Les méthodes de détection quantitative d'anticorps induite par l'activation du complément sur les globules rouges
29 janvier 2014
Nous décrivons ici deux dosages pour mesurer l'activation du complément induite par des anticorps contre les globules rouges. L'avantage majeur sur les tests actuels est leur nature quantitative et facile à interpréter.
L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer l'activation du complément par des anticorps dirigés contre les globules rouges ou GR présents dans le sérum de patients. Cette activation est réalisée en incubant des globules rouges avec le sérum de patients en présence d'un anticorps bloquant anti-C5 afin d'induire le dépôt de C4 et de C3 à la surface des GR. Ensuite, les GR sont marqués par des anticorps anti-C4 et anti-C3 marqués au fluorochrome, et la quantité de dépôt de complément sur les GR peut alors être analysée par cytométrie en flux selon une méthode alternative.
Les GR sont incubés avec le sérum du patient en l'absence d'anti-C5 afin d'induire une lyse médiée par le complément. Le pourcentage de GR lysés peut ensuite être déterminé en mesurant la quantité d'hémoglobine libérée par les cellules par spectrométrie. Le principal avantage de cette nouvelle technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'hémolyse ou le test à l'anticorps globulaire utilisé en diagnostic courant, est qu'elle est de nature quantitative et permet de détecter des différences suboptimales d'activation du complément.
Elizabeth Brook, postdoctorante dans notre laboratoire, démontrera les procédures. Commencez par laver trois fois des globules rouges de phénotype zéro avec du PBS, puis incubez le culot dans une solution de Roma lane à 0,5 % à un ratio de un pour deux pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules trois fois supplémentaires, conservez-les sous forme de solution à 3 % dans du PBS frais à quatre degrés Celsius. Pour analyser le dépôt de complément sur les globules rouges par cytométrie en flux, commencez par inactiver thermiquement la quantité souhaitée de sérum de patient pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius. Pendant que le sérum subit le traitement thermique, lavez trois fois les globules rouges traités avec de la brola dans du tampon Roal après le dernier lavage.
Resuspendre le culot dans du VBG Plus Plus à une dilution de 0,5 %. Ensuite, ajouter dans chaque puits d'une plaque ronde de 96 puits, 25 microlitres de GR à 0,5 %, 37,5 microlitres de sérum AB frais et 37,5 microlitres de 200 microgrammes par millilitre d'anticorps anti-C5. Puis ajouter à chaque puits le sérum du patient inactivé par la chaleur à la concentration appropriée, en complétant par du sérum AB inactivé par la chaleur si nécessaire, et inclure également un témoin négatif.
Utilisez du VBG plus plus pour amener chaque puits à un volume final de 150 microlitres, puis incubez la plaque recouverte de papier d’aluminium E IA pendant une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius sous agitation. Après l'incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS supplémenté de 0,5 % de BSA, puis marquez les cellules avec un microgramme par millilitre d'anticorps monoclonaux anti-C3 et anti-C4 marqués de façon fluorescente. Incubez les cellules pendant 30 à 45 minutes à température ambiante sous agitation douce, puis, après avoir lavé la plaque trois fois, resuspendez les globules rouges dans 150 microlitres de PBS contenant 0,5 % de BSA par puits.
Transférez les suspensions cellulaires dans une nouvelle plaque de 96 puits à fond rond, puis placez la plaque sur le cytomètre en flux et séparez les cellules simples des doublests à l’aide d’un diagramme de diffusion avant. Placez la fenêtre sur les globules rouges uniques, puis sélectionnez le canal de détection approprié pour les signaux fluorescents. Quantifiez les résultats à l’aide de l’intensité médiane de fluorescence pour une analyse hémolytique quantitative, chauffez et activez le sérum du patient, et lavez les globules rouges traités au romaine comme vient de l’être démontré.
Ensuite, après avoir incubé les globules rouges avec le complément et le sérum du patient comme vient de l'être démontré, mais sans l'anticorps anti-C5, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 664 ×g avec une décélération réduite. Puis, transférer soigneusement 90 microlitres de surnageant dans une nouvelle plaque de microtitration, en prenant soin de ne pas transférer les cellules intactes et d'éviter la formation de bulles d'air, et mesurer ensuite l'absorption à 414-690 nm à l'aide d'un spectrophotomètre Express. Exprimer l'hémolyse en pourcentage de la lyse d'un échantillon de globules rouges incubés dans de l'eau pure.
Dans cette première figure, des graphiques de dispersion représentatifs pour les globules rouges traités par brola sont présentés ; un fenêtrage approprié pour les globules rouges isolés peut être observé ici. Généralement, environ 95 % des globules rouges se situent dans cette fenêtre de cellule unique. Dans ces histogrammes, des résultats représentatifs de l'effet de l'anémie hémolytique auto-immune ou AHA.
Le sérum de patient sur les dépôts de C4 et de C3 est présenté comme prévu : plus il y a de sérum de patient, plus le dépôt du complément est important. Curieusement, le dépôt du complément présente deux pics positifs distincts. Ceci n'est probablement pas dû à une hétérogénéité de la population des globules rouges, puisque ceux-ci proviennent d'un seul donneur. Bien que la cause de ce phénomène soit encore en cours d'investigation, les intensités médianes de fluorescence des échantillons sont représentées sur ces graphiques linéaires afin de montrer la reproductibilité des dosages de dépôt de C4 et de C3.
Remarquez la grande variation dans le dépôt des différents échantillons de patients atteints de PAH. Enfin, les données provenant d'un dosage hémolytique d'un échantillon de sérum de patient ahha contenant des auto-anticorps dirigés contre les globules rouges peuvent être observées sur ces graphiques. La titration avec l'échantillon de sérum donne une courbe claire et reproductible en présence d'un inhibiteur du complément approprié, tel que l'anticorps anti-C5.
Le signal hémolytique peut être titré, comme le montre ce graphique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer l'activation du complément par des anticorps spécifiques des globules rouges, soit par analyse cytométrique en flux du dépôt de C3 ou de C4, soit par un dosage hémolytique quantitatif.
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Aperçu
Cet article décrit deux tests permettant de mesurer l'activation du complément induite par des anticorps dirigés contre les globules rouges (RBCs). Ces tests sont quantitatifs et faciles à interpréter, offrant ainsi des avantages par rapport aux méthodes existantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Hématologie
- Cytométrie en flux
Contexte
- L'activation du complément est cruciale dans les réponses immunitaires.
- Les anticorps dirigés contre les globules rouges peuvent entraîner diverses affections cliniques.
- Les dosages actuels peuvent manquer de précision quantitative.
- De nouvelles méthodes visent à améliorer la détection de l'activation du complément.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'activation du complément par des anticorps dirigés contre les globules rouges.
- Développer un dosage quantitatif pour une interprétation plus précise des résultats.
- Comparer de nouvelles techniques avec les méthodes diagnostiques existantes.
Méthodes utilisées
- Incubation des GR avec le sérum du patient et des anticorps bloquants.
- Marquage des GR par des anticorps marqués au fluorochrome.
- Analyse du dépôt de complément par cytométrie en flux.
- Mesure du relâchement d'hémoglobine pour déterminer la lyse des GR.
Résultats principaux
- Les nouveaux dosages fournissent des données quantitatives sur l'activation du complément.
- Des différences suboptimales d'activation peuvent être détectées.
- Les résultats montrent une sensibilité améliorée par rapport aux méthodes traditionnelles.
- L'analyse par cytométrie en flux permet une interprétation détaillée.
Conclusions
- Les nouveaux dosages améliorent la compréhension de l'activation du complément.
- Ils offrent une alternative fiable aux tests diagnostiques existants.
- Des applications futures pourraient améliorer le diagnostic et le traitement des patients.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation quantitative de l'activation du complément induite par les anticorps sur les globules rouges est essentielle pour apprécier l'efficacité des inhibiteurs du complément et comprendre les mécanismes hémolytiques dans les troubles auto-immuns et allo-immuns. Les dosages cytométriques en flux et spectrophotométriques décrits fournissent des résultats reproductibles et quantitatifs permettant de détecter des différences subtiles dans l'activation du complément, ce qui soutient la réduction des risques mécanistiques lors du développement thérapeutique. Ces méthodes améliorent la fiabilité prédictive de la validation ciblée en transformant des observations qualitatives en biomarqueurs mesurables et transposables pour la prise de décision préclinique et clinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant le dépôt de complément (C3/C4) induit par des auto-anticorps ou des allo-anticorps sur les globules rouges.
- Valeur opérationnelle : Fournit une validation fonctionnelle de la cible grâce à la mesure directe de l'activité effetrice médiée par les anticorps, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille de projets en générant des données quantitatives sur la puissance d'activation du complément, orientant les décisions de poursuite ou d'abandon pour les thérapeutiques modulant le complément.
Développement de criblage et de tests
- Prêt-à-l'emploi du test : Génère des résultats quantitatifs normalisés (intensité de fluorescence médiane, libération d'hémoglobine) adaptés au criblage à haut débit d'inhibiteurs du complément ou d'anticorps thérapeutiques.
- Reproductibilité : Présente une faible variabilité entre les échantillons de sérum de patients, permettant une évaluation fiable des composés et une standardisation inter-laboratoires.
- Utilité de la plateforme : Utilise des instruments accessibles (cytomètre en flux, spectrophotomètre) pour créer des tests réutilisables destinés à mesurer l'activité biologique dépendante du complément dans les pipelines de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise les mécanismes physiopathologiques de l’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) et de l’hémolyse allo-immune, en établissant un lien entre l’engagement ciblé et l’activation fonctionnelle du complément.
- Continuité translationnelle : Assure le passage de la découverte à la validation préclinique en fournissant des biomarqueurs quantitatifs (dépôt de C3/C4, hémolyse) corrélés au potentiel hémolytique clinique.
- Progression adaptée au risque : Permet une détection mécanistique des risques en quantifiant la lyse médiée par le complément, ce qui éclaire les évaluations de sécurité et la modélisation dose-réponse dans les études précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Les tests s'intègrent dans la continuité de la découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, jusqu'à l'évaluation préclinique de la sécurité, en fournissant des lectures quantitatives de l'activation du complément qui éclairent la réduction des risques biologiques et l'évaluation de l'indice thérapeutique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant les voies d'activation du complément induites par les anticorps, permettant ainsi de préciser le mécanisme d'action des candidats immunomodulateurs.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse (intensité de fluorescence, hémolyse spectrophotométrique) qui permettent une comparaison fiable de composés testés ou d'échantillons sériques.
- Analytique : Génère des signaux mesurables (intensité médiane de fluorescence, libération d'hémoglobine) facilitant l'analyse statistique et la comparaison entre différentes conditions dans les études de réponse en fonction de la dose.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à des paramètres pertinents pour la maladie, reflétant l'activation du complément observée dans les cas d'hémolyse auto-immune et lors de transfusions.
- Utilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée et évolutive pour évaluer l'activité dépendante du complément chez les thérapeutiques à base d'anticorps, les biosimilaires et les inhibiteurs du complément.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en transformant des dosages du complément qualitatifs en mesures quantitatives et transposables.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à des protocoles définis pour la préparation des globules rouges, l'incubation du sérum et la détection par cytométrie en flux ou spectrométrie.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant la détection précoce de risques d'activation du complément, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée des programmes d'immunomodulation.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire la priorisation ajustée au risque en quantifiant le potentiel d'activation du complément, soutenant des décisions objectives d'avancement dans le développement thérapeutique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunologie, en cytométrie en flux et en manipulation de dosages spectrophotométriques pour des mesures précises du dépôt de complément et de l'hémolyse.
- Dépend de l'accès à des cytomètres en flux dotés de canaux de fluorescence appropriés et à des spectrophotomètres permettant la quantification de l'hémoglobine à 414/690 nm.
- Exige une standardisation de la préparation des globules rouges (par exemple, de type zéro, traités à la broméline) et de l'inactivation thermique du sérum afin d'assurer la reproductibilité du dosage entre différents utilisateurs et sites.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application à différentes espèces de globules rouges, densités d'antigènes ou sources de complément autres que le sérum humain AB.
- Les limitations pratiques incluent la nécessité d'un transfert soigneux du surnageant afin d'éviter l'entraînement cellulaire et la formation de bulles d'air, qui pourraient compromettre la précision de la quantification de l'hémolyse.
