Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

L’objectif global de cette procédure est d’aider les utilisateurs à établir un pipeline de collecte et de traitement à haut débit de la cryotomographie électronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cryo-tomorgraphie électronique, telles que : comment traiter les données collectées avec des détecteurs de nouvelle génération et traiter une énorme quantité de données produites par un logiciel de collecte automatisé en série d’inclinaisons ? Le principal avantage de cette technique est que l’utilisateur peut configurer plusieurs progiciels de manière unifiée, afin de trouver un pipeline efficace pour le traitement automatisé des séries d’inclinaisons, ce qui permet de consacrer plus de temps à l’analyse des tomogrammes.

En général, les personnes qui découvrent la cryo-ET auront du mal car de nombreuses étapes fastidieuses sont nécessaires pour traiter des données massives générées par le microscope électronique. Nous avons eu l’idée de ce développement il y a cinq ans, lorsque nous avons dû passer manuellement par des centaines d’étapes pour obtenir une reconstruction 3D d’une bactérie. À l’avance, consultez le protocole de texte sur la préparation des minicellules Shigella flexneri.

Ensuite, préparez les grilles de microscopie électronique comme expliqué par une publication JoVE existante et également documenté dans le protocole texte. Après avoir chargé l’étage EM avec la collection de minicellules incrustées dans de la glace vitrifiée, commencez à collecter des cartes à faible grossissement pour la série d’inclinaison. Tout en regardant l’écran fluorescent à faible grossissement, d’environ 2300x, trouvez des carrés de grille acceptables pour l’image.

Cet endroit doit contenir de la glace mince et le sujet d’intérêt sans contaminants. Ensuite, ajustez la vue au centre du carré de la grille et cliquez sur le bouton Ajouter une position de scène pour enregistrer l’emplacement. Ensuite, répétez le processus jusqu’à ce que tous les carrés de la grille acceptables aient été enregistrés.

L’étape suivante commence par l’ouverture d’un nouveau fichier de montage. Dans la boîte de dialogue de configuration, définissez le X et le Y de sorte que l’intégralité du carré de la grille soit capturée. Pour une grille standard de 200 mailles, créez un espace de 10 par 10 avec une valeur de Binning élevée, comme huit.

Basculez également l’option de déplacement de l’étape au lieu du déplacement de l’image et l’option de saut des corrélations utilisées pour aligner les pièces. Maintenant, dans la fenêtre du navigateur, sélectionnez la première position d’étape à acquérir à l’aide de la bascule Acquérir. Continuez à faire cela pour chaque position de scène.

Ensuite, dans le menu Navigateur, cliquez sur Acquérir aux points. Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, activez les options d’acquisition de l’image de la carte et de l’eucentricité approximative. Décochez toutes les autres options.

Ensuite, cliquez sur continuer, et un montage sera réalisé pour chaque position de scène. Continuez à travailler avec le logiciel SerialEM. Dans le navigateur, sélectionnez les cartes acquises et cliquez sur Charger la carte.

Ensuite, cliquez sur Ajouter des points et sélectionnez les points sur la carte où la série d’inclinaison doit être acquise. Après avoir effectué les sélections, cliquez sur Arrêter l’ajout de points et répétez le processus avec chaque carte collectée. Ensuite, ouvrez les paramètres sous le menu Appareil photo et définissez les modes Focus, Trial et Record.

L’option d’enregistrement des données fractionnées en fonction de la dose peut être d’un intérêt particulier, et cela peut être spécifié dans les options d’enregistrement. Pour continuer, sélectionnez l’un des points de la carte actuellement affichée et basculez l’option d’inclinaison de la série dans la fenêtre du navigateur. Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, choisissez les paramètres de la série d’inclinaison.

Ensuite, répétez le processus d’activation de l’option tilt-series pour chacun des points sélectionnés sur la carte. Ensuite, à partir du navigateur, démarrez l’option Acquérir à des points. Dans la boîte de dialogue, basculez les options Tâches préliminaires, Réaligner sur l’élément, Mise au point automatique et Eucentricité approximative.

Ensuite, définissez la tâche principale pour acquérir des séries d’inclinaison et choisissez fermer les vals de colonne à la fin pour fermer la colonne lorsque tous les points ont été collectés. Lorsque le processus est exécuté, une série d’inclinaison sera collectée à chaque point basculé pour la collecte des séries d’inclinaison dans chaque carte. Avec la série d’inclinaison d’origine, le journal de sortie de SerialEM et les images individuelles fractionnées en dose toutes dans le répertoire de travail actuel, dans un terminal, exécutez la commande suivante pour supprimer l’artefact de mouvement induit par le faisceau.

Procédez à l’alignement et à la reconstruction de la série d’inclinaisons. Tapez la commande tomoauto dans le terminal comme suit. À la commande, ajoutez le nom de fichier de la série d’inclinaison à traiter, suivi du diamètre repère en nanomètres.

Si le traitement CTF n’est pas souhaité, omettez simplement l’option de la commande. Cette commande est l’utilisation principale de tomoauto, permettant aux utilisateurs d’exécuter tous les processus impliqués dans l’alignement d’une série d’inclinaisons, qui nécessitaient à l’origine une intervention manuelle de l’utilisateur, en une seule commande, permettant aux utilisateurs de scripter rapidement le traitement par lots. Maintenant, à l’aide de la commande 3dmod, examinez la série d’inclinaison alignée pour détecter toute erreur flagrante.

Ici, filename est le nom de la série tilt sans suffixe. Ensuite, inspectez le CTF estimé avec la commande indiquée ici. Encore une fois, filename est le nom de la série tilt sans suffixe.

De plus, dans le journal de sortie produit par la commande tomoauto, vérifiez l’erreur résiduelle de l’alignement. Il s’agit d’une mesure quantitative de la qualité globale de l’alignement. Si l’alignement est acceptable, procédez au calcul de la reconstruction.

Cette commande est configurée pour corriger le CTF et effacer les repères utilisés dans l’alignement de la série d’inclinaison. Pour ignorer l’inspection visuelle et passer directement à la reconstruction, utilisez cette commande. Tomoauto propose de nombreuses options accessibles.

L’une d’entre elles en particulier est la possibilité d’inclure des configurations locales décrites par un fichier auxiliaire, selon la documentation de tomoauto. Incluez le nom de ce fichier dans la boîte de dialogue de ligne de commande à l’aide de l’option de configuration locale avant d’ajouter le nom de fichier tilt-series. La possibilité de créer des fichiers de configuration locaux est la fonctionnalité la plus puissante de tomoauto, permettant aux utilisateurs de configurer entièrement chaque commande utilisée, en ajustant l’exécution à des ensembles de données spécifiques ou difficiles tout en maintenant le traitement automatisé.

Le protocole de test contient des instructions supplémentaires sur la façon d’exécuter le calcul de la moyenne des sous-tomogrammes. Selon les protocoles décrits, deux séries d’inclinaison alignées ont été réalisées avec tomoauto. L’alignement fin est calculé à partir d’un modèle qui définit idéalement les coordonnées des repères.

À 50 degrés, une série d’inclinaisons a suivi correctement les particules d’or, indiquant un alignement acceptable. Alors que, dans le cas de la deuxième série d’inclinaisons, plusieurs points du modèle, représentés en rouge, s’écartaient de leur marqueur doré correspondant, l’illustration du modèle n’a pas produit un alignement approprié. Lorsque les séries d’inclinaison sont collectées, tomoauto aligne avec succès 80 à 90 % des séries d’inclinaison collectées.

Après reconstruction, le tomogramme final est un volume 3D de l’échantillon d’image. Cela peut ensuite être utilisé pour l’annotation cellulaire par segmentation, ou la moyenne d’un sous-tomogramme pour obtenir des informations à plus haute résolution sur la machinerie moléculaire dans l’échantillon. La moyenne sous-tomographique de 2,7 nanomètres de la Shigella flexneri attachée déposée dans l’EMDB montre la grande amélioration de cette technique par rapport à l’observation de l’injectisome dans un seul tomogramme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter et de traiter les données de cryo-tomographie électronique à l’aide de SerialEM et de tomoauto de manière automatisée et à haut débit. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour collecter près de 100 séries d’inclinaison en une journée, si elle est effectuée correctement, et aligner une série d’inclinaisons en 20 minutes. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de toujours vérifier la qualité de l’alignement de la série d’inclinaison.

Si un ensemble de séries d’inclinaison ne s’aligne pas correctement, essayez de l’aligner manuellement et transférez les paramètres dans une configuration locale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la moyenne sous tomogramme peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la détermination de la structure à haute résolution des complexes macromoléculaires. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cryo-EM pour explorer des structures in situ à haute résolution chez les bactéries, les virus et d’autres organismes.