Name: Visualisation de lATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez la cryo-tomographie électronique pour visualiser la structure des protéines mitochondriales dans leur état natif. Cette méthode révèle l'organisation des dimères d'ATP synthase avec une résolution élevée.

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Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck (KMD, BD, MN, la tuberculose, TBB, DJM, et WK), le pôle d&#39;excellence de Francfort &quot;macromoléculaires complexes», financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) et un EMBO long terme postdoctoral Fellowship (VAMG).

1 Préparation des mitochondries à partir de cellules ou de tissus humains par centrifugation différentielle Cette section décrit une procédure générale pour l&#39;isolement des mitochondries intactes de différents organismes eucaryotes. La précision des composants du tampon et de la vitesse de centrifugation doivent être optimisés pour chaque tissu / espèces étudiées. <ol><li> Faire éclater les cellules dans un tampon isotonique (par exemple, 250 mM de saccharose, 10 mM d&#39;HEPES pH 7,4), en utilisant un broyeur à billes de verre (mycélium) 28, une digestion enzymatique de la paroi cellulaire (Saccharomyces cerevisiae) 29, d&#39;un homogénéisateur à roulement à billes (single -Chargeur eucaryotes / cellules / culture) 30 nematodes, ou un mélangeur (de tissus animaux ou végétaux) 31. </li><li> Éliminer les débris cellulaires par filtration à travers une mousseline suivie d&#39;une centrifugation à basse vitesse (2000 x g, 4 ° C, 10 min). </li><li> Recueillir surnageant et de culot de mitochondries par centrifugation à grande vitesse (9000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Si nécessaire, utiliser un gradient de densité isotonique étape de purification supplémentaire de la fraction mitochondriale 32. </li></ol> 2 Préparation des mitochondries pour cryo-tomographie La section suivante décrit comment obtenir les échantillons congelés-hydratés pour cryo-ET. REMARQUE: La méthode implique l&#39;utilisation de l&#39;azote liquide extrêmement froid et de l&#39;éthane, qui peut causer de graves brûlures de la peau. des lunettes de protection et des gants cryo-protection doivent être portés. Éthane liquide, qui est également inflammable, doit être traitée dans une hotte de laboratoire. <ol><li> Remettre en suspension les mitochondries culot dans 250 mM de tréhalose, 10 mM de tampon HEPES à pH 7,4 à une concentration d&#39;environ 5 mg / ml de protéine totale. </li><li> Décharge luminescente grilles EM trouée de carbone, du carbone jusqu&#39;à latérales, dans un dispositif à vide selon les instructions du fabricant. </li><li> Liquéfier quelques millilitres d&#39;éthane en dirigeant un courant de gaz d&#39;éthane sur le côté intérieur d&#39;un froid de l&#39;azote liquiderécipient en aluminium éd. </li><li> Mélanger la suspension de repère d&#39;or de la protéine A conjuguée à 1: 1 avec suspension mitochondriale et appliquer immédiatement 3 pi à un réseau EM décharge luminescente qui s&#39;est tenue à pinces. </li><li> Placez la pince à épiler dans un dispositif de vitrification, par exemple, une guillotine fait maison. Éponger l&#39;excès de liquide avec un coin de papier filtre (~ 5 secondes ou jusqu&#39;à ce que le liquide cesse d&#39;étalement) et plonger immédiatement dans la grille de l&#39;éthane liquide en relâchant la gâchette. </li><li> Transférer la grille à partir d&#39;éthane liquide dans l&#39;azote liquide. Pendant le transfert, enlever l&#39;excès d&#39;éthane à partir de la grille avec un papier filtre. Placez l&#39;extrémité d&#39;un morceau de papier filtre en forme de coin dans la éthane liquide. Comme l&#39;éthane liquide monte doucement glisser la grille le papier du filtre, mais le garder au-dessous du front de liquide. Éthane liquide est retiré de la grille par une action capillaire, et une fois tous éthane liquide a été retiré, transférer immédiatement la grille dans l&#39;azote liquide. </li><li> Placer la grille vitrifiés dans une boîte de rangement de grille, unee stocker de l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure, le cas échéant. </li></ol> 3 Enregistrement des tomographique Tilt Series La section suivante décrit comment mettre en place et de recueillir une série d&#39;inclinaison tomographique d&#39;une mitochondrie avec un microscope électronique à Polara équipé d&#39;un filtre d&#39;énergie post-colonne et d&#39;une caméra CCD. Des protocoles similaires sont utilisés avec tous les électrons cryo-microscopes équipés de caméras CCD ou directs de détection électronique. <ol><li> Aligner le microscope <ol><li> Insérez éprouvette par exemple, le graphite et les îles d&#39;or sur le film de carbone à trous. </li><li> Sélectionnez le mode de recherche dans le système à faible dose du microscope. </li><li> Amener l&#39;échantillon à la hauteur eucentrique. C&#39;est le point de déplacement xy minimal lors de l&#39;inclinaison du porte-échantillon. Centrer un point d&#39;intérêt à 0 ° d&#39;inclinaison, l&#39;inclinaison de la scène à 20 ° et recentrer le point en modifiant la hauteur z. Retour à 0 ° et répéter jusqu&#39;à ce décalage latéral est minimisé. </li><li> Sélectionnermode d&#39;exposition. Choisissez agrandissement souhaité pour la collecte d&#39;une tomographie (par exemple, 25,000X sur le détecteur ≈ 0,6 nm Taille de l&#39;échantillon de pixels). </li><li> Choisissez une ouverture du condenseur de petite taille (50-70 mm) et sélectionnez une taille de spot et de l&#39;intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d&#39;imagerie et donne une lecture de pixel de 60 e - / pixel (CCD) ou 14 e - / pixel / s (détecteur d&#39;électrons direct, mode de comptage). </li><li> Centre d&#39;ouverture du condenseur. </li><li> Trouver gaussien accent par exemple, point de contraste minimal. Réinitialiser le microscope lecture de défocalisation et des points de pivotement et de corriger le centre de rotation selon les instructions du fabricant. </li><li> Cadran en défocalisation souhaité pour l&#39;enregistrement de tomographie. REMARQUE: Haute défocalisation (8 pm) augmente le contraste mais réduit la résolution, alors qu&#39;une faible défocalisation (2-4 pm) augmente la résolution au détriment de contraste. </li><li> Sur un trou vide, générer une nouvelle référence de gain et aligner filtre d&#39;énergie selon le fabricant deinstructions. </li><li> Alignez les modes de recherche et d&#39;exposition. En mode d&#39;exposition, centre un point d&#39;intérêt et de passer en mode de recherche. Choisir un grossissement de 1,500X (0,033 um / pixel de l&#39;échantillon sur le détecteur) et défocalisation de 100 um (pour augmenter le contraste). Apportez point d&#39;intérêt retour à centrer utilisant des bobines de décalage d&#39;image. </li><li> En mode de recherche, ajustez la taille du spot et de l&#39;intensité du faisceau de sorte que le faisceau est juste plus large que le dispositif d&#39;imagerie et donne une lecture de pixel d&#39;environ 20 e - / pixel (CCD) ou ~ 8 e - / pixel / sec détecteur d&#39;électrons direct (, mode de comptage). </li></ol></li><li> Trouver une zone de bon spécimen <ol><li> Insérez la grille avec des mitochondries congelés-hydratés dans le microscope électronique à la température de l&#39;azote liquide (reportez-vous aux instructions du fabricant EM). </li><li> En mode de recherche, la recherche de la grille pour les zones de l&#39;épaisseur de la glace et de l&#39;échantillon qualité appropriée. Prenez une photo de recherche de 6 sec de domaines prometteurs pour déterminer l&#39;aptitude pour la collecte de tomographie. Both la membrane mitochondriale interne et externe doit être visible à ce grossissement. </li></ol></li><li> Enregistrement d&#39;une série Tilt tomographique <ol><li> Une fois une bonne surface de l&#39;éprouvette se trouve, inclinez la scène ± 60 ° pour déterminer la plage d&#39;inclinaison maximale qui est disponible sans aucune obstruction de l&#39;exposition ou la zone de mise en barreaux de la grille ou des morceaux de glace. </li><li> Sur un trou rempli de glace à proximité d&#39;apparence similaire, changer de mode d&#39;exposition et d&#39;ajuster l&#39;intensité du faisceau ou de l&#39;acquisition de l&#39;image du temps de sorte que chaque image enregistrée a une dose d&#39;électrons de 30-50 e - / pixel pour CCD ou 6-8 e - / pixel / s détecteurs d&#39;électrons directs, mode comptage. </li><li> Calculer le rapport de distribution de dose (I 0 / I 60) en divisant le nombre moyen d&#39;électrons pour une image acquise pendant 1 seconde à 0 ° avec celle de l&#39;image de 60 °. Ce rapport décrit l&#39;augmentation du temps d&#39;exposition nécessaire pour maintenir un taux constant d&#39;électrons par image avec l&#39;augmentation de l&#39;angle d&#39;inclinaison (= temps d&#39;exposition 1 / cos (α) n où (I 0 / I 60) = 2 n). Le rapport est aussi une bonne indication de l&#39;épaisseur de la glace. Bonnes tomographies de mitochondries sont généralement enregistrés avec un I 0 / I 60 = 2.3-2.6. </li><li> Sur un trou vide, d&#39;acquérir une image de 1 sec en mode d&#39;exposition et de noter le nombre d&#39;électrons par Å 2. Prenant en compte le rapport de distribution de dose, calculer le nombre total d&#39;images pouvant être enregistrées pour une dose totale spécifique d&#39;électrons (par exemple, &lt;40 e - / Å 2 pour la détermination de la structure et ~ 160 e - / Å 2 pour la morphologie). </li><li> Déterminer l&#39;intervalle d&#39;inclinaison approprié pour la collecte de tomographie en divisant la plage verticale (par exemple, 120 ° pour ± 60 °) par le nombre total d&#39;images calculées en 3.3.4. </li></ol></li><li> Mettre en place et enregistrer une tomographie avec les paramètres déterminés ci-dessus en utilisant un logiciel de collecte automatique de données approprié 33, 34. série Tilt débute habituellement à ± 20 ° et passent par 0 ° avant d&#39;atteindre élevés s&#39;incline afin de maximiser le contenu de l&#39;information d&#39;images à faible inclinaison qui est détruit par augmentation de la dose d&#39;électrons. </li></ol> 4 Création et segmentation des volumes tomographiques Cette section décrit comment volumes tomographiques de mitochondries sont générés à partir de séries d&#39;inclinaison et la façon dont les volumes sont présents pour l&#39;affichage général. <ol><li> Enregistrer la série tomographique d&#39;inclinaison pour un répertoire approprié. Générer une pile d&#39;images et de les convertir dans un format de fichier approprié avec le logiciel open-source, comme dm2mrc ou tif2mrc (paquet MID), qui convertissent .dm3, .dm4 ou .tif fichiers à piles mrc. mrc piles sont nécessaires pour la reconstruction tomographique avec MID 35. Autres forfaits exigent des formats. </li><li> Aligner les images et générer une tomographie en suivant les étapes décrites dans le tutoriel MID ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Améliorer le contraste de l&#39;tomogramme en utilisant le filtre de diffusion anisotrope non linéaire distribués avec IMOD. Ce filtre fonctionne bien pour les membranes et les particules associées à la membrane, tels que l&#39;ATP synthase. </li><li> Pour la visualisation, le segment manuellement la tomographie en utilisant des programmes disponibles dans le commerce par exemple, Amira. Attribuer voxels correspondant à la membrane interne ou externe et de générer une surface. Utilisation de l&#39;option de clicker dans le plugin EM-paquet pour AMIRA 36 marquer l&#39;emplacement des particules de l&#39;ATP synthase. </li></ol> 5. Subtomogram Moyenne de l&#39;ATP synthase dimères et pose de X-Ray Structures La section suivante décrit comment moyennes subtomogram de l&#39;ATP synthase dimères peuvent être obtenus. <ol><li> En utilisant les particules marquées en entrée et un logiciel approprié tel que la «PartieEstimation icle programme tomographie électronique »pour, calculer une moyenne de subtomogram. </li><li> Pour obtenir une estimation de la résolution, de comparer deux moyennes de subtomogram déterminés indépendamment par Fourier coque corrélation 37. </li><li> Si disponibles, quai connu structures de rayons X dans la moyenne de subtomogram par corps rigide montage, soit manuellement, soit en utilisant des routines automatiques d&#39;accueil séquentiel, tels que ceux du programme Chimera 38. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole présenté ici fournit une introduction de cryo-ET et subtomogram moyenne des mitochondries, mais essentiellement la même procédure peut être appliquée à n&#39;importe quel autre compartiment de la cellule ou de la membrane. Pour obtenir les meilleures données possibles, les étapes critiques de la procédure sont la préparation des échantillons, la stratégie d&#39;acquisition de données et des processus de congélation plongeon. Qualité échantillon, ce qui est essentiel pour le succès, dépend d&#39;un protocole de congélation optimisé pour garantir une épaisseur de glace appropriée, qui est d&#39;une importance primordiale pour un bon contraste d&#39;image. La stratégie optimale d&#39;acquisition de données dépend de l&#39;instrument et de l&#39;échantillon. Paramètres à optimiser comprennent dose d&#39;électrons par image, système d&#39;inclinaison et défocalisation. L&#39;acquisition d&#39;une bonne tomographie d&#39;un bon échantillon rend tout traitement ultérieur étapes plus facile et assure un résultat final satisfaisant. Cryo-ET combiné avec subtomogram moyenne et atomique ajustement du modèle fournit des détails sur la façon dont les complexes de protéines sont disposées en eenvironnement cellulaire natif leu. La technique est également adaptée à l&#39;étude de la structure de grands complexes de protéines membranaires, tels que supercomplexes respiratoires de chaîne (1,7 MDA), les dimères de l&#39;ATP synthase (2x500 kDa), ou le complexe du pore nucléaire (~ 120 MDa) 8, 9, 17. L&#39;organisation de l&#39;ATP dimères synthase en lignes ne peut être observée par des techniques à haute résolution tels que la cristallographie aux rayons X, RMN ou une particule cryo-EM, parce que les rangées de dimères sont perturbés par extraction au détergent, qui est une étape nécessaire dans l&#39;isolement et la purification de complexes protéiques de la membrane. L&#39;agencement de l&#39;ATP synthase dans des rangées de dimères long des crêtes de crêtes est un principe d&#39;organisation universelle des mitochondries dans toutes les espèces. Les complexes de pompage de protons de la chaîne de transport d&#39;électrons, en particulier complexe I (NADH déshydrogénase), sont situés dans les zones de chaque côté des rangées de membrane 8,9. Cette organisation de la chaîne respiratoire a un impact profond sur la bioénergétique mitochondriale. Si les rangées de dimères ne peuvent se former en raison de l&#39;absence de sous-unités protéiques spécifiques aux dimères, les cellules présentent des temps de génération et de remise en forme cellulaire réduite, comme observé dans le mutant de levure représenté sur la figure 3 41. Avec l&#39;intérêt croissant pour les maladies mitochondriales, un détail compréhension de la base moléculaire régissant ultrastructure et la fonction mitochondriale est d&#39;une importance primordiale. Cryo-tomographie fournit un lien entre la structure de la protéine déterminée par des méthodes à haute résolution, et la distribution et la disposition de ces protéines dans la membrane à l&#39;échelle du nanomètre. Cela rend cryo-ET un outil essentiel pour comprendre la structure et la fonction mitochondriale dans la santé et la maladie. Développements et améliorations techniques complémentaires en cryo-ET comprennent des stratégies protéine d&#39;étiquetage pour identifier la position de protein sous-unités dans des complexes macromoléculaires ou la localisation de protéines distinctes plus petites ou moins (&lt;0,5 Mda) dans les cellules. En outre, les méthodes de traitement hybride EM, qui se combinent avec une moyenne subtomogram analyse de particules isolées ou de reconstruction hélicoïdale ont récemment déterminé les structures des protéines à ~ 8 A 42, 43. Ces méthodes de traitement sont actuellement limitées aux protéines purifiées, qui sont bien séparés dans la glace ou forment des ensembles hélicoïdaux et sont actuellement pas applicable aux environnements cellulaires très fréquentés comme les mitochondries et les membranes des crêtes. Pour la collecte des données, de nouveaux outils informatiques et de matériel sont en cours d&#39;élaboration pour permettre l&#39;acquisition de tomographie automatisée, augmenter le contraste d&#39;image et de réduire la dose totale d&#39;électrons nécessaire. La seule limitation fondamentale dans cryo-ET est dégâts d&#39;irradiation de l&#39;échantillon par le faisceau d&#39;électrons. Cela signifie que seulement de très faibles doses d&#39;électrons peuvent être utilisés pour enregistrer chaque image d&#39;une série d&#39;inclinaison tomographique, entraînant un mauvais rapport signal trapport qui limite finalement la résolution réalisable o-bruit. Les nouveaux détecteurs d&#39;électrons directe, publié il ya moins d&#39;un an, sont actuellement en train de révolutionner le domaine de la seule particule cryo-EM 44, 45. Ces nouveaux détecteurs offrent un contraste plus élevé et une meilleure résolution à des doses plus faibles d&#39;électrons. Par cryo-tomographie, cela signifie que les séries de basculement avec de plus petites tailles de pas ou des tomographies de l&#39;axe même doubles peuvent être collectées sans s&#39;inquiéter de dégâts d&#39;irradiation excessive (une image CCD est équivalente à la dose d&#39;électrons de 5 images directes de détecteur d&#39;électrons). Les vastes quantités de données produites par ces détecteurs de créer leurs propres défis en matière de manutention, le traitement et le stockage, qui devront être surmontés. En outre, les plaques de phase, qui fonctionnent sur ​​les mêmes principes que ceux qui sont utilisés en routine dans la microscopie optique pour augmenter le contraste de phase, sont actuellement en cours de développement pour la microscopie électronique à transmission 46, 47. Cela devrait permettre tomographies à collecter plus proche de focaliser et donc à la résolution plus élevée, tout en préservant en même temps basse résolution propose nécessaire pour l&#39;alignement et l&#39;interprétation des volumes tomographiques. Pris ensemble, ces avancées technologiques seront grandement élargir la gamme des questions biologiques qui peuvent être traités par cryo-ET.

Les mitochondries sont les centrales d&#39;énergie de la cellule. Par conversion d&#39;un gradient de proton électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne en énergie de liaison chimique, l&#39;ATP synthase mitochondriale produit la plupart de l&#39;ATP qui entraîne des processus cellulaires. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents conversion d&#39;énergie mitochondriale, nous avons besoin de déterminer la structure de l&#39;ATP synthase in situ, et pour savoir comment il est organisé et distribué dans la membrane mitochondriale interne. Bien que les structures à haute résolution de la plupart des composants mitochondriaux de l&#39;ATP synthase 3.1 et cartes à faible résolution de l&#39;ensemble du complexe 4 sont disponibles, il est important d&#39;établir la structure et la conformation de l&#39;enzyme active dans la membrane. La distribution de l&#39;ATP synthase dans la membrane mitochondriale interne a été largement supposé être aléatoire, mais un début de trouver 5 et nos propres résultats initiaux 6 indiqué que ce n&#39;est pas til cas. Des études ultérieures de notre groupe et d&#39;autres 7 ont confirmé que l&#39;ATP synthase est disposé dans de longues rangées de dimères sur les crêtes étroitement courbes de la mitochondriale interne crêtes de la membrane 8, tandis que les pompes à protons de la chaîne de transport d&#39;électrons semblent être situés de chaque côté des lignes 9. Cette disposition a d&#39;importantes implications pour les mécanismes de conversion d&#39;énergie mitochondriale. La technique que nous avons utilisée pour déterminer cette disposition est cryo-tomographie (cryo-ET). Cryo-ET est actuellement la seule méthode qui offre précises volumes en trois dimensions (3D) de cellules, des compartiments cellulaires ou des organites à une résolution moléculaire. Cryo-ET est particulièrement adapté à l&#39;étude de grands complexes dans les membranes biologiques, car les membranes apparaissent avec un bon contraste et sont faciles à tracer des volumes tomographiques en 3D. D&#39;autres méthodes pour étudier la structure 3D de cellules ou organelles ne donnent pas de détails moléculaire. Super-résolution de la microscopie à lumière 10, 11 est excellent en révélant la position ou la distance entre les marqueurs luminescents liés à des protéines d&#39;intérêt avec une précision de quelques dizaines de nm, mais il ne révèle pas la structure de la protéine elle-même, même à basse résolution . microscopie électronique à transmission de coupes en série 12 ou imagerie îlot par microscopie électronique à balayage 13 d&#39;échantillons biologiques plastique intégré offrent une vue basse résolution de volumes cellulaires, mais également ne pas révéler les détails moléculaire. La microscopie à force atomique 14 peut en principe délivrer résolution moléculaire ou atomique même, mais seulement à la surface des objets sur un support solide atomiquement plat. Enfin, tomographie par rayons X 15 ou diffusion de intenses impulsions de rayons X par des lasers à électrons libres 16 est peu probable pour révéler la structure de grands complexes, objets apériodiques comme les cellules ou les organites entiers à mrésolution olecular dans un avenir prévisible. Ainsi à l&#39;heure actuelle, il n&#39;y a pas d&#39;alternative à cryo-ET pour les études de la structure 3D de cellules ou organites à résolution nanométrique. Cryo-ET est la méthode de choix pour l&#39;examen de la structure et la conformation des assemblages de protéines associées à la membrane, y compris le complexe du pore nucléaire 17, le pic de la grippe se complexe 18, et les flagelles des protéines motrices 22, 23, mais également l&#39;organisation des cellules bactériennes entières 19 et l&#39;entrée de virus pathogènes comme le VIH dans les cellules 20-23. Cryo-ET est inestimable pour la visualisation de protéines filamenteuses et leurs interactions dans la cellule, dont les filaments d&#39;actine 24 ou axonèmes 25. La résolution peut être améliorée à 2 nm ou mieux par subtomogram moyenne 26, dans lequel sont découpées sous-volumes de répétition, des traits réguliers sur un volume tomographique et en moyenne par une particule d&#39;image prodes techniques de transformation. Cryo-ET comprend l&#39;acquisition d&#39;une série d&#39;images de projection d&#39;un spécimen mince (&lt;250 nm d&#39;) prises sous différents angles d&#39;inclinaison dans un microscope électronique à transmission (MET). Le spécimen doit être mince pour que des électrons qui interagissent fortement avec la matière, sont dispersés plus d&#39;une fois. Diffusion multiple rend les images qui en résultent difficiles à interpréter et réduit le contraste. Les images de la zone sélectionnée de l&#39;échantillon sont alignés par rapport à l&#39;autre et prévus dans un espace 3D par un programme informatique approprié, la génération d&#39;un volume 3D de l&#39;échantillon. L&#39;alignement des images est assisté par marqueurs fiduciaires or, qui sont mélangés avec l&#39;échantillon avant la congélation. Marqueurs fiduciaires Idéalement 10 ou plus uniformément réparties doivent être présents dans chaque image pour obtenir un bon alignement. Pour observer en détail moléculaire, les échantillons sont congelés plongée dans l&#39;éthane liquide, ce qui préserve leur état hydraté natif. Congélation en liquideéthane est si rapide (~ 10 5 ° C / s) 27 que l&#39;eau ne cristallise pas, mais reste dans un état ​​vitrifié, semblable à du verre. cristaux de glace des dommages-intérêts de la formation des structures biologiques sensibles. Comme échantillons biologiques souffrent de dégâts d&#39;irradiation, il existe une limite pour le nombre total d&#39;événements de diffusion de l&#39;échantillon peut tolérer. Les images sont ainsi acquises en mode à faible dose: Une zone d&#39;intérêt est identifié à faible grossissement (1,500X) avec une dose d&#39;électrons inférieure à 1 e - / nm 2 (mode de recherche). L&#39;image est ensuite porté à un plus fort grossissement, hors de la zone d&#39;intérêt (mode de mise au point). Ce n&#39;est que lorsque l&#39;image est acquise, la zone d&#39;intérêt est irradié avec une dose plus élevée d&#39;électrons (mode d&#39;exposition). Ici, nous présentons un aperçu de la façon de recueillir et d&#39;électrons de processus cryo-tomographie, en utilisant de l&#39;ATP synthase dimères dans la membrane mitochondriale interne comme un exemple. Le protocole suivant décrit comment préparer les mitochondries pour cryo-ET, comment mettre en placeet collecter une série d&#39;inclinaison avec une dose d&#39;électrons totale spécifique, et la manière de traiter la série d&#39;inclinaison pour obtenir un volume 3D de la zone d&#39;intérêt. Une vue d&#39;ensemble de la procédure est illustrée sur la figure 1.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>biomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradient de densité moyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 ou P1644</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A or</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Ethane</td><td>Air Liquide</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td>Air Liquide</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>Non magnétique, motif #5</td></tr><tr><td>EM grille de test combinée</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>Grapite et Îles d’or sur film de carbone troué</td></tr><tr><td>Grilles de carbone Holey</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH ou C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu</td></tr><tr><td>mesh Boîtes de grille cryogénique</td><td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>Boîtes métalliques alternatives faites maison</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur à billes de verre - batteur de billes</td><td>BioSpec Produits</td><td>1107900-105</td><td>Y compris billes de 0,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>Homogénéisateur à roulement à billes (Balch)</td><td>Centrifugeuse Thermo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>Appareil à décharge luminescente</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de vitrification de grille</td><td>FEI, Gatan ou Leica</td><td></td><td>Piston alternatif fait maison</td></tr><tr><td>Microscope électronique</td><td>à transmission FEI ou Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Détecteur d’électrons direct</td><td>Gatan</td><td>K2 sommet</td><td>4k x 4k pixels, mode compté</td></tr><tr><td>Dispositif à couplage de charge (CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k pixels (alternative au détecteur d’électrons direct))</td></tr><tr><td>Filtre énergétique</td><td>Gatan ou Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de tomogrammes</td><td>Gatan, FEI, USCF ou UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternatives</td></tr><tr>au<td>logiciel de traitement de tomogramme</td><td>FEI, UCSF ou UC-Boulder</td><td></td><td>3</td></tr> <tr><td>alternativesLogiciel de calcul de la moyenne des sous-tomogrammes</td><td>UC-Boulder ou Université de Bâle</td><td></td><td>2 alternatives</td></tr><tr><td>Logiciel de visualisation de tomogramme</td><td>UC-Boulder, FEI ou Université de l’Utah</td><td></td><td>3 alternatives</td></tr><tr><td>Logiciel de visualisation Plugin de logiciel de visualisation</td> Université <td>Goethe</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Logiciel de visualisation</td><td>de structure UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Logiciel de calcul numérique</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

visualisation de l&#39;atp synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomographie est un outil puissant dans la biologie structurale, capable de visualiser la structure tridimensionnelle d&#39;échantillons biologiques, tels que des cellules, des organites, des vésicules membranaires ou des virus dans des détails moléculaire. Pour ce faire, l&#39;échantillon aqueux est rapidement vitrifié dans l&#39;éthane liquide, qu&#39;il conserve dans un état congelé-hydraté proche de l&#39;origine. Au microscope électronique, les séries d&#39;inclinaison sont enregistrés à la température de l&#39;azote liquide, à partir de laquelle on reconstruit des tomographies 3D. Le rapport signal-sur-bruit du volume tomographique est intrinsèquement faible. Reconnaissables, caractéristiques récurrentes sont renforcées par subtomogram moyenne, qui sous-volumes individuels sont découpés, alignés et moyenne pour réduire le bruit. De cette manière, les cartes 3D avec une résolution de 2 nm ou plus peut être obtenu. Un ajustement des structures disponibles en haute résolution pour le volume 3D produit alors des modèles atomiques de complexes de protéines dans leur environnement natif. Ici, nous montrons comment nous utilisons cryo-tomography pour étudier l&#39;organisation in situ de grands complexes de protéines membranaires dans les mitochondries. Nous constatons que les ATP synthases sont organisées en rangées le long des sommets de dimères à forte courbure de la membrane intérieure de crêtes, alors que le complexe I est distribuée de manière aléatoire dans les régions de la membrane de part et d&#39;autre des rangées. Par subtomogram moyenne, nous avons obtenu une structure de l&#39;ATP synthase mitochondriale le dimère à l&#39;intérieur de la membrane de crêtes.

Cryo-tomographie de mitochondries révèlent clairement la morphologie 3D de l&#39;organite (Figure 2). Segmentation manuelle de membranes dans un volume tomographique illustre la structure de l&#39;une des crêtes dans la mitochondrie. En imagerie de mitochondries à partir de différentes souches de levure knock-out dépourvues de certains composants de la protéine, l&#39;effet de ces protéines sur la morphologie des crêtes peut par évalué. Figure 3 montre une mitochondrie d&#39;une souche de levure dépourvue de sous-unité de l&#39;ATP synthase e. Ce composant du complexe ATP synthase est nécessaire pour la dimérisation de l&#39;ATP synthase mitochondriale. Les mitochondries à partir de cette souche manque les crêtes lamellaire normale des mitochondries de type sauvage (figure 2) et contient à la place d&#39;un certain nombre de compartiments de la membrane interne. Ces compartiments sont soit dépourvues de crêtes ou contiennent de petites invaginations de la membrane en forme de ballons (figure 3). Dans tomogrammes avec un bon contraste, grands complexes de protéines mitochondriales, dans ce cas ATP synthase dimères, sont facilement visibles (Figure 4; Film 1). Les structures des complexes peuvent être déterminés à la résolution de 2-3 nm par subtomogram moyenne (Figure 5; Film 2). Les volumes moyens peuvent être mis de nouveau dans le tomogramme en vue d&#39;évaluer la structure des complexes individuels par rapport à l&#39;autre et à d&#39;autres complexes de protéines dans la membrane (figure 6; Film 3). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 organigramme montrant les étapes de la cryo-tomographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Figure 2: Morphologie d&#39;une mitochondrie de type sauvage S. Cerevisiae. Tranche de centrale à travers un volume tomographique d&#39;un type sauvage S. mitochondrie cerevisiae (à gauche) et le volume de la surface-rendu correspondant (à droite). Le volume segmenté la membrane externe est représentée en gris et les volumes de la limite intérieure et crêtes membranes en bleu clair. Adapté de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 mitochondrie d&#39;une S. Cerevisiae manque une sous-unité nécessaire pourATP synthase dimérisation. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume d&#39;accompagnement (à droite) en surface rendue d&#39;une mitochondrie d&#39;une S. Cerevisiae manque le e de la sous-unité de la protéine nécessaire à l&#39;ATP synthase dimérisation. En comparaison avec la figure 2, la mitochondrie de la souche mutante manque de la normale lamellaire crêtes des mitochondries de type sauvage. Au lieu de cela, la mitochondrie a de nombreux compartiments membranaires intérieure avec soit sans crêtes ou crêtes en forme de ballon. Ainsi cryo-tomographie souligne modifications de la morphologie de la membrane due à la délétion de gènes. Adapté de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 mitochondrie du champignon P. anserina. Couper à travers le volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d&#39;accompagnement (à droite) d&#39;une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Dans ce tomographie, des rangées de 10 particules nm (têtes de flèches jaunes) sont situés au-dessus des crêtes de la membrane fortement incurvées dans les crêtes de la membrane interne (voir vidéo 1). Ces particules ont été identifiées comme l&#39;ATP synthase dimères par subtomogram moyenne. De Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 Structure et organisation de l&#39;ATP synthase mitochondriale. Side et vue de dessus montrant la densité électronique d&#39;un dimère ATP synthase de S. c<html> erevisiae tel que déterminé par subtomogram moyenne avec des modèles atomiques équipés (à gauche). Mitochondrial vésicule membranaire interne montrant l&#39;organisation de l&#39;ATP synthase dimères en rangées (à droite). La figure a été produite par le moyen de positionnement subtomogram de l&#39;ATP synthase dimère dans le volume segmenté de la vésicule de la membrane, en utilisant les coordonnées calculées au cours de la moyenne. Adapté de Davies et al 8. Modèles atomiques: F 1 / rotor torique [APB: 2WPD] 39 (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] 40 (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] 1 avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS] 2 (jaune et rouge) (voir vidéo 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 6 isolé crête vésicule d&#39;un P. anserina mitochondrie. tranches d&#39;un volume tomographique (à gauche) et le volume de surface-rendu d&#39;accompagnement (à droite) d&#39;une vésicule de crête de P. anserina. les densités de protéines dépassant de la membrane sont nettement visibles. Les densités indiquées par des flèches jaunes sont des dimères de l&#39;ATP synthase, comme identifié par subtomogram moyenne. Flèches vertes indiquent des densités identifiées par marquage de l&#39;anticorps comme NADH déshydrogénase (complexe 1, pour plus de détails voir 9). Segmentation des densités de protéines révèle leur organisation dans des crêtes, des dimères de l&#39;ATP synthase (rouge et jaune) qui forment des rangées le long des crêtes des crêtes très incurvés et les complexes NADH déshydrogénase (vert) dans les régions de la membrane de part et d&#39;autre des rangées (voir Film 3). De Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. Film 1 Electron cryo-tomographie d&#39;un P. anserina mitochondrie. Le film montre des tranches successives par un volume tomographique pris d&#39;une mitochondrie du champignon filamenteux P. anserina. Des rangées de l&#39;ATP synthase sont indiqués par des flèches jaunes. Le volume segmenté tensio-rendu indique l&#39;emplacement de l&#39;ATP synthase (sphères jaunes) par rapport à la structure 3D de crêtes. Membrane externe, gris; membrane limite intérieure, bleu transparent; crêtes membranes, bleu opaque. De Davies et al 9. Voir aussi la figure 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Film 2. moyenne de Subtomogram du mitochondriale d&#39;ATP synthase dimère de S. Cerevisiae avec des modèles atomiques équipés. La moyenne était decalculée à partir de 121 sous-volumes. La densité est affiché à trois niveaux de contour: 1s - maille, 2s - gris clair et gris foncé - 3s. Modèles atomiques ont été installés dans la densité en utilisant la routine ajustement séquentiel dans Chimera. Modèles atomiques: F 1 / rotor torique [APB: 2WPD] 39 (bleu et violet); oligomycine conférant sensible protéines PCORO [APB: 2BO5] 40 (vert); fragment de tige périphérique [APB: 2CLY] 1 avec les résidus N-terminaux de [APB: 2WSS]. 2 (jaune et rouge) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Adapté de Davies et al 8. Voir aussi la figure 5. Film 3 isolé crêtes vésicule d&#39;un P. anserina mitochondrie. tranches successives à travers le volume tomographique sont présentées, suivie par le volume de la surface-rendu segmenté. densités de protéines qui dépassent de la membrane d&#39;e sont clairement visibles. Densités rouges et jaunes sont des dimères de l&#39;ATP synthase. Densités verts sont NADH déshydrogénase (complexe I), telle que déterminée par marquage de l&#39;anticorps. De Davies et al 9. Voir aussi la figure 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a>

Nous présentons un protocole sur la façon de recueillir et électronique de processus cryo-tomographie de mitochondries entières. La technique donne un aperçu détaillé de la structure, la fonction et l&#39;organisation de grands complexes de protéines membranaires en membranes biologiques indigènes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la structure et l'organisation des protéines mitochondriales dans C two. Cela est réalisé en premier lieu en préparant une grille de microscopie électronique vitrifiée contenant l'échantillon. Ensuite, une série de clichés inclinés à dose limitée de l'échantillon est enregistrée dans un microscope électronique cryogénique.Ensuite, la série de basculement est traitée pour générer un volume tomographique. Enfin, les densités protéiques sont moyennées afin de déterminer la structure des protéines, et les membranes sont segmentées pour révéler leur structure tridimensionnelle. En repositionnant les moyennes des protéines dans les Tom Grahams, la structure et l'organisation des protéines dans la membrane sont mises en évidence.Nous réalisons donc une tomographie électronique cryogénique des mitochondries afin de comprendre leur fonctionnement au niveau moléculaire. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, comme la microscopie électronique de coupes minces en plastique, réside dans une résolution plus élevée. Le matériel n'est fixé par aucun procédé chimique, et les détails moléculaires des protéines sont préservés.La technique de cryomicroscopie électronique peut prendre un certain temps à maîtriser, mais les utilisateurs expérimentés peuvent acquérir cinq à six bonnes séries de tomographies par session. La partie la plus délicate de la procédure consiste à produire des grilles vitrifiées avec une épaisseur optimale de glace. Après avoir isolé et mis en pellet les mitochondries selon le protocole décrit, utilisez du tampon T trioses 250 millimolaire dans un tampon HEPA 10 millimolaire pour resuspendre le culot à une concentration d’environ cinq milligrammes par millilitre de protéines totales. Traitez par décharge lumineuse des grilles de microscopie électronique en carbone, côté carbone vers le haut, dans un appareil sous vide selon les instructions du fabricant, puis liquéfiez quelques millilitres d’éthane en dirigeant un flux de gaz d’éthane sur la face interne d’un récipient en aluminium refroidi à l’azote liquide.Utilisez une paire de pinces pour prendre une grille DM soumise à un décharge luminescente et placez-la sur le banc. Mélangez la protéine avec une suspension de repères d'or conjugués, en proportion un-à-un avec la suspension mitochondriale, puis appliquez immédiatement trois microlitres de la solution sur la grille. Ensuite, placez les pinces dans un dispositif de vitrification, tel qu'une guillotine maison, avec un coin de papier filtre pour éliminer l'excès de liquide sur la grille, puis relâchez le déclencheur afin d'immerger immédiatement la grille dans de l'éthane liquide. Puis transférez la grille de l'éthane liquide dans de l'azote liquide.Retirez l'excès d'éthane de la grille en plaçant l'extrémité d'un coin neuf de papier filtre dans l'éthane liquide. Lorsque le liquide monte, faites glisser doucement la grille le long du papier filtre en la maintenant sous le front liquide, puis transférez-la immédiatement dans de l'azote liquide pour la conserver en vue d'une utilisation ultérieure. Placez la grille dans une boîte à grilles et conservez-la dans un doer rempli d'azote liquide pour enregistrer une série de basculement tomographique.Commencez par vous assurer que les réservoirs d'azote liquide sont pleins, puis vérifiez que la température du porte-échantillon et du dispositif de transfert de grille est inférieure à 100 kelvins. Vérifiez que le microscope électronique est correctement aligné en acquérant une image d'une grille témoin et en examinant la qualité des anneaux de diffraction ; ces derniers doivent être circulaires et s'étendre jusqu'au bord de l'image. Ensuite, insérez une grille contenant des mitochondries vitrifiées.Ensuite, en mode recherche, cherchez des zones présentant une épaisseur de glace et une qualité d'échantillon appropriées. Prenez une image de recherche de six secondes sur des zones prometteuses afin de déterminer leur adéquation pour la collecte de données. Après avoir localisé une zone d'échantillon satisfaisante, inclinez la platine de plus ou moins 60 degrés pour déterminer la plage d'inclinaison maximale disponible sans obstruction de la zone d'exposition ou de mise au point par les barres de la grille ou par des cristaux de glace présents dans un trou voisin rempli de glace et de même apparence, puis passez en mode exposition et ajustez l'intensité du faisceau ou la durée d'acquisition de l'image.Ainsi, chaque image enregistrée reçoit une dose d'électrons comprise entre 30 et 50 électrons par pixel pour les CCD, ou entre six et huit électrons par pixel par seconde. Pour les détecteurs d'électrons directs, calculez le rapport de distribution de la dose, ou I zéro sur I 60, en divisant le nombre moyen d'électrons comptés pour une image d'une seconde acquise à zéro degré par celui d'une image de 60 degrés sur un trou vide. Acquérez une image d'une seconde en mode exposition et notez le nombre d'électrons par angström carré.En tenant compte du rapport de distribution de la dose, calculez le nombre total d'images et l'intervalle de basculement pouvant être enregistrés pour une dose électronique totale spécifique à l'aide d'un logiciel approprié de collecte automatique de données. Configurez et enregistrez une série tomographique (Tom Agram) avec les paramètres précédemment déterminés, typiques des tomos. Pour ces échantillons, commencez à plus ou moins 20 degrés et passez par zéro degré avant d'atteindre les forts angles de basculement.Pour créer et segmenter des tomogrammes, convertir la série de basculement en un format de fichier adapté au logiciel de reconstruction. À l'aide d'un programme de reconstruction Tom Graham tel qu'Im mod, aligner les images en marquant la position des marqueurs fiduciaux en or. Une fois alignées, générer un Tommo Graham.Améliorez le contraste du Tommo Graham en utilisant un filtre d'image tel que le filtre de diffusion anisotrope non linéaire distribué avec IM o à des fins de visualisation. Utilisez des programmes disponibles dans le commerce pour segmenter manuellement le Tom. Attribuez les voxels correspondant aux membranes interne et externe à des couches distinctes ; une fois attribués, créez une surface pour visualiser les membranes.À l'aide de l'option de clic dans le plugin du package EM pour emira, marquer l'emplacement de particules de TP syntase en utilisant les particules marquées comme entrée et un logiciel approprié tel que l'estimation de particules. Pour le programme de tomographie électronique, calculer une moyenne d'agram afin d'estimer la résolution. Calculer la corrélation entre coquilles de foyer entre deux moyennes de sous-tomos déterminées indépendamment à l'aide du programme de visualisation gratuit.Chimera ajuste manuellement puis automatiquement, à l'aide de la commande fit, les structures cristallographiques connues dans la moyenne de sous-tomogrammes Agram, comme illustré sur cette figure. La segmentation manuelle des membranes dans une cryo-microscopie électronique mitochondriale révèle la structure des crêtes dans une mitochondrie. En observant des mitochondries provenant de souches de levure avec des gènes invalidés qui manquent de certaines protéines, l'effet de ces protéines sur la morphologie des crêtes peut être évalué.On observe ici une mitochondrie d'une souche de levure dépourvue de la sous-unité E de la synthèse de l'ATP, qui est nécessaire à la formation de dimères de la synthétase ATP. Contrairement aux crêtes mitochondriales normales des mitochondries de type sauvage, ces organites contiennent plutôt un certain nombre de structures de la membrane interne qui sont soit dépourvues de crêtes, soit présentent de petites invaginations membranaires en forme de ballon. Sur des images présentant un bon contraste, les dimères de la synthétase ATP sont facilement visibles, comme indiqué ici par les flèches jaunes.En segmentant les membranes, l'emplacement de la synthèse d'ATP, désormais représenté par la sphère jaune, peut être visualisé par rapport à la morphologie des crêtes. Dans ce cas, la synthèse d'ATP forme des rangées de dimères le long des bords fortement courbés des crêtes mitochondriales. La moyenne par sous-tomogramme permet de déterminer la structure des protéines à une résolution de quatre nanomètres ou meilleure. En ajustant des structures cristallographiques connues dans la moyenne par sous-tomogramme, des modèles atomiques des complexes protéiques dans leur environnement natif peuvent être assemblés, comme on le voit ici.Dans cet exemple, les volumes moyens peuvent être replacés dans le Tomo Graham afin de faciliter l'organisation des complexes individuels les uns par rapport aux autres et par rapport à d'autres complexes protéiques dans la membrane. Notre protocole montre comment vous pouvez utiliser la tomographie cryo-électronique pour déterminer la structure et l'organisation des complexes protéiques au sein de la membrane interne mitochondriale. Ce protocole peut également être utilisé pour déterminer la structure et l'organisation d'autres protéines membranaires au sein de différents compartiments cellulaires.La préparation de l'échantillon est essentielle pour obtenir de bons thermogrammes. La grille hydratée congelée doit contenir des zones parfaitement vitreuses d'une épaisseur comprise entre 70 et 150 nanomètres. Habituellement, nous examinons cinq à six grilles jusqu'à ce qu'une zone présentant une épaisseur optimale de glace et une qualité satisfaisante de l'échantillon soit trouvée.Pour la collecte des clichés, un microscope électronique en transmission de 300 kilovolts équipé d'un stade cryogénique dédié, d'un filtre énergétique et d'une caméra à détecteur électronique direct est idéal, mais un appareil de 200 kilovolts avec un stade cryogénique à insertion latérale et une caméra CCD peut également être utilisé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'une grille cryo-EM, de la collecte d'une série de basculement, de la reconstruction du tomogramme et du calcul d'une moyenne sub-tomogramme.Il s'agit des compétences de base nécessaires pour étudier comment l'organisation des protéines dans une cellule influence la capacité de cette cellule à accomplir des fonctions biologiques telles que la synthèse efficace d'ATP. N'oubliez pas que le travail avec l'azote liquide et l'éthane liquide peut être très dangereux, et que des lunettes de protection et des gants doivent être portés en tout temps.

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