Les méthodes de détection quantitative d'anticorps induite par l'activation du complément sur les globules rouges

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer l’activation du complément par des anticorps contre les globules rouges ou les globules rouges dans le sérum du patient. Ceci est réalisé en incubant des globules rouges avec le sérum du patient en présence d’anticorps anti-C cinq bloquants pour induire le dépôt de C 4 et C3 à la surface des globules rouges. Ensuite, les globules rouges sont colorés avec des anticorps anti-C quatre et anti-C3 marqués par fluorescence, et la quantité de dépôt de complément sur les globules rouges peut ensuite être analysée par cytométrie en flux dans une méthode alternative.

Les globules rouges sont incubés avec le sérum du patient en l’absence d’anti-C cinq pour induire une lyse médiée par le complément. Le pourcentage de globules rouges lysés peut ensuite être déterminé en mesurant la quantité d’hémoglobine libérée par les cellules par spectrométrie. Le principal avantage de cette nouvelle technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’hémolyse ou le test d’antiglobuline utilisées dans les diagnostics de routine est qu’elle est de nature quantitative et que nous pouvons détecter des différences sous-optimales dans l’activation du complément.

Elizabeth Brook, postdoc dans notre laboratoire, fera la démonstration des procédures : commencez par laver trois fois les globules rouges de type zéro avec du PBS, puis incubez la pastille dans une solution à 0,5 % de voie Roma dans un rapport de un à deux pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius après avoir lavé les cellules trois fois de plus, stockez-les sous forme de solution à 3 % dans du PBS frais à quatre degrés Celsius pour analyser le dépôt de complément sur les globules rouges par cytométrie en flux. Tout d’abord, inactivez la quantité souhaitée de sérum pour le patient pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius pendant que le sérum est traité thermiquement. Lavez les globules rouges traités au brola trois fois dans le tampon Roal après le lavage final.

Resus suspend le granulé dans vbg plus plus à une dilution de 0,5 %. Ensuite, à une perle de verre, 25 microlitres de 0,5 % de globules rouges, 37,5 microlitres de sérum AB frais et 37,5 microlitres de 200 microgrammes par millilitre, anti C cinq à chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 biens. Ajoutez ensuite le sérum de patient inactivé par la chaleur dans chaque puits à la concentration appropriée, en complétant avec du sérum AB inactivé par la chaleur si nécessaire et en incluant également un témoin négatif.

Utilisez VBG plus plus pour amener chaque puits à un volume final de 150 microlitres, puis incubez la plaque recouverte d’une feuille E IA pendant une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius en secouant après l’incubation. Lavez les cellules trois fois avec du PBS complété par 0,5 % de BSA, puis étiquetez les cellules avec un microgramme par millilitre. Quatre anticorps monoclonaux anti-C3 et anti-C marqués par fluorescence incubent les cellules pendant 30 à 45 minutes à température ambiante en les secouant doucement, puis après avoir lavé la plaque trois fois, remettent en suspension les globules rouges dans 150 microlitres de PBS plus 0,5 % BSA par.

Transférez les suspensions cellulaires sur une nouvelle plaque inférieure ronde à 96 puits, puis chargez la plaque sur le cytomètre en flux, séparez les cellules simples des doublets à l’aide d’un diagramme de dispersion vers l’avant. Réglez la porte sur les globules rouges individuels, puis sélectionnez le canal de détection approprié pour les signaux fluorescents. Quantifiez les résultats à l’aide de l’intensité médiane de fluorescence pour l’analyse hémolytique quantitative, chauffez et activez le sérum du patient et lavez les globules rouges traités à la romaine comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, après avoir incubé les globules rouges avec le complément et le sérum du patient, comme nous venons de le démontrer, mais sans l’anti-C cinq, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 664 GS avec une décélération réduite. Ensuite, transférez soigneusement 90 microlitres de surnageant dans une nouvelle plaque de microtitration, en prenant soin de ne pas transférer les cellules intactes et d’éviter de créer des bulles d’air, puis mesurez l’absorption à quatre 14 à six 90 dans un spectrophotomètre express. L’hémolyse en pourcentage de la lyse d’un échantillon de globules rouges incubés dans de l’eau pure.

Dans cette première figure, des diagrammes de dispersion représentatifs pour les globules rouges traités au brola sont montrés comme des points de contrôle appropriés pour les globules rouges uniques. En règle générale, environ 95 % des globules rouges se situent à l’intérieur de cette porte de cellule unique. Dans ces histogrammes, des résultats représentatifs de l’effet de l’anémie hémolytique auto-immune ou aha.

Le sérum du patient sur C quatre et le dépôt de C3 sont montrés comme prévu, plus de sérum de patient conduit à plus de dépôt de complément. Curieusement, le dépôt de complément se produit en deux pics positifs distincts. Cela n’est probablement pas dû à l’hétérogénéité de la population de globules rouges puisque les globules rouges sont prélevés sur un seul donneur, bien que la cause de ce phénomène soit encore à l’étude, les intensités médianes de fluorescence des échantillons sont tracées dans ces graphiques linéaires pour montrer la reproductibilité des tests de dépôt de C-quatre et de C3.

Notez la grande variation dans le dépôt des différents échantillons de patients AH H. Enfin, les données d’un test hémolytique d’un échantillon de sérum de patient ahha contenant des anticorps automatiques contre les globules rouges peuvent être observées dans ces graphiques. Le titrage avec l’échantillon de sérum permet d’obtenir une courbe claire et reproductible avec un inhibiteur du complément approprié, tel que l’anti-C cinq.

Le signal hémolytique peut être titré comme le montre ce graphique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’activation du complément par des anticorps spécifiques des globules rouges, soit par analyse cytométrique en flux des dépôts de C3 ou de C quatre, soit par un test hémolytique quantitatif.