Visualisation de l'ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

L’objectif général de cette procédure est de déterminer la structure et l’organisation des protéines mitochondriales en C deux. Pour ce faire, il suffit de générer d’abord une grille de microscope électronique hydratée congelée contenant l’échantillon. Ensuite, une série d’inclinaisons à dose limitée de l’échantillon est enregistrée dans un cryomicroscope électronique.

Ensuite, la série d’inclinaison est traitée pour générer un volume tomographique. Enfin, les densités protéiques sont moyennées pour déterminer la structure des protéines et les membranes sont segmentées pour révéler leur structure 3D. En repositionnant les moyennes des protéines dans les Tom Grahams, la structure et l’organisation des protéines dans la membrane sont révélées.

Nous faisons donc de la tomographie à cris électroniques des mitochondries parce que nous voulons comprendre comment elles fonctionnent au niveau moléculaire. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, telles que la microscopie électronique de lames minces en plastique, est que la résolution est plus élevée. Le matériau n’est en aucun cas fixé chimiquement et les détails moléculaires des protéines sont préservés.

La technique de la cristaltographie électronique peut prendre un certain temps à maîtriser, mais les utilisateurs expérimentés peuvent acquérir cinq à six masses TOM de bonne qualité par session. La partie la plus difficile de la procédure consiste à produire des grilles hydratées congelées d’une épaisseur de glace optimale Après avoir isolé et granulé les mitochondries, conformément au protocole de texte, utilisez 250 trioses T millimolaires dans un tampon HEPA de 10 millimolaires pour remettre la pastille en suspension à une concentration d’environ cinq milligrammes par millilitre de décharge totale de lueur protéique. Entièrement en carbone EM grille le carbone vers le haut dans un dispositif à vide selon les instructions du fabricant, liquéfie quelques millilitres d’éthane en dirigeant un flux de gaz éthane sur la face intérieure d’un récipient en aluminium refroidi à l’azote liquide.

À l’aide d’une pince à épiler, prenez une grille de DM à décharge luminescente et placez-la sur la paillasse en mélangeant des protéines, une suspension fiduciale d’or conjuguée, un à un avec la suspension mitochondriale, et appliquez immédiatement trois microlitres de la solution sur la grille. Ensuite, placez la pince à épiler dans un dispositif de vitrification tel qu’une guillotine faite maison avec un coin de papier filtre, épongez l’excès de liquide de la grille et relâchez la gâchette pour plonger immédiatement la grille dans l’éthane liquide. Ensuite, pour transférer la grille de l’éthane liquide à l’azote liquide.

Retirez l’excès d’éthane de la grille en plaçant la pointe d’un coin de papier filtre frais dans l’éthane liquide. Au fur et à mesure que le liquide monte, faites glisser doucement la grille vers le haut du papier filtre, en la maintenant sous le front liquide, puis transférez-la immédiatement dans de l’azote liquide pour la stocker pour une utilisation ultérieure. Placez la grille dans une boîte de grille et stockez-la dans un faiseur rempli d’azote liquide pour enregistrer une série d’inclinaisons tomographiques.

Commencez par vous assurer que les faiseurs d’azote liquide sont pleins et vérifiez que la température de l’étage de l’échantillon et du dispositif de transfert de grille est inférieure à 100 kelvins. Vérifiez que le microscope électronique est bien aligné en acquérant une image d’une grille de test et en vérifiant la qualité des anneaux épineux. Les anneaux doivent être ronds et s’étendre jusqu’au bord de l’image. Ensuite, insérez une grille avec des mitochondries hydratées congelées.

Ensuite, en mode recherche, recherchez les zones d’épaisseur de glace et de qualité d’échantillon appropriées. Prenez une image de recherche de six secondes de zones prometteuses pour déterminer si elles sont appropriées pour la collecte de données. Après avoir localisé une bonne zone d’échantillon, inclinez la platine de plus ou moins 60 degrés pour déterminer la plage d’inclinaison maximale disponible sans obstruction de la zone d’exposition ou de mise au point par des barres de grille ou des cristaux de glace sur un trou rempli de glace à proximité d’apparence similaire, passez en mode d’exposition et ajustez l’intensité du faisceau ou le temps d’acquisition de l’image.

Ainsi, chaque image enregistrée a une dose d’électrons de 30 à 50 électrons par pixel pour les CCD ou de six à huit électrons par pixel et par seconde. Pour les détecteurs d’électrons directs, calculez le rapport de distribution de dose ou I zéro sur I 60 en divisant le nombre moyen d’électrons pour une image d’une seconde acquise à zéro degré par celui d’une image à 60 degrés au-dessus d’un trou vide. Acquérez une image d’une seconde en mode exposition et notez le nombre d’électrons par angström au carré.

En tenant compte du rapport de distribution de la dose, calculez le nombre total d’images et l’intervalle d’inclinaison qui peuvent être enregistrés pour une dose totale d’électrons spécifique à l’aide d’un logiciel de collecte automatique de données approprié. Configurez et enregistrez un Tom Agram avec les paramètres qui viennent d’être déterminés tomos typiques. Pour ces échantillons, commencez à plus ou moins 20 degrés et passez par zéro degré avant d’atteindre des inclinaisons élevées.

Pour créer et segmenter des tomos, convertissez la série d’inclinaison dans un format de fichier adapté au logiciel de reconstruction. À l’aide d’un programme de reconstruction Tom Graham comme Im mod, alignez les images en marquant la position des repères dorés. Une fois aligné, générez un Tommo Graham.

Améliorez le contraste du tommo Graham en utilisant un filtre d’image tel que le filtre de diffusion isotrope non linéaire distribué avec IM o pour la visualisation. Utilisez des programmes disponibles dans le commerce pour segmenter manuellement le Tom. Attribuez des voxels correspondant à la membrane intérieure et extérieure pour séparer les couches une fois assignées, créez une surface pour visualiser les membranes.

À l’aide de l’option clicker dans le plugin du package EM pour emira, marquez l’emplacement d’une particule de synthèse TP en utilisant les particules marquées en entrée et un progiciel approprié tel que l’estimation des particules. Pour le programme de tomographie électronique, calculer une moyenne en agramme pour une estimation de la résolution. Calculez la corrélation de la coque du foyer entre deux moyennes sub tommo déterminées indépendamment à l’aide du programme de visualisation gratuit.

Chimera ajuste les structures de rayons X connues dans la moyenne de Tom Agram d’abord manuellement, puis automatiquement avec la commande ajuster comme le montre cette figure, la segmentation manuelle des membranes dans un cri d’électrons mitochondriaux révèle la structure du Christi dans une mitochondrie. En imageant des mitochondries de souches de levure knock-out dépourvues de certaines protéines. L’effet de ces protéines sur la morphologie de Christi peut être évalué.

On voit ici une mitochondrie d’une souche de levure dépourvue d’une sous-unité E de synthèse de TP, qui est nécessaire à la formation d’un dimère de synthèse de TP. Contrairement au Lala Christi normal des mitochondries de type sauvage, ces organites contiennent plutôt un certain nombre de structures membranaires internes qui sont soit dépourvues de Christi, soit contiennent de petites invaginations membranaires en forme de ballon. Dans les Ingrams avec un bon contraste, les dimères A TP Synthes sont facilement visibles, comme l’indiquent ici les pointes de flèches jaunes.

En segmentant les membranes, l’emplacement de la synthèse A TP maintenant représentée par la sphère jaune peut être visualisé en relation avec la morphologie de Christi. Dans ce cas, la synthèse A TP forme des rangées de dimères le long des bords très incurvés du Lo Meer Christi Sub tommo La moyenne permet de déterminer les structures des protéines à des résolutions de quatre nanomètres ou mieux. En ajustant des structures de rayons X connues dans le sub tomo de Graham, des modèles atomiques moyens de complexes protéiques dans leur environnement natif peuvent être assemblés comme on le voit.

Dans cet exemple, des volumes moyens peuvent être replacés dans le Tomo Graham afin d’aider à l’organisation des complexes individuels les uns par rapport aux autres et à d’autres complexes protéiques dans la membrane. Notre protocole démontre comment vous pouvez utiliser la cryotomographie électronique pour déterminer la structure et l’organisation des complexes protéiques au sein de la membrane mitochondriale interne. Ce protocole peut également être utilisé pour déterminer la structure et l’organisation d’autres protéines liées à la membrane au sein de différents compartiments cellulaires.

La préparation des échantillons est la clé pour obtenir de bons thermogrammes. La grille hydratée congelée doit contenir des yeux parfaitement vitrés de 70 à 150 nanomètres d’épaisseur. Normalement, nous criblons cinq à six grilles jusqu’à ce que vous trouviez une zone d’épaisseur de glace et de qualité d’échantillon optimales.

Pour la collecte de grammes, un microscope électronique à transmission de 300 kilovolts avec un étage cryogénique dédié et un filtre d’énergie et une caméra avec détecteur d’électrons direct est préférable, mais un instrument de 200 kilovolts avec un étage cryogénique à entrée latérale et une caméra CCD peut également être utilisé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’une grille pleurer m. Collectez une série d’inclinaisons, reconstruisez le thermogramme et calculez une moyenne inférieure au tommo.

Il s’agit des compétences de base requises pour étudier comment l’organisation des protéines dans une cellule affecte la capacité de cette cellule à remplir des fonctions biologiques telles que la synthèse efficace de A TP. N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide et de l’Ethan liquide peut être très dangereux et que des lunettes de sécurité et des gants doivent être portés en tout temps.