Name: Les méthodes de détection quantitative danticorps induite par lactivation du complément sur les globules rouges (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Découvrez deux méthodes quantitatives pour mesurer l'activation du complément par des anticorps anti-globules rouges. Ces techniques utilisent la cytométrie en flux et la spectrométrie pour améliorer le diagnostic clinique.

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Une. Préparation des globules rouges broméline traités <ol><li> Globules rouges Laver 0 typées 3x avec 1x PBS (centrifugation à 664 g pendant 2-5 min). </li><li> Incuber 1 volume de globules rouges emballées avec deux volumes d&#39;une solution de broméline à 0,5% pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules 3x avec PBS 1x. </li><li> Les cellules peuvent être stockées sous la forme d&#39;une solution à 3% à 4 ° C dans 1 x de PBS pendant au moins une semaine. </li></ol> 2. C3 et C4 dépôt analyse des globules rouges par FACS <ol><li> Inactiver à la chaleur la quantité requise de sérum d&#39;un patient (ou une autre source d&#39;anticorps anti-RBC) en chauffant l&#39;échantillon pendant 30 min à 56 ° C. </li><li> Laver les hématies de bromélaïne traitée trois fois dans VBG - (5 mM véronal, NaCl 150 mM, 0,05% de gélatine, pH 7,4) et les remettre en suspension dans VBG + + (VBG - + 2 mM de MgCl2 + 10 mM de CaCl2) pour donner un solution à 0,5%. </li><li> Introduire à la pipette les éléments suivants dans une plaque à fond rond avec une perle de verre (fou un mélange approprié): 25 pi 0,5% de globules rouges, 37,5 ul de sérum frais AB (en complément) et 37,5 pi 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 est cher et peut être difficile à obtenir. On pourrait envisager d&#39;utiliser du sérum C5-/C6-/C7- ou C8 déficient au lieu de sérum AB et anti-C5. </li><li> Ajouter le sérum du patient par puits à une concentration finale de 0,1 à 33%. Corriger les différences de concentration de sérum par puits en raison utilisant du sérum AB inactivé à la chaleur. Ajouter VBG + + pour obtenir un volume final de 150 pl / puits. Fermer plaque avec une feuille ELISA. </li><li> Incuber 1,5-2 h à 37 ° C tout en agitant. </li><li> Laver les globules rouges trois fois avec du PBS + BSA à 0,5% (centrifugation à 664 g pendant 2 min). </li><li> Ajouter marquées par fluorescence anti-C3 et les anticorps monoclonaux anti-C4 ou leurs fragments Fab (pour réduire l&#39;agglutination) dans du PBS + 0,5% de BSA à une concentration finale de 1 pg / ml. Voici personnalisé développé des anticorps anti-C3-Alexa Fluor 488 et anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorps monoclonaux sont utilisés, le choix de these marqueurs fluorescents permet la détection simultanée de C3 et C4 par FACS. </li><li> Incuber 30 à 45 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Laver les globules rouges 3x avec PBS + 0,5% de BSA. </li><li> Remettre en suspension les globules rouges 150 pi dans du PBS 0,5% de BSA et la pipette dans un nouveau plateau (pour se débarrasser des perles de verre avant l&#39;analyse FACS). </li><li> Effectuer une analyse FACS. Des cellules individuelles de doublets dans une dispersion de traçage FSC-A; mis la porte sur les globules rouges simples et sélectionnez le canal de détection approprié pour les signaux de fluorescence (par exemple FITC et APC). </li><li> Quantifier les résultats en utilisant l&#39;intensité médiane de fluorescence. </li></ol> Note: Il est possible d&#39;utiliser un contrôle isotypique (par exemple marqué par fluorescence anti-IL6 souris IgG1). Cependant, il est recommandé d&#39;inclure un véritable témoin négatif, par exemple par incubation de globules rouges sans sérum de patient (seulement de sérum AB) ou en l&#39;absence d&#39;une source de complément (sérum AB inactivé par la chaleur et le sérum du patient inactivé par la chaleur), und puis colorer ces avec le même anti-C3-Alexa Fluor 488 et anti-C4-Alexa Fluor 647 anticorps. On obtient ainsi un contrôle plus valide que l&#39;isotype contrôle dans le cas de globules rouges 12, bien que ces différents contrôles donnent généralement la même, résultat négatif. 3. Dosage hémolytique quantitative <ol><li> Inactiver à la chaleur la quantité requise de sérum du patient (ou une autre source d&#39;anticorps anti-RBC) par chauffage de l&#39;échantillon de 30 min à 56 ° C. </li><li> Laver les globules rouges 3x VBG - et une fois avec VBG + +. </li><li> Introduire à la pipette les éléments suivants dans une plaque à fond rond avec une perle de verre (pour un bon mélange): 35 pi 3% des globules rouges, 25 pl frais sérum AB (en complément) et 1-50% de sérum du patient. Corriger les différences de concentration dans le sérum à l&#39;aide de sérum AB inactivé par la chaleur. Ajouter VBG + + pour obtenir un volume final de 150 pl / puits. Fermer plaque avec une feuille ELISA. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1,5 à 2 heures avec agitation. </li><li> Cplaque entrifuge à 664 g pendant 5 min avec une décélération réduite (par exemple de décélération pour s&#39;immobiliser dans 2-3 min). </li><li> Pipetage soigneux 90 pi surnageant dans une nouvelle plaque de microtitration. Il est important à cette étape pour éviter les bulles d&#39;air et pour éviter de prendre le long des cellules intactes. </li><li> Mesurer A414/690 dans un spectrophotomètre approprié. </li><li> Exprimer la lyse en pourcentage de la lyse des hématies d&#39;un échantillon avec de l&#39;eau pure. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les dosages ci-dessus sont reproductibles et robuste. Ils sont faciles à réaliser et il est possible de les réaliser avec de nombreux échantillons à la fois (dans une plaque à 96 puits). Par conséquent, cette approche serait également approprié pour un système entièrement automatisé, par exemple un système de robot ELISA. Par contraste avec les techniques actuellement utilisées, ces dosages sont quantitatifs et cela aide par exemple dans l&#39;étude de l&#39;effet des inhibiteurs du complément. En outr...

Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peut être induite par la transfusion de globules rouges exprimant un antigène qui n&#39;est pas présent sur les globules rouges de destinataire. Ces allo-anticorps peuvent provoquer de graves réactions transfusionnelles hémolytiques aiguës dues à l&#39;activation du complément sur ​​la transfusion 5 suivant. En cas d&#39;anémie hémolytique auto-immune (AHAI), les patients ont des auto-anticorps contre leurs propres globules rouges. Cela conduit à la clairance accélérée des cellules via l&#39;interaction de l&#39;IgG lié à hématies avec les récepteurs Fcy sur des phagocytes dans la rate et / ou dans les cas d&#39;auto-anticorps capables d&#39;activer le complément par l&#39;intermédiaire de récepteurs du complément dans le foie 6,7. L&#39;activation du complément fulminante résultant de l&#39;hémolyse intravasculaire est rare mais souvent fatale. Accélérée, compléter la destruction des hématies médiation induite soit par des résultats d&#39;allo-ou auto-anticorps dans l&#39;anémie aiguë et une hypoxie tissulaire donc potentiellement mortelle. Les auto-anticorps dans AHAI sont classés dans les anticorps chauds et froids, depending à la température optimale, ils se lient à des globules rouges (37 ° C ou plus bas, respectivement). Les anticorps chauds sont généralement de l&#39;isotype IgG et les anticorps IgM froides de l&#39;isotype 8,9. AIHA peut être secondaire à des troubles lymphoprolyferative par exemple, des maladies des tissus conjonctifs, les tumeurs solides, des infections ou des médicaments, mais dans 50% des cas AIHA 9 est idiopathique. Détection des gammaglobulines (p. ex. IgG ou IgM) et compléter lié à globules rouges du patient est réalisée au moyen d&#39;un Coombs direct semi-quantitative (Coombs) d&#39;essai (DAT). Dans la DAT globules rouges de patients sont incubés avec des anticorps anti-IgG ou anti-C3d. Présence de RBC agglutination démontre la présence de composants du complément attachés ou liaison de l&#39;IgG. Détection des allo-ou auto-anticorps dans le sérum du patient est réalisée par l&#39;intermédiaire du test de Coombs indirect (IAT). Dans l&#39;IAT, les globules rouges de test bromélaïne traitées sont incubées avec le sérum du patient, lavées puis incubées avec des anticorps anti-human IgG. Dans le cas où les globules rouges ont été sensibilisées avec un anticorps anti-IgG RBC présent dans le sérum du patient d&#39;agglutination va se produire. IgM anti-globules rouges mènera directement à l&#39;agglutination des globules rouges lors de l&#39;incubation de test bromélaïne traités avec le sérum du patient. RBC agglutination dans le test de Coombs direct ou dans le TAI est évaluée visuellement, soit à l&#39;oeil dans un tube à essai ou en chargeant l&#39;échantillon sur une petite colonne de Sephadex séparer les globules rouges agglutinés et simples selon la taille 1. Une autre technique fréquemment utilisée pour mesurer l&#39;activation du complément sur ​​les globules rouges est le dosage hémolytique 1, dans lequel la capacité du sérum du patient pour induire (médiée par le complément) hémolyse des hématies de bromélaïne traité 10 est évaluée. Le test est noté comme positif lorsque le surnageant après centrifugation est coloré en rouge en raison de l&#39;hémoglobine libérée et considéré comme négatif si elle reste incolore. Tant le test de Coombs et le dosage hémolytique sont semi-quantitative, depuis la plus haute serum dilution est notée dans lequel le test est toujours positif. Le test de Coombs et le dosage hémolytique sont des tests robustes qui sont couramment utilisés dans le diagnostic. Étant donné que ces tests sont semi-quantitative et en fonction de l&#39;expérience du technicien effectuant le test, ils ne sont pas adaptés à l&#39;étude des différences subtiles de l&#39;activation du complément sur les globules rouges, en fonction des besoins lors de l&#39;évaluation de l&#39;efficacité des inhibiteurs du complément. Par conséquent, nous avons développé deux essais quantitatifs pour déterminer l&#39;activation du complément par (auto)-anticorps de globules rouges, que nous décrirons dans le présent document. Tout d&#39;abord, nous avons développé un dosage pour mesurer le dépôt de fragments d&#39;activation du complément C3 et C4 sur les globules rouges (figure 1A). Dans cet essai, la bromélaïne traitée humains de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d&#39;anticorps anti-RBC), de sérum AB frais (source de complément) et anti-C5 anticorps monoclonal (eculizumab). Au cours de cette incubation, C3 et C4 dépôt se produit si le sérum du patient contient de compléter l&#39;activation des anticorps anti-RBC. Afin d&#39;empêcher la lyse RBC par l&#39;activation du complément en aval d&#39;un anticorps monoclonal anti-C5 est ajouté blocage. Ensuite, C3 et C4 sur le dépôt des hématies est détecté par FACS en utilisant des anticorps monoclonaux marqués par fluorescence ou des fragments Fab réagissant avec C3 et C4, respectivement. Déclenchement sur simple globules rouges est important de s&#39;assurer de la fiabilité des résultats. Les avantages de cette technique sont que d&#39;un petit volume de matière du patient est nécessaire, l&#39;activation du complément à un stade précoce de la cascade est évaluée et le procédé est reproductible et quantitative. Un avantage supplémentaire de la recherche à la fois à C3 et C4 est de faire une distinction peut être faite entre l&#39;activation et la lectine voie classique (à la fois C3 et C4 dépôt) et l&#39;activation de la voie alterne (seulement de dépôt C3). L&#39;utilisation d&#39;hématies de bromélaïne traitée au lieu de globules rouges non traités augmente la sensibilité de l&#39;endire. Le second test est basé sur le dosage hémolytique actuellement utilisée (Figure 1B). Bromélaïne traitée humaines de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d&#39;anticorps anti-RBC) et du sérum AB frais (source de complément). Si le complément est activé par des anticorps anti-RBC patients, dose-dépendante lyse RBC aura lieu, entraînant la libération de l&#39;hémoglobine. La quantité d&#39;hémoglobine libérée est quantifiée en mesurant son absorbance à 414 nm dans le surnageant après filage en bas des globules rouges intacts et fragmentés. L&#39;absorbance est en corrélation avec la quantité d&#39;hémolyse produite. Contrairement au dosage utilisé actuellement, ce protocole permet à un objectif, la valeur quantitative de l&#39;hémolyse qui est très reproductible et ne dépend pas de la personne qui interprète le dosage. Une application de ces méthodes a été décrite en 11, où l&#39;utilisation potentielle de C1-inhibiteur comme inhibiteur du complément dans l&#39;AIHA a studied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Ce produit chimique est soumis à la réglementation des médicaments.</td></tr><tr><td>Sodium Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Ce produit chimique est soumis à la réglementation des médicaments.</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dylight 488 amine colorant réactif</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dylight 650 amine colorant réactif</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>et alpha ; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>On peut utiliser n’importe quel FACS doté des lasers appropriés.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (par exemple spectre Multiskan)&nbsp ;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Tout spectrophotomètre avec la bonne gamme de longueurs d’onde peut être utilisé</td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Tout logiciel d’analyse FACS compatible peut être utilisé</td></tr><tr><td>Bromelain&nbsp ;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

les méthodes de détection quantitative d&#39;anticorps induite par l&#39;activation du complément sur les globules rouges

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peuvent conduire à l&#39;activation du complément entraîne une clairance accélérée via les récepteurs du complément dans le foie (hémolyse extravasculaire) ou conduisant à la lyse des globules rouges intravasculaire. Allo-anticorps (par exemple ABO) ou auto-anticorps contre les antigènes RBC (comme on le voit dans l&#39;anémie hémolytique auto-immune, AIHA) conduisant à l&#39;activation du complément sont potentiellement dangereux et peuvent être - surtout quand conduisant à la lyse intravasculaire - fatale 1. Actuellement, l&#39;activation du complément en raison de (auto)-anticorps sur les globules rouges est évaluée in vitro en utilisant le test de Coombs reflétant dépôt du complément sur ​​RBC ou par un dosage hémolytique non quantitative reflétant lyse RBC 1-4. Cependant, pour évaluer l&#39;efficacité des inhibiteurs du complément, il est obligatoire de disposer de techniques quantitatives. Nous décrivons ici deux de ces techniques. Tout d&#39;abord, un dosage pour détecter C3 et C4 sur le dépôt de globules rouges qui est induite par des anticorps dans le sérum du patient est préprésentés. Pour cela, on utilise une analyse par FACS avec anticorps anti-C3 ou C4 anti-marquées par fluorescence. Ensuite, une analyse quantitative hémolytique est décrite. Dans ce dosage, l&#39;hémolyse, médiée par le complément induite par le sérum du patient est mesurée usage de la fabrication de détection spectrophotométrique de l&#39;hémoglobine libérée. Ces deux essais sont très reproductible et quantitative, ce qui facilite les études de l&#39;activation du complément induite par des anticorps.

La figure 2A montre un nuage de points représentant des globules rouges. Déclenchement adapté pour les globules rouges simples peut être vu dans de FSC-W - FSC Une parcelle (P1). Habituellement, environ 95% des globules rouges entrent dans cette grille de P1 (cellules simples), mais quand un pourcentage élevé de sérum du patient est utilisé, cela peut tomber à 70-80%, en particulier lorsque des IgM anti-RBC est présent dans le sérum du patient. Les résultats représentatifs d...

Nous décrivons ici deux dosages pour mesurer l&#39;activation du complément induite par des anticorps contre les globules rouges. L&#39;avantage majeur sur les tests actuels est leur nature quantitative et facile à interpréter.

Les méthodes de détection quantitative d&#39;anticorps induite par l&#39;activation du complément sur les globules rouges

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer l'activation du complément par des anticorps dirigés contre les globules rouges ou GR présents dans le sérum de patients. Cette activation est réalisée en incubant des globules rouges avec le sérum de patients en présence d'un anticorps bloquant anti-C5 afin d'induire le dépôt de C4 et de C3 à la surface des GR. Ensuite, les GR sont marqués par des anticorps anti-C4 et anti-C3 marqués au fluorochrome, et la quantité de dépôt de complément sur les GR peut alors être analysée par cytométrie en flux selon une méthode alternative.Les GR sont incubés avec le sérum du patient en l'absence d'anti-C5 afin d'induire une lyse médiée par le complément. Le pourcentage de GR lysés peut ensuite être déterminé en mesurant la quantité d'hémoglobine libérée par les cellules par spectrométrie. Le principal avantage de cette nouvelle technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'hémolyse ou le test à l'anticorps globulaire utilisé en diagnostic courant, est qu'elle est de nature quantitative et permet de détecter des différences suboptimales d'activation du complément.Elizabeth Brook, postdoctorante dans notre laboratoire, démontrera les procédures. Commencez par laver trois fois des globules rouges de phénotype zéro avec du PBS, puis incubez le culot dans une solution de Roma lane à 0,5 % à un ratio de un pour deux pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules trois fois supplémentaires, conservez-les sous forme de solution à 3 % dans du PBS frais à quatre degrés Celsius. Pour analyser le dépôt de complément sur les globules rouges par cytométrie en flux, commencez par inactiver thermiquement la quantité souhaitée de sérum de patient pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius. Pendant que le sérum subit le traitement thermique, lavez trois fois les globules rouges traités avec de la brola dans du tampon Roal après le dernier lavage.Resuspendre le culot dans du VBG Plus Plus à une dilution de 0,5 %. Ensuite, ajouter dans chaque puits d'une plaque ronde de 96 puits, 25 microlitres de GR à 0,5 %, 37,5 microlitres de sérum AB frais et 37,5 microlitres de 200 microgrammes par millilitre d'anticorps anti-C5. Puis ajouter à chaque puits le sérum du patient inactivé par la chaleur à la concentration appropriée, en complétant par du sérum AB inactivé par la chaleur si nécessaire, et inclure également un témoin négatif.Utilisez du VBG plus plus pour amener chaque puits à un volume final de 150 microlitres, puis incubez la plaque recouverte de papier d’aluminium E IA pendant une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius sous agitation. Après l'incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS supplémenté de 0,5 % de BSA, puis marquez les cellules avec un microgramme par millilitre d'anticorps monoclonaux anti-C3 et anti-C4 marqués de façon fluorescente. Incubez les cellules pendant 30 à 45 minutes à température ambiante sous agitation douce, puis, après avoir lavé la plaque trois fois, resuspendez les globules rouges dans 150 microlitres de PBS contenant 0,5 % de BSA par puits.Transférez les suspensions cellulaires dans une nouvelle plaque de 96 puits à fond rond, puis placez la plaque sur le cytomètre en flux et séparez les cellules simples des doublests à l’aide d’un diagramme de diffusion avant. Placez la fenêtre sur les globules rouges uniques, puis sélectionnez le canal de détection approprié pour les signaux fluorescents. Quantifiez les résultats à l’aide de l’intensité médiane de fluorescence pour une analyse hémolytique quantitative, chauffez et activez le sérum du patient, et lavez les globules rouges traités au romaine comme vient de l’être démontré.Ensuite, après avoir incubé les globules rouges avec le complément et le sérum du patient comme vient de l'être démontré, mais sans l'anticorps anti-C5, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 664 ×g avec une décélération réduite. Puis, transférer soigneusement 90 microlitres de surnageant dans une nouvelle plaque de microtitration, en prenant soin de ne pas transférer les cellules intactes et d'éviter la formation de bulles d'air, et mesurer ensuite l'absorption à 414-690 nm à l'aide d'un spectrophotomètre Express. Exprimer l'hémolyse en pourcentage de la lyse d'un échantillon de globules rouges incubés dans de l'eau pure.Dans cette première figure, des graphiques de dispersion représentatifs pour les globules rouges traités par brola sont présentés ; un fenêtrage approprié pour les globules rouges isolés peut être observé ici. Généralement, environ 95 % des globules rouges se situent dans cette fenêtre de cellule unique. Dans ces histogrammes, des résultats représentatifs de l'effet de l'anémie hémolytique auto-immune ou AHA.Le sérum de patient sur les dépôts de C4 et de C3 est présenté comme prévu : plus il y a de sérum de patient, plus le dépôt du complément est important. Curieusement, le dépôt du complément présente deux pics positifs distincts. Ceci n'est probablement pas dû à une hétérogénéité de la population des globules rouges, puisque ceux-ci proviennent d'un seul donneur. Bien que la cause de ce phénomène soit encore en cours d'investigation, les intensités médianes de fluorescence des échantillons sont représentées sur ces graphiques linéaires afin de montrer la reproductibilité des dosages de dépôt de C4 et de C3.Remarquez la grande variation dans le dépôt des différents échantillons de patients atteints de PAH. Enfin, les données provenant d'un dosage hémolytique d'un échantillon de sérum de patient ahha contenant des auto-anticorps dirigés contre les globules rouges peuvent être observées sur ces graphiques. La titration avec l'échantillon de sérum donne une courbe claire et reproductible en présence d'un inhibiteur du complément approprié, tel que l'anticorps anti-C5.Le signal hémolytique peut être titré, comme le montre ce graphique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer l'activation du complément par des anticorps spécifiques des globules rouges, soit par analyse cytométrique en flux du dépôt de C3 ou de C4, soit par un dosage hémolytique quantitatif.

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La voie classique est activée par l'anticorps et culmine dans la lyse des cellules cibles. Le...

Mesurer le complément hémolytique 50% (CH 50) Activité de Sérum

Source : Nagre, N., et al. Phagocytose des macrophages alvéolaires et élimination bactérienne chez la souris. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo montre l’évaluation de la phagocytose médiée par récepteur du complément en utilisant des globules rouges de mouton opsonisés avec IgM et complément, suivie de leur captation par les macrophages de souris. L’étendue de la phagocytose est quantifiée en mesurant un produit chromogénique bleu formé par oxydation catalysée par hémoglobine du diaminofluorène.

Modéliser la phagocytose médiée par le complément à l’aide de globules rouges opsonisés in vitro

Cette vidéo présente une technique permettant d’évaluer l’activité bactéricide médiée par le complément des anticorps présents dans le sérum. Cette approche combine du sérum isolé avec des bactéries pathogènes et des protéines de complément exogènes. Lors de l’incubation, les bactéries sont cultivées sur une plaque de gélose et les colonies produites sont quantifiées pour mesurer le titre bactéricide sérique.

Dosage bactéricide sérique de l’activité bactéricide médiée par le complément d’anticorps

La vidéo présente un test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre des antigènes spécifiques. La confirmation de l’inhibition de l’hémagglutination dans le puits d’essai et de l’hémagglutination dans le puits témoin est obtenue par des motifs visuels distincts. Ce test joue un rôle crucial dans l’évaluation de la réponse immunitaire, l’efficacité des vaccins et l’étude des infections virales en virologie et en immunologie.

Le test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre un antigène cible

Cette vidéo présente un test mesurant l’activation des fonctions effectrices des lymphocytes T par les anticorps. L’ajout d’un anticorps monoclonal spécifique de l’hémagglutinine (HA) du virus de la grippe à des cellules de mammifères transfectées exprimant l’HA entraîne la formation de complexes immuns avec l’HA. Lors de l’introduction de lymphocytes T modifiés exprimant des récepteurs Fc et un rapporteur de luciférase, les lymphocytes T sont activés par les complexes anticorps-HA, et cette...

Mesure de l’activation des fonctions effectrices médiées par Fc par les anticorps HA

Cette vidéo présente un test permettant de mesurer la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) par les phagocytes du lait maternel. Des microsphères marquées par fluorescence, conjuguées à un complexe antigène-anticorps, sont combinées à une suspension cellulaire isolée du lait maternel pour induire une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps par les leucocytes phagocytaires. Lors du marquage des cellules avec des anticorps contre l’antigène leucocytaire commun (CD45), la...

Un test in vitro pour mesurer la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps par les phagocytes

Le dosage monocouche de monocytes (MMA) est un dosage in vitro qui utilise des monocytes primaires isolés obtenus à partir de sang total périphérique de mammifère pour évaluer la phagocytose médiée par le récepteur Fcγ (FcγR).

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

La capture des changements dynamiques dans l’activation protéique des globules rouges énucléés pose des défis méthodologiques, comme la préservation des changements dynamiques des stimuli aigus pour une évaluation ultérieure. Le protocole présenté décrit les techniques de préparation et de coloration des échantillons qui permettent la préservation et l’analyse des changements protéiques pertinents et la détection ultérieure.

Détection basée sur l’immunomarquage d’altérations dynamiques dans les protéines des globules rouges

Nous avons développé des améliorations et mis à jour des méthodes pour le test monocyte-monocouche (MMA) existant, dans lequel les macrophages sont utilisés pour aider à mieux prédire la pertinence clinique des alloanticorps érythrocytaires en médecine transfusionnelle et en immunologie. Ce test est appelé test monocyte-macrophage (M-MA).

Prédiction de la signification des anticorps anti-globules rouges à l’aide du dosage des monocytes-macrophages

Découvrez deux méthodes quantitatives pour mesurer l'activation du complément par des anticorps anti-globules rouges. Ces techniques utilisent la cytométrie en flux et la spectrométrie pour améliorer le diagnostic clinique.

Les méthodes de détection quantitative d'anticorps induite par l'activation du complément sur les globules rouges

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