L'isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

L’objectif global de cette procédure est de quantifier l’activité protéolytique de la neurotoxine botulique dans des matrices complexes telles que des échantillons pharmaceutiques, environnementaux et alimentaires. Pour ce faire, il faut d’abord traiter des échantillons de test et de courbe standard si nécessaire, afin d’établir des conditions de pH et de viscosité appropriées. Ensuite, la neurotoxine botulique est immunoprécipitée à partir des échantillons à l’aide de billes magnétiques enrobées d’anticorps.

Ensuite, les billes magnétiques sont soigneusement lavées pour éliminer tous les composés interférents et remises en suspension dans un tampon de réaction optimisé. Enfin, les billes lavées sont incubées à l’aide d’un rapporteur protéique et mesurent spectroscopiquement le clivage du rapporteur au fil du temps. En fin de compte, la comparaison du clivage du rapporteur dans les échantillons d’essai par rapport aux échantillons de la courbe standard est utilisée pour quantifier l’activité de la toxine botulique dans les échantillons d’essai avec une sensibilité d’essai biologique de souris à proche de la souris.

Les principaux avantages de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que la souris, l’essai biologique, l’immunologique et d’autres méthodes fluorescentes sont que cet essai ne nécessite pas l’utilisation d’animaux et qu’il a été démontré qu’il est utilisé dans des matrices très complexes trouvées dans des échantillons alimentaires, environnementaux et pharmaceutiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car un traitement et une dilution minutieux des échantillons sont nécessaires. La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Mark Dunning, scientifique chez Bio Sentinel.

Préparez des tampons conformément au protocole textuel pour générer une courbe standard pour quantifier les échantillons d’essai, pesez 10 plus ou moins 0,01 gramme d’échantillon d’aliment solide dans un tube conique de 50 millilitres et mettez de côté cet échantillon qui sera utilisé comme diluant dans un deuxième tube, pesez deux plus ou moins 0,01 gramme d’échantillon d’aliment solide. Ajouter la neurotoxine botulique ou achetée à la surface de l’échantillon d’aliment de deux grammes à une concentration finale de 30 000 MLD 50 par gramme d’aliment. Incuber le diluant et les échantillons enrichis à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant deux heures pour donner au robot le temps d’interagir avec la matrice alimentaire.

Pour imiter une contamination naturelle, reportez-vous au protocole textuel pour d’autres types d’échantillons. Ensuite, ajoutez un millilitre de GPB par gramme de nourriture aux échantillons enrichis et non enrichis, et utilisez un pilon pour homogénéiser jusqu’à ce qu’ils soient bien mélangés. Extrapolez le volume total de l’échantillon enrichi de deux grammes à partir du volume total approximatif de l’échantillon de diluant de 10 grammes.

Ajoutez ensuite un dixième volume de 10 x tampon de neutralisation à l’échantillon de diluant de 10 grammes et deux grammes ont acheté un échantillon enrichi en fonction de leurs volumes totaux. Bien mélanger les échantillons par inversion, clarifier partiellement les deux échantillons en les centrifugant pendant 10 minutes à 6 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez immédiatement les surnageants et transférez-les dans de nouveaux tubes à l’aide du robot : un échantillon enrichi en D un et l’échantillon non enrichi en tant que diluant génèrent les échantillons de courbe standard restants dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre.

Pour préparer des échantillons d’aliments solides, commencez par peser deux plus ou moins 0,01 gramme d’échantillon solide inconnu dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez deux millilitres de GPB et utilisez un pilon pour homogénéiser l’échantillon. Ensuite, ajoutez un dixième du volume de 10 x tampon de neutralisation à l’échantillon et mélangez bien par inversion après avoir partiellement clarifié l’échantillon par centrifugation pendant 10 minutes à 6 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius, transférez immédiatement au moins 750 microlitres de surnageant dans un micro tube de centrifugation.

Il s’agit de la première dilution inconnue. Ajoutez 675 microlitres de diluant dans deux tubes étiquetés dilution inconnue deux et trois. Le diluant sera le même matériau traité que celui utilisé pour la génération de courbes standard.

Utilisez la dilution un pour effectuer une dilution en série en transférant 75 microlitres de dilution un dans le tube de dilution deux et en mélangeant. Transférez ensuite 75 microlitres de dilution deux dans le tube de dilution trois et mélangez. Pour clarifier les échantillons, centrifugez-les pendant cinq minutes au moins 14 000 fois. Gravité.

Retirez immédiatement les surnageants et transférez-les dans de nouveaux tubes pour mettre en place une plaque pour les échantillons, ajoutez 20 microlitres de 10 tampons de liaison à chaque puits, chaque échantillon inconnu et les échantillons courbes standard D un à D huit nécessitent trois puits et l’échantillon D neuf nécessite six puits. Ajoutez 200 microlitres de chaque échantillon dans les puits respectifs et utilisez un mélangeur de microplaques pour mélanger la plaque pendant 10 secondes. Vortex l’IPA perle pendant 10 secondes à la vitesse la plus élevée ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement remise en suspension.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de billes dans chaque puits d’échantillon et mélangez la plaque pendant 30 secondes. Incuber la plaque dans un incubateur de plaques rotatif pendant deux heures à 750 tr/min et 25 degrés Celsius ou à température ambiante pour laver la plaque à l’aide d’un laveur de plaques automatisé. Après avoir exécuté le programme principal, placez la plaque sur la plaque de séparation des billes magnétiques à 96 puits sur la rondelle de plaque.

Exécutez ensuite le programme de lavage principal. Une fois le programme terminé, retirez la plaque de la rondelle. Ajoutez 50 microlitres d’un tampon de réaction dans chaque puits d’échantillon et mélangez pendant 30 secondes.

Pour lancer le test de matrice de test de bot, ajoutez 50 microlitres de rapporteur AE de 0,5 micromolaire. À chaque puits d’échantillon pour éviter les effets de bord, ajoutez 100 microlitres d’eau à chaque inutilisé. Utilisez du ruban adhésif pour plafond pour sceller la plaque, la protéger de la lumière et l’incuber à 750 tr/min et 25 degrés Celsius ou à température ambiante.

À chaque lecture, retirez la plaque de l’incubateur. Retirez le ruban de plafond et placez immédiatement la plaque Sur la plaque de séparation des billes magnétiques à 96 puits, laissez les billes se séparer pendant deux minutes. Placez la plaque dans le lecteur de microplaques et mesurez les émissions à environ 470 et environ 526 nanomètres sous excitation à environ 434 nanomètres.

Si des temps de lecture supplémentaires sont souhaités, après avoir suspendu les billes pendant 30 secondes sur le mélangeur de microplaques, refermez la plaque et remettez-la dans l’incubateur. Voici les résultats d’un test à l’aide d’un robot holographique dopé dans le PBS et testé après des incubations de deux, quatre et 24 heures avec le rapporteur AE. Le clivage du rapporteur par le robot est mesuré comme une réduction du rapport d’émission mesuré par notre lecteur de plaques à environ 2,7 pour le rapporteur intact à environ 0,7 pour le rapporteur entièrement clivé.

Les valeurs spécifiques seront différentes entre les lecteurs de plaques, comme en témoigne le décalage vers la gauche de la courbe, un temps d’incubation prolongé avec le rapporteur entraîne une augmentation du clivage du rapporteur. Les points de données testés en trois exemplaires affichent un faible écart-type de la moyenne et suivent la tendance attendue d’une augmentation du taux d’émission avec une diminution de la charge de toxines. L’incapacité du test à suivre cette tendance attendue peut indiquer une erreur lors de la génération de la dilution ou des données traçant les rapports d’émission des témoins ne contenant pas de bot A restant également stables pendant l’incubation, indiquant l’absence d’activité protéase non spécifique.

Cette figure illustre la méthodologie générale utilisée pour détecter ou quantifier tout échantillon inconnu par rapport à une courbe standard et quantifie les échantillons de robots pharmaceutiques. Une courbe standard a été générée dans le PBS avec un robot purifié, un holotoin et traitée en parallèle avec des dilutions du produit médicamenteux générées à partir d’un seul flacon de 100 unités de Botox lyophilisé réhydraté dans une solution saline à 0,9 %. Dans ce test, la partie linéaire de la courbe standard se situe entre un rapport d’émission de 2,11 et 1,05, et est indiquée par la case pointillée dans la figure. Les concentrations des trois inconnues qui se situent dans cette plage linéaire ont ensuite été interpolées à partir de la courbe standard.

Dans cette expérience, des tomates fraîches et du lait à 2 % ont été utilisés comme matrices alimentaires solides et liquides et enrichis avec du bot, un complexe composé des protéines de base associées au hollo, à la toïne et aux neurotoxines. Cette combinaison a été choisie parce qu’elle ressemble à la toxine produite lors d’une contamination naturelle par le clostridium, comme le montre ici. La récupération du bot A est observée avec les deux matrices.

De plus, l’augmentation du temps d’incubation avec le rapporteur augmente la sensibilité de l’essai, mais n’entraîne pas une diminution des rapports d’émission pour les témoins sans toxines, ce qui indique que le clivage observé résulte du bot A et non de la protéase non spécifique provenant de l’aliment dans l’essai. Le bot A-L-O-D-L-O-Q et EC 50 pour les deux aliments à chaque point temporel indiqué sont résumés dans ce tableau. La LD et la LQ sont définies comme l’échantillon de concentration le plus faible, avec un rapport d’émission inférieur à trois et 10 écarts-types inférieurs au niveau de fond, respectivement.

On s’attend à une certaine variabilité d’une matrice à l’autre dans la LD et la LOQ, car les effets de matrice peuvent influencer la liaison de la toxine aux billes et la récupération des billes pendant le lavage. Bien qu’il semblerait que la récupération des toxines dans le lait à 2 % soit plus élevée que dans les tomates, cette différence résulte en grande partie de la dilution supplémentaire nécessaire pour homogénéiser les échantillons de tomates dans le GPB. En plus d’être une matrice alimentaire solide, les tomates sont un type d’échantillon remarquable où l’ajustement du pH et de la force ionique est essentiel au succès du test.

Cette figure illustre les réponses obtenues lors de l’essai sur des tomates avec ou sans l’inclusion du tampon de neutralisation 10 fois. L’omission d’ajouter le tampon entraîne une mauvaise récupération du bot A à partir des échantillons et est démontrée par un rapport d’émission constant pour toutes les concentrations de bot A testées, l’ajout du tampon de neutralisation 10 x, cependant, entraîne une détection sensible des toxines, les protéases non spécifiques peuvent être endogènes à l’échantillon alimentaire ou introduites lors de l’utilisation de préparations de bots non purifiées telles que la culture de Clostridium, surnageants, et peut fendre le rapporteur AE, conduisant à des résultats faussement positifs. Cet exemple démontre l’activité non spécifique de la protéase observée chez les surnageants de culture de Clostridium bot a utilisant un rapporteur modifié qui n’est plus clivé par le bot A. Les niveaux élevés de clivage du rapporteur indiquent la culture.

Le surnageant contient une activité protéase significative, qui est effectivement annulée par l’ajout d’inhibiteurs de protéase. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à 26 heures de temps de test total, selon le type d’échantillon et la charge de toxines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de quantifier la neurotoxine botulique à partir d’échantillons complexes en utilisant l’immunoprécipitation dans un système de rapporteur de protéines basé sur la fluorescence.

N’oubliez pas que travailler avec des neurotoxines botuliques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants, des codes de laboratoire et des enceintes de sécurité chimiques et biologiques doivent être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.