incubez pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius.Après l'incubation, laver les hydrogels une fois avec du PBS stérile. Ensuite, ensemencer les cellules dans le milieu de culture approprié contenant du sérum de veau fœtal sur l'hydrogel ici.Des fibroblastes embryonnaires de souris établis sont utilisés. Déterminez le nombre de cellules à semer sur l'hydrogel en fonction du degré d'aplatissement et de confluence cellulaire requis pour l'expérimentation. Environ 10 puissance cinq cellules sont nécessaires pour l'analyse par immunobuvardage et par PCR quantitative.Incubez ensuite les cellules dans des conditions adaptées au type cellulaire spécifique. À l'issue de la période d'incubation, extrayez les protéines cellulaires ou l'ARNm selon les besoins.Prélèvez à la pipette des gouttes de 100 microlitres de tampon de lyse et déposez-les sur une feuille de paraforme posée sur le plan de travail, en laissant environ deux à trois centimètres entre chaque goutte. Ensuite, retirez délicatement chaque hydrogel en soulevant la lame inférieure du puits. À l’aide de pinces courbes, placez-les côté cellules vers le bas sur le dessus des gouttes.Incubez les cellules avec le tampon de lyse pendant exactement une minute. Enfin, retirez les lamelles et transférez le tampon de lyse dans un tube de microcentrifugeuse. Alternativement, lors de l'extraction de l'ARN, transférez chaque hydrogel dans une nouvelle plaque à six puits et ajoutez un millilitre de triazole par puits.Incuber les gels pendant trois minutes après l'incubation. Retirer la solution de triazole pour la conserver dans un tube de microcentrifugeuse. Un lavage soigneux des lamelles après l'ajout d'A-P-T-M-S constitue une étape importante pour produire des lamelles réactives.Les lamelles correctement lavées et sèches sont exemptes de tout résidu de précipité. L'A-P-T-M-S réagira avec le glutaraldéhyde et produira un précipité blanc et trouble. Si un précipité apparaît, la procédure entière doit être répétée, car la lamelle n'est plus utilisable.Après la formation de l'hydrogel et son revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire, les cellules sont ensemencées pendant la nuit. On observe une différence marquée entre l'expansion cellulaire sur des hydrogels rigides par rapport à des hydrogels mous, comme le montre le repliement observé en coloration, les fibroblastes embryonnaires de souris s'étalant davantage sur les hydrogels rigides que sur les hydrogels mous. En effet, la majorité des cellules s'attachant à un hydrogel mou restent compactes et s'adhèrent moins efficacement.Des résultats représentatifs de PCR quantitative des niveaux d'ARNm de la cycline D1 dans des fibroblastes embryonnaires de souris montrent que la cycline D1 est significativement surexprimée sur une matrice rigide, mais pas sur une matrice souple. Cela suggère que la rigidité de la matrice régule la progression du cycle cellulaire in vitro. Nous venons de vous montrer comment générer des hydrogels de rigidité variable, modélisant ainsi les conditions physiologiques in vivo. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer des lamelles réactives supplémentaires, car des accidents et des erreurs peuvent survenir.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d'ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Cette vidéo présente un test permettant d’étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) sur l’infection bactérienne des cellules adhérentes. Des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, recouverts de collagène, sont superposés dans une plaque multi-puits pour imiter la rigidité de l’ECM physiologique. Lors de la superposition de cellules endothéliales humaines sur les hydrogels et de l’infection des cellules avec des bactéries Listeria monocytogenes conçues pour...

Un test pour étudier l’impact de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’infection bactérienne

Nous présentons une nouvelle hydrogel de polyacrylamide, appelé hydroxy-PAAm, qui permet une liaison directe de protéines de la MEC avec un coût ou une expertise minimale. La combinaison de l'hydroxy-PAAm hydrogels avec l'impression microcontact facilite le contrôle indépendant de nombreux indices du microenvironnement cellulaire naturel pour l'étude mechanostransduction cellulaire.

Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d'hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Préparation de l&#39;ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Ce protocole décrit l'utilisation de micro-injection et l'imagerie à haute résolution dans...

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

Nous présentons des protocoles pour les 3 dimensions (3D) d'encapsulation des cellules à l'intérieur des hydrogels synthétiques. La procédure d'encapsulation est décrite pour les deux méthodes couramment utilisées de réticulation (type Michael addition et la lumière à l'initiative gratuite mécanismes radicale), ainsi qu'un certain nombre de techniques pour évaluer le comportement des cellules encapsulées.

Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l&#39;ingénierie tissulaire

Découvrez comment modéliser la rigidité tissulaire in vivo à l'aide d'hydrogels d'acrylamide pour étudier le comportement cellulaire. Cette méthode combine microscopie à immunofluorescence, PCR quantitative et western blotting.

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l'acrylamide basée hydrogels

Explorer plus de vidéos