Dosage bactéricide sérique de l’activité bactéricide médiée par le complément d’anticorps

Prélevez un échantillon de sérum dilué en série contenant des anticorps monoclonaux contre les lipopolysaccharides, ou LPS - un composant de la membrane externe des bactéries à Gram négatif.

Introduisez des bactéries à Gram négatif. Les anticorps sériques se lient au LPS bactérien.

Ajouter des protéines complémentaires. Le complexe C1 se lie aux anticorps liés au LPS, formant un C1 enzymatiquement actif.

Le C1 activé clive C4 et C2 pour former la C3 convertase, qui clive C3 pour former la C5 convertase. La convertase clive C5 pour produire C5b, qui recrute C6 et C7. Le complexe résultant s’insère dans la membrane externe et s’associe à C8 et à plusieurs C9, formant un pore.

Les dommages à la membrane externe déstabilisent la membrane interne, provoquant la lyse cellulaire.

Placez le mélange sur une plaque de gélose et étalez-le. Incuber pour la croissance bactérienne. Recouvrir la plaque d’une gélose contenant du chlorure de triphényltétrazolium, ou TTC, qui est réduit par les déshydrogénases microbiennes, conférant une couleur rouge aux colonies bactériennes.

Le nombre de colonies augmente avec la dilution de l’échantillon, ce qui indique une activité bactéricide réduite avec une concentration d’anticorps plus faible.

Pour commencer, incubez les échantillons dans un bain d’eau chaude à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes pour inactiver thermiquement les échantillons de test. Procurez-vous une plaque de dosage et 20 microlitres de tampon de dosage dans les colonnes 1 à 12 des rangées A à G. Ajoutez 20 microlitres de tampon de dosage dans les colonnes 1 et 2 de la rangée H. Chargez 30 microlitres de chaque échantillon de test en double dans la rangée H de la plaque de test.

Pour commencer à effectuer des dilutions en série en trois fois des échantillons d’essai, utilisez une pipette multicanaux pour prélever 10 microlitres des puits 3H à 12H. Transférez les échantillons dans les puits correspondants de la rangée G et pipetez de haut en bas 8 à 10 fois pour bien mélanger l’échantillon. Ensuite, retirez 10 microlitres de ces puits, transférez-les dans les puits correspondants de la rangée F, et pipetez de haut en bas 8 à 10 fois pour mélanger. Poursuivez ce processus de dilution en série à travers la rangée A. Après avoir mélangé les puits de la rangée A, retirez et jetez 10 microlitres des puits 3A à 12A de sorte que le volume final dans tous les puits soit de 20 microlitres.

Récupérez un flacon de bouillon bactérien cible congelé et décongelez-le à température ambiante. Ensuite, diluez les bactéries dans 20 ml de tampon de dosage selon le facteur de dilution optimal prédéterminé. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 10 microlitres de bactéries diluées dans chaque puits de la plaque de dosage.

Récupérez une fiole de bébé lapin congelé et une fiole de BRC congelé inactivé à la chaleur. Utilisez de l’eau courante froide pour décongeler les flacons à température ambiante. Ensuite, mélangez 100 microlitres de chaleur et de BRC inactivé par la chaleur avec 400 microlitres de tampon de dosage. Ajoutez 50 microlitres de cette solution BRC inactivée à 20 % par la chaleur dans tous les puits de la colonne 1. Mélangez 1 millilitre de BRC natif avec 4 millilitres de tampon de dosage. Ajoutez 50 microlitres de ce mélange à 20 % dans tous les puits des colonnes 2 à 12. Placez la plaque sur un agitateur pendant 10 à 15 secondes pour mélanger doucement la plaque de dosage.

Incuber la plaque de test dans un incubateur microbiologique pendant deux heures. Pendant ce temps, retirez les couvercles de deux plaques de gélose LB et placez les plaques face vers le haut dans une enceinte de sécurité biologique pendant 40 à 60 minutes pour qu’elles sèchent. Une fois l’incubation terminée, transférez la plaque de dosage sur de la glace humide et incubez pendant 10 à 20 minutes pour arrêter la réaction. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, mélangez les puits de la rangée H et placez 10 microlitres du mélange réactionnel sur le fond d’une plaque LBA. Inclinez immédiatement la plaque et laissez les taches courir sur environ 1,5 à 2 centimètres.

Répétez cette procédure pour les rangées G, F et E, en les repérant au-dessus de la rangée précédente. Incuber les plaques LBA à température ambiante jusqu’à ce que la solution soit absorbée par les plaques LBA. Ensuite, placez les couvercles sur les assiettes et transférez-les à l’envers dans un incubateur microbiologique pour incuber pendant la nuit.

Le lendemain, ajoutez 25 ml de gélose superposée à 55 degrés Celsius contenant 100 microgrammes par millilitre de TTC et 0,1 % d’azoture de sodium dans chaque plaque LBA. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre aux bactéries survivantes de développer une couleur rouge. Ensuite, utilisez un appareil photo numérique pour photographier les plaques. Transférez les images sur un ordinateur et utilisez le logiciel intégré de dénombrement des colonies du NIST pour analyser les images comme indiqué dans le protocole texte.