L'isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

L'objectif général de cette procédure est de quantifier l'activité protéolytique de la neurotoxine botulique dans des matrices complexes telles que des échantillons pharmaceutiques, environnementaux et alimentaires. Cela est réalisé en traitant d'abord les échantillons de test et les échantillons de la courbe standard, si nécessaire, afin d'établir des conditions appropriées de pH et de viscosité. Ensuite, la neurotoxine botulique est immunoprécipitée à partir des échantillons à l'aide de billes magnétiques revêtues d'anticorps.

Ensuite, les billes magnétiques sont soigneusement lavées pour éliminer les composés interférents éventuels, puis remises en suspension dans un tampon de réaction optimisé. Enfin, les billes lavées sont incubées avec un marqueur protéique, et le clivage du marqueur est mesuré spectroscopiquement en fonction du temps. En définitive, la comparaison du clivage du marqueur dans les échantillons test par rapport aux échantillons de la courbe standard permet de quantifier l'activité de la toxine botulique dans les échantillons test avec une sensibilité proche de celle du bioessai sur souris.

Les principaux avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que le test sur souris, les tests biologiques, les méthodes immunologiques et autres méthodes fluorescentes, sont qu'elle ne nécessite pas l'utilisation d'animaux et qu'elle a été démontrée applicable à des matrices hautement complexes présentes dans les échantillons alimentaires, environnementaux et pharmaceutiques. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car un traitement et une dilution minutieux des échantillons sont requis. Cette procédure sera démontrée par le Dr Mark Dunning, scientifique chez Bio Sentinel.

Préparez les tampons selon le protocole indiqué afin d'obtenir une courbe standard pour la quantification des échantillons à tester. Pesez 10 ± 0,01 gramme d'échantillon alimentaire solide dans un tube conique de 50 millilitres et mettez cet échantillon de côté. Cet échantillon servira de diluant. Dans un second tube, pesez 2 ± 0,01 gramme d'échantillon alimentaire solide. Ajoutez la neurotoxine botulique ou achetée à la surface de l'échantillon alimentaire de deux grammes, à une concentration finale de 30 000 DLM 50 par gramme d'aliment. Incubez les échantillons dilués et contaminés à température ambiante ou à 4 degrés Celsius pendant deux heures, afin de permettre à la toxine de bien interagir avec la matrice alimentaire.

En imitant une contamination naturelle, se référer au protocole écrit pour d'autres types d'échantillons. Ensuite, ajouter un millilitre de GPB par gramme d'aliment aux échantillons contaminés et non contaminés, et utiliser un pilon pour homogénéiser jusqu'à ce que le mélange soit complet. Extrapoler le volume total des deux grammes de l'échantillon contaminé à partir du volume total approximatif de l'échantillon dilué de 10 grammes.

Ensuite, ajouter un dixième de volume de tampon de neutralisation 10 x à l'échantillon dilué de 10 grammes et à l'échantillon dopé de deux grammes, en fonction de leurs volumes totaux. Mélanger soigneusement les échantillons par retournement, puis clarifier partiellement les deux échantillons par centrifugation pendant 10 minutes à 6 000 × g et à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirer immédiatement les surnageants et les transférer dans de nouvelles tubes en utilisant l'échantillon dopé comme D1 et l'échantillon non dopé comme diluant, puis générer les échantillons restants de la courbe étalon dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre.

Pour préparer les échantillons d'aliments solides, commencez par peser deux grammes plus ou moins 0,01 gramme d'échantillon solide inconnu dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez deux millilitres de GPB et utilisez un pilon pour homogénéiser l'échantillon. Ensuite, ajoutez un dixième du volume de tampon de neutralisation 10 x à l'échantillon et mélangez soigneusement par retournement, après avoir partiellement clarifié l'échantillon par centrifugation pendant 10 minutes à 6 000 ×g et à 4 °C ; transférez immédiatement au moins 750 microlitres de surnageant dans un tube de microcentrifugation.

Ceci est la dilution inconnue un. Ajouter 675 microlitres de diluant à deux tubes étiquetés dilution inconnue deux et trois. Le diluant sera le même matériau traité utilisé pour la génération de la courbe standard.

Utilisez la dilution un pour effectuer une dilution sériée en transférant 75 microlitres de la dilution un dans le tube de dilution deux et en mélangeant. Ensuite, transférez 75 microlitres de la dilution deux dans le tube de dilution trois et mélangez. Pour clarifier les échantillons, centrifugez-les pendant cinq minutes à au moins 14 000 ×g.

Retirez immédiatement les surnageants et transférez-les dans de nouveaux tubes pour préparer une plaque pour les échantillons. Ajoutez 20 microlitres de tampon de liaison 10 x dans chaque puits ; chaque échantillon inconnu ainsi que les échantillons standards de la courbe D1 à D8 nécessitent trois puits, tandis que l'échantillon D9 nécessite six puits. Ajoutez 200 microlitres de chaque échantillon dans les puits respectifs et utilisez un agitateur pour microplaque afin de mélanger la plaque pendant 10 secondes. Agitez les billes IPA par vortex pendant 10 secondes à vitesse maximale ou jusqu'à complète resuspension.

Ensuite, pipeter 20 microlitres des billes dans chaque puits d'échantillon et mélanger la plaque pendant 30 secondes. Incuber la plaque dans un incubateur rotatif pendant deux heures à 750 tr/min et à 25 degrés Celsius ou à température ambiante pour laver la plaque à l’aide d’un laveur automatique de plaques. Après avoir exécuté le programme d’amorçage, placer la plaque sur la plaque de séparation magnétique à 96 puits du laveur de plaques.

Ensuite, lancez le programme de lavage principal. Une fois le programme terminé, retirez la plaque du laveur. Ajoutez 50 microlitres de tampon de réaction à 1 x dans chaque puits d'échantillon et mélangez pendant 30 secondes.

Pour initier le test matriciel en mode bot, ajouter 50 microlitres de rapporteur AE à 0,5 micromolaire. Pour chaque puits d'échantillon afin de prévenir les effets de bord, ajouter 100 microlitres d'eau à chaque puits inutilisé. Utiliser un ruban adhésif supérieur pour sceller la plaque, la protéger de la lumière et l'incuber à 750 tr/min et à 25 degrés Celsius ou à température ambiante.

À chaque temps de lecture, retirez la plaque de l’incubateur. Retirez le ruban adhésif supérieur et placez immédiatement la plaque sur la plaque de séparation magnétique à 96 puits ; laissez les billes se séparer pendant deux minutes. Placez la plaque dans le lecteur de microplaque et mesurez les émissions à environ 470 et environ 526 nanomètres sous excitation à environ 434 nanomètres.

Si des temps de lecture supplémentaires sont souhaités, après avoir resuspendu les billes pendant 30 secondes sur le mélangeur de plaque, refermez hermétiquement la plaque et replacez-la dans l'incubateur. Les résultats de dosage présentés ici utilisent à la fois une toxine holoproteïque ajoutée dans du PBS et testée après des incubations de deux, quatre et 24 heures avec le rapporteur AE. Le clivage du rapporteur par la bot est mesuré comme une réduction du rapport d'émission, mesuré par notre lecteur de plaque, passant d'environ 2,7 pour le rapporteur intact à environ 0,7 pour le rapporteur complètement clivé.

Les valeurs spécifiques varieront selon les lecteurs de plaques, comme le montre le décalage vers la gauche de la courbe ; un temps d'incubation prolongé avec le marqueur entraîne une augmentation du clivage du marqueur. Les points de données testés en triplicata affichent un faible écart-type de la moyenne et suivent la tendance attendue d’un rapport d’émission accru avec une charge en toxine réduite. L’absence de suivi de cette tendance attendue par le test pourrait indiquer une erreur lors de la préparation des dilutions ou du tracé des rapports d’émission. Les rapports d’émission des témoins ne contenant aucune botulino-toxine A restent également stables au cours de l’incubation, ce qui indique l’absence d’une activité protéasique non spécifique.

Cette figure illustre la méthodologie générale utilisée pour détecter ou quantifier un échantillon inconnu à l’aide d’une courbe standard et permet de quantifier des échantillons pharmaceutiques de bot. Une courbe standard a été établie dans du PBS à l’aide de bot purifié, une holo-toxine, et traitée en parallèle avec des dilutions de produit médicamenteux provenant d’un seul flacon de 100 unités de Botox lyophilisé réhydraté dans du sérum salin à 0,9 %. Dans cet essai, la portion linéaire de la courbe standard se situe entre un rapport d’émission de 2,11 et 1,05, et est indiquée par le cadre en pointillés sur la figure. Les concentrations des trois échantillons inconnus situés dans cette plage linéaire ont ensuite été interpolées à partir de la courbe standard.

Dans cette expérience, des tomates fraîches et du lait à 2 % ont été utilisés comme matrices alimentaires solide et liquide, et contaminés avec un complexe composé de la toxine hollo, de la toxine toin et de protéines associées neurotoxiques. Cette combinaison a été choisie car elle ressemble à la toxine produite lors d'une contamination naturelle par Clostridium, comme illustré ici. La récupération de la toxine bot A est observée avec les deux matrices.

En outre, un temps d'incubation plus long avec le marqueur augmente la sensibilité du test, mais ne provoque pas de diminution des rapports d'émission pour les témoins sans toxine, ce qui indique que le clivage observé est dû à la bot A et non à un protéase non spécifique provenant des aliments dans le test. La bot A-L-O-D-L-O-Q et la CE 50 pour les deux aliments à chaque point temporel indiqué sont résumées dans ce tableau. La LDD et la LQD sont définies respectivement comme l'échantillon à la concentration la plus faible présentant un rapport d'émission inférieur de trois et dix écarts-types par rapport au bruit de fond.

On s'attend à une certaine variabilité d'une matrice à l'autre concernant les DL et DLQ, car les effets de matrice peuvent influencer la liaison de la toxine aux billes ainsi que la récupération des billes lors des lavages. Bien qu'il semble y avoir une récupération plus élevée de toxine à partir du lait à 2 % que des tomates selon les données, une grande partie de cette différence résulte de la dilution supplémentaire nécessaire pour homogénéiser les échantillons de tomates dans le GPB. En plus d'être une matrice alimentaire solide, les tomates constituent un type d'échantillon particulièrement notable où l'ajustement du pH et de la force ionique est essentiel à la réussite du test.

Cette figure illustre les réponses du test lors de l'analyse de tomates avec ou sans l'ajout du tampon de neutralisation 10 x. L'absence d'ajout du tampon entraîne une faible récupération de la toxine bot A à partir des échantillons, ce qui se manifeste par un rapport d'émission constant quelle que soit la concentration de bot A testée. En revanche, l'ajout du tampon de neutralisation 10 x permet une détection sensible de la toxine. Les protéases non spécifiques peuvent être endogènes à l'échantillon alimentaire ou introduites lors de l'utilisation de préparations de bot non purifiées, telles que des surnageants de culture de Clostridium, et peuvent cliver le rapporteur AE, conduisant à des résultats faussement positifs. Cet exemple démontre une activité de protéase non spécifique détectée dans des surnageants de culture de Clostridium bot A à l'aide d'un rapporteur modifié qui n'est plus clivé par la bot A. Les niveaux élevés de clivage du rapporteur indiquent la présence de cette activité dans la culture.

Le surnageant contient une activité protéasique importante, qui est efficacement annulée par l'ajout d'inhibiteurs de protéases. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un temps total d'analyse compris entre quatre et vingt-six heures, selon le type d'échantillon et la charge en toxine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et quantifier la neurotoxine botulique à partir d'échantillons complexes en utilisant une immunoprécipitation dans un système rapporteur protéique basé sur la fluorescence.

N'oubliez pas que le travail avec les neurotoxines botuliques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants, le respect des consignes de laboratoire, ainsi que l'utilisation de hottes de sécurité chimique et biologique doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.