Microscopie quantitative à intervalle temporel pour l’évaluation de la dissémination bactérienne dépendante de la rigidité de la matrice extracellulaire

Prenez une plaque multi-puits avec des monocouches de cellules endothéliales humaines adhérentes sur des hydrogels de polyacrylamide recouverts de collagène de rigidité variable.

Les cellules sur des hydrogels plus rigides subissent une réorganisation cytosquelettique importante, augmentant la tension intracellulaire, par rapport aux hydrogels plus mous.

Lavez les cellules avec un milieu et ajoutez-y Listeria monocytogenes modifié, exprimant une protéine fluorescente sous le promoteur de la protéine induisant l’assemblage de l’actine (ActA).

Centrifugeuse pour faciliter le contact cellule-bactérie. Incuber pour médier l’endocytose bactérienne.

Laver avec un média. Traiter avec de la gentamicine pour éliminer les bactéries non internalisées. Couver.

Les bactéries internalisées libèrent des toxines formant des pores, perturbant les membranes phagosomiques. Les bactéries cytosoliques régulent à la hausse l’expression de l’ActA et des protéines fluorescentes, marquant les bactéries intracellulaires.

Les protéines ActA induisent la polymérisation de l’actine, formant une queue de comète d’actine propulsant les bactéries vers l’avant, provoquant l’internalisation par les cellules voisines et favorisant la dissémination.

Après l’incubation, utiliser un milieu contenant un colorant pour colorer les noyaux cellulaires. Remplacez les supports par des supports contenant de la gentamicine.

Effectuez une microscopie time-lapse.

Les hydrogels plus mous favorisent la propagation intercellulaire rapide des bactéries par rapport aux hydrogels plus rigides avec une tension intracellulaire accrue, suggérant une dissémination bactérienne dépendante de la rigidité de la matrice.

Après avoir préparé une culture nocturne de L. monocytogenes selon le protocole textuel, transférez 1 millilitre de la culture dans un tube de microcentrifugation et faites-le tourner à 2 000 fois g et à température ambiante pendant 4 minutes. Après avoir utilisé du PBS de qualité culture tissulaire pour laver la pastille deux fois, utilisez 1 millilitre de PBS pour remettre la pastille en suspension.

Préparez le mélange d’infection en combinant 10 ou 50 microlitres de suspension bactérienne avec 1 millilitre de milieu complet MCDB-131 pour une multiplicité d’infection, ou MOI, d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par cellule hôte. Retirez le milieu des puits des plaques de 24 puits en prenant soin de ne pas perturber les hydrogels ou les cellules.

Utilisez 1 millilitre de milieu complet MCDB-131 pour laver les cellules une fois, puis ajoutez 1 millilitre de bactéries dans chaque puits. Placez le couvercle sur les assiettes et enveloppez-les d’un film alimentaire en polyéthylène pour éviter les fuites. Centrifugez les plaques à 2 000 x g pendant 10 minutes pour synchroniser l’invasion. Ensuite, incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Avec le milieu complet MCDB-131, lavez les échantillons 4 fois et retournez-les dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 30 minutes supplémentaires, remplacez le milieu par du milieu complet MCDB-131 complété par 20 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Après avoir ensemencer des cellules HMEC-1 sur des hydrogels PA et les avoir traitées avec de la gentamicine conformément au protocole de texte, incubez la plaque pendant cinq heures pour permettre au promoteur ActA de s’activer et de stimuler l’expression du cadre de lecture ouvert mTagRFP.

Quatre heures après l’infection, mélangez 1 microlitre de colorant Hoechst à 1 mg/ml avec 1 millilitre de milieu complet L15 et ajoutez-le dans chaque puits pour colorer les noyaux. Après avoir incubé les cellules pendant 10 minutes, remplacez le milieu par 1 millilitre de milieu complet L15 complété par 20 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Imagez plusieurs positions toutes les 5 minutes à l’aide d’une fonction de mise au point automatique pour surveiller la propagation des bactéries LM à travers les monocouches HMEC-1 ensemencées sur des hydrogels à rigidité variable.