Name: Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez la visualisation des protéines membranaires extrinsèques par microscopie électronique à transmission à coloration négative. Cette méthode utilise des nanodiscs pour étudier les interactions protéine-membrane et faciliter le développement de médicaments.

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Les auteurs remercient le Conseil suédois de la recherche, Conseil du comté de Stockholm, et les fonds KI pour leur soutien. L&#39;expression et la purification de MSP a été réalisée au Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science de base Facility (http://PSF.ki.se). Les auteurs tiennent également à remercier le Dr Pasi Purhonen et le Dr Sjöberg Mathilda pour partager leur expertise technique et leur aide en temps opportun.

1. Préparation de Nanodiscs <ol><li> Expression et purification de la protéine d&#39;échafaudage membranaire 8, 35 <ol><li> Exprimer le MSP1E3D1 His-tagged dans le E. coli BL21 (DE3) souche T1R pRARE2 dans des flacons. Préparer une culture de départ pendant la nuit de 50 ml avec un milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine à 37 ° C. Diluer la culture starter pendant une nuit dans 2 litres de milieu de bouillon super supplémenté avec 50 pg / ml de kanamycine. </li><li> Faire croître les cellules à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm (DO 600) atteint environ 3. induire l&#39;expression de la protéine avec 0,5 mM de β-D-thiogalactopyranoside d&#39; isopropyle 1-(IPTG) pendant 3 h à 18 ° C. </li><li> Préparer le tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol). Ajouter 1 mM PTCE immédiatement avant utilisation. </li><li> Après 3 h d&#39;induction à 18 ° C, de récolter les cellules par centrifugation pendant 10 min à 4500 x get 4 ° C. Jeter le surnageant, on pèse les cellules récoltées, et les remettre en suspension dans un tampon de lyse à un rapport de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules. </li><li> Lyse des cellules par sonication pulsée (taux de répétition: 4 de l&#39;ON, 4 s OFF) pendant 3 min à 80% d&#39;amplitude. </li><li> Centrifuger les lysats pendant 20 min à 49000 xg et 4 ° C. Jeter le culot de cette centrifugation. </li><li> Injecter le surnageant dans un 5 mL Ni + colonne chélatant connecté à un système de chromatographie en phase liquide automatisée de préférence maintenue à 4 ° C. </li><li> Avant l&#39;étape d&#39;élution (étape 1.1.9), laver la colonne avec des tampons 1 - 3 ci-dessous pour éliminer toutes les protéines à l&#39;exception du marquage His MSP. Surveiller la teneur en protéines à 280 nm pour suivre le processus de purification; l&#39;enregistrement UV à 280 nm devrait revenir à la ligne de base après chaque lavage. <ol><li> Laver avec un tampon de lavage 1: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 mM d&#39;imidazole, et 1% de Triton, pH 8,0. </li><li> Laver avec un tampon de lavage 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMDe NaCl, 20 mM imidazole, et le cholate de sodium 50 mM, pH 8,0. </li><li> Laver avec un tampon de lavage 3: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 50 mM d&#39;imidazole, pH 8,0. </li></ol></li><li> Éluer le MSP avec 40 mM Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 500 mM d&#39;imidazole, pH 8,0. </li><li> Changer le tampon MSP tampon standard (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl et 0,5 mM d&#39; EDTA) par filtration sur gel , 8, 35; le rendement par lot devrait être d&#39; environ 7 mg L -1. </li></ol></li><li> Préparation de la solution mère de phospholipides <ol><li> Ajouter 305 pi de 1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine (POPC) dissous dans du chloroforme à une concentration de 25 mg / mL dans un bêcher en verre et on évapore le chloroforme en le purgeant avec un courant doux d&#39;azote . Sécher pendant toute une nuit lipidique dans un dessicateur sous vide. Remarque: Cette étape est réalisée pour éliminer le solvant à partir du lipide, ce qui laisse un film mince de lipide au fond du bêcher en verre.</li><li> Remettre en suspension le gâteau de lipides dans 200 ul de tampon standard contenant MSP cholate de sodium 100 mM, vortexer le tube jusqu&#39;à ce que la solution devienne transparente; ceci fournira une solution avec une concentration de 50 mM POPC. NOTE: En général, le rapport molaire de lipide au détergent à ce point doit être de 1: 2 (lipides: détergent) 8. Ce mélange lipide-détergent peut être stocké à -80 ° C pendant environ 2 mois. </li></ol></li><li> Préparation de billes hydrophobes pour l&#39;élimination du détergent <ol><li> Placer 5 g de billes (poids sec) dans un tube de 50 ml. </li><li> Laver les billes avec 30 ml de methanol à 100%, puis avec 40 ml d&#39;eau ultrapure. </li><li> Laver les billes avec un tampon standard de 10 ml de MSP. Enfin, stocker les perles avec 15 ml de tampon standard MSP à 4 ° C. </li></ol></li><li> Nanodisc reconstitution <ol><li> Distribuer 190 ul de MSP1E3D1 (0,124 mM) dans un tube à centrifuger et ajouter 61,5 pi de solution mère de phospholipides (50 mM POPC) dans le même tube. Incuber le mélange de reconstitution sur de la glace pendant 1 h. NOTE: Ce qui correspond à un rapport molaire de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> Ajouter des billes hydrophobes à une concentration de 0,5 g de billes par ml de mélange de reconstitution pour lancer le processus d&#39;auto-assemblage. Incuber dans un incubateur rotatif pendant 16 heures à 4 ° C. </li><li> Après incubation, on centrifuge pendant 10 min à 13 000 x g et 4 ° C pour éliminer les précipités et les agrégats. Jeter le culot et enregistrez le surnageant. </li><li> Equilibrer la colonne de chromatographie d&#39;exclusion stérique (monté sur un système de chromatographie en phase liquide automatisée) avec un tampon de type MSP jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance à 280 nm est stable. Injecter le liquide surnageant dans la colonne et recueillir les fractions de pic. </li><li> Mesurer les concentrations de nanodiscs dans les fractions de pic à 280 nm. En utilisant le coefficient d&#39;extinction molaire de MSP1E3D1 (e = 29910 M -1 cm -1) pour le calcul de la concentration en nanodisc. Noter lanombre de lipides par nanodisc peut être mesurée par une combinaison de lipides radiomarqués et l&#39; analyse des phosphates 4 ou par analyse du phosphate seul. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la protéine monotopiques 5-lipoxygénase 35 <ol><li> Préparer une culture de départ pendant la nuit. Supplément de 50 ml de milieu LB avec 100 ug / ml d&#39;ampicilline. Inoculer le milieu avec de E. coli BL21 (DE3) contenant le plasmide du gène de la 5-lipoxygénase (ALOX5). Diluer la culture starter pendant une nuit dans du milieu d&#39;expression contenant 42 mM de Na 2 HPO 4 mM KH 2 PO 4, 9 mM de NaCl, 19 mM de NH 4 Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% de D-glucose 24 0,1 %, 5 uM de FeSO 4 et 100 pg / ml d&#39; ampicilline. Cultiver les cellules jusqu&#39;à ce que la DO 600 est ~ 0,5 à 25 ° C. Induire l&#39; expression de protéines avec 0,2 mM d&#39; IPTG pendant 16 heures à 20 ° C 35. </li><li> Récolte par centrifugation pendant 10 min à 7000 xg et 4 ° C et jeter le surnageant. Peser le culot trouve au fond du tube contenant les cellules récoltées et remettre en suspension des cellules récoltées dans un tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10% de glycerol et 1 mM de TCEP) contenant un inhibiteur de protéase et 0,5 mg / ml 35 de lysozyme à raison de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules. </li><li> Lyse des cellules par sonication pendant 5 x 15 s à 80% d&#39;amplitude. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 7000 x g et 4 ° C. Effectuer une précipitation au sulfate d&#39; ammonium à 30-60% de saturation pour précipiter les protéines dans la solution 35. Centrifugeuse pendant 15 min à 16 000 xg et 4 ° C. REMARQUE: La pastille 5LO peut être rapidement congelée et stockée à -80 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 20 ml de tampon de lyse et on centrifuge pendant 15 min à 40 000 x g et 4 ° C. </li><li> Incuber le surnageant sur<html> une colonne d&#39;agarose ATP à 4 ° C pendant 30 min. Laver la colonne une fois avec une colonne volume de tampon de lyse contenant 0,5 M de NaCl. Éluer le 5LO avec 20 mM d&#39; ATP dans un tampon de lyse contenant 10 uM de FeSO 4 et 20 pg / ml de catalase. Effectuer une Chromatographie par filtration sur gel pour éliminer l&#39;ATP 35. NOTE: Le 5LO est instable et doit être utilisé immédiatement après purification. Dans le cas contraire, il est recommandé de mettre fin à l&#39;étape de précipitation du sulfate d&#39;ammonium (voir la note après l&#39;étape 2.1.3). </li></ol> 3. Préparation du complexe protéine-Nanodisc <ol><li> Préparer un volume total de 100 ul de complexe. Mélanger 0,8 pM ND et 0,8 pM 5LO avec le présent du mM de Ca 1 dans le tampon standard MSP (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM et 1,5 mM de CaCl2) et incuber pendant 10 min sur la glace. NOTE: L&#39;échantillon peut être stocké pendant jusqu&#39;à un mois à 4 ° C 35. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. L&#39;analyse des échantillons <ol><li> L&#39;électrophorèse sur gel <ol><li> électrophorèse non dénaturante <ol><li> Mélanger 15 ul de l&#39;échantillon avec 5 pi de tampon de charge (mM BisTris 50, 6 N HCl, 50 mM de NaCl, 10% (p / v) de glycerol et 0,001% de Ponceau S, pH 7,2) 49 et le charger sur un 4 - 16% de gel Bis-Tris pour effectuer l&#39;électrophorèse. </li><li> Remplir le réservoir de cathode avec un tampon lumière de cathode (50 bis mM de Tris; mM Tricine 50, pH 6,8 et 0,002% de Coomassie G-250) et le réservoir d&#39;anode avec un tampon (50 mM de Bis Tris mM Tricine 50, pH 6,8) en cours d&#39;exécution. Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V. </li><li> Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front arrive à la fin de Coomassie du gel. </li><li> Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie. </li></ol></li><li> électrophorèse dénaturant <ol><li> Mélanger 40 ul de l&#39;échantillon avec 10 pl de tampon de charge contenant du SDS (0,05% (p / v) de bleu de bromophénol, 0,2 M de Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) de glycerol; 10% (p / v) de SDS; et 10 mM de 2-mercaptoéthanol) et le charger sur une 4 - gel à 20% de Tris glycine pour effectuer une électrophorèse. </li><li> Remplir les réservoirs d&#39;anode et de cathode avec un tampon de roulement (25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de glycine et 0,1% (p / v) de SDS). Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V. </li><li> Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front de chargement du colorant arrive à la fin du gel. </li><li> Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de la solution NaPT <ol><li> Dissoudre 1 g de sel phosphotungstate de sodium dans 50 ml d&#39;eau par agitation à la température ambiante pour donner une 2% (p / v) de solution acide. </li><li> Ajuster le pH à 7,4 avec 1 M de NaOH. Enlever les particules en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Conserver la solution à la température ambiante ou à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;échantillon pour l&#39;analyse TEM <ol><li> Glow-décharge des grilles de cuivre revêtues de carbone (400 mesh) pendant 20 s à 30 mA pour rendre hydrophiles les grilles avant l&#39;adsorption de l&#39;échantillon. Placer 3,5 ul de l&#39;échantillon (0,8 uM par rapport aux nanodiscs) sur la grille et laisser incuber pendant 30 s. NOTE: Le volume appliqué peut varier entre 2,5 et 5 pl, en fonction de la concentration de l&#39;échantillon. Une gamme de concentration appropriée pour nanodiscs est de 0,5 - 1 uM. </li><li> Éponger solution excédentaire en utilisant du papier filtre. </li><li> Immédiatement tacher la grille avec une baisse de 2% NaPT pendant 30 s. Éponger l&#39;excès de solution et de laisser la grille sécher à l&#39;air. </li><li> Évaluer les grilles par TEM. Un microscope à 120-200 keV tension d&#39;accélération suffit d&#39;estimer l&#39;ampleur de l&#39;empilement. NOTE: Pour le présent protocole, un microscope électronique à transmission calibré a été utilisé, équipé d&#39;une émission de champ canon de 200 keV. </li><li> Enregistrez les images TEM. Pour les images montrant de longues piles, ne traite pas plus loin; images montrent le complexe de nanodiscs, avec une protéine extrinsèque qui peut contenir quelquesshort stacks, mais la plupart des particules sont dans le complexe. Enregistrer plusieurs images et processus ces selon les méthodes standard pour obtenir la classe-moyenne et basse résolution, 3 modèle tridimensionnel du complexe. NOTE: Pour la collecte de données négatives-taches, les grilles ont été faites sur au moins trois jours différents. Pour chaque jour, incubations des échantillons frais (comme dans l&#39;étape 3.1) ont été faites avant que la tache négative a été appliquée. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode peut être séparée en trois parties: la reconstitution de nanodiscs vides, la préparation de complexes protéine-nanodisc, et la coloration négative pour le TEM de ces complexes. Chaque partie sera traitée séparément en ce qui concerne les limites de la technique, des étapes critiques, et des modifications utiles. Reconstitution des nanodiscs vides. étapes et les limites critiques dans la production et l&#39;utilisation de nanodiscs. Pour la préparation des...

Dans la recherche médicale, une grande attention est focalisée sur des protéines membranaires, soit intrinsèques ou extrinsèques, impliqués dans une variété d&#39;interactions lipidiques. En travaillant avec des protéines interagissant lipides comprend soit la sélection d&#39; un substitut aux lipides, tels que les détergents, amphipols 1 ou 2 petites protéines ou de trouver un substitut à membrane qui maintient la protéine soluble et active. Substituts de la membrane lipoïque comprennent des liposomes et nanodiscs (ND) 3, 4. Nanodiscs sont des plates-formes de membranes quasi-native développée par ingénierie de la partie protéique, ApoA-1, de la lipoprotéine de haute densité (HDL) dans le sang d&#39;origine naturelle. ApoA-1 est un résidu 243-longue chaîne de courtes hélices a amphipathiques et présente une conformation soluble délipidé. In vitro lorsqu&#39;ils sont en présence de lipides, de deux copies de la protéine d&#39; ApoA-1 réarranger spontanément à entourer le hydrpartie de la chaîne acyle ophobic d&#39;un bicouche lipidique correctif 5. versions d&#39;ingénierie de ApoA-1 sont généralement appelés échafaudages de protéines membranaires (MSP), et un nombre croissant sont disponibles dans le commerce sous forme de plasmides ou des protéines purifiées. Répétitions ou suppressions des hélices dans ApoA-1 résultat à plus ou moins 6 protéines d&#39;échafaudage 7 membranaires. Ceci à son tour permet de former des disques d&#39; environ 6 nm à 17 nm à 7 8 de diamètre. Il existe différents types d&#39;applications pour le nanodiscs 3, 9. L&#39;application la plus couramment utilisée est de fournir un environnement membranaire quasi-native pour la stabilisation d&#39;une protéine membranaire intégrale 8, examiné précédemment 3, 9. Une utilisation moins explorée est de fournir une surface de la membrane à l&#39;échelle nanométrique pour l&#39;étude demembrane périphérique des protéines 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. L&#39;article 1 du protocole ci-dessous permet de visualiser la procédure de prise de nanodiscs composé de phospholipides et de protéines d&#39;échafaudage de la membrane. La préparation des échantillons est un goulot d&#39;étranglement dans la plupart des méthodes. échantillons spécifiques Méthode peuvent ajouter des informations particulières, mais ils font également la comparaison des résultats difficile. Par conséquent, il est plus simple lorsque les échantillons sont multimodaux et peuvent être utilisés directement dans plusieurs méthodes différentes. Un avantage à l&#39;utilisation de nanodiscs est la petite taille de l&#39;nanodisc par rapport aux liposomes (par exemple, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les TEM et électrophorèse sur gel non dénaturant, comme dans le présent protocole). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; vésicules et des liposomes sont utilisés depuis longtemps pour comprendre la fonction des protéines de la membrane en interaction. Pour des études structurales et de visualisation, un exemple de la détermination de la structure d&#39;une protéine transmembranaire dans des liposomes 18 est disponible. Cependant, aucune structure 3D à haute résolution d&#39;une protéine de membrane monotopique embarqué sur une membrane de liposome a été encore publié, pour autant que nous le savons. Des nanoparticules d&#39; or ou d&#39; anticorps peuvent être utilisés pour visualiser les protéines de liaison à des liposomes ou des vésicules en utilisant TEM 19. Même si ces sondes sont très spécifiques, ils pourraient interférer avec les protéines membranaires de liaison en voilant le site de liaison de la membrane ou en masquant les zones d&#39;intérêt avec les parties flexibles. Or marqué ou des protéines d&#39;anticorps complexée pourrait probablement être analysé sur un gel, mais cela augmenterait le coût de l&#39;expérience. Bien que les liposomes sont une excellente plate-forme, on ne peut être certain que la population a un rapport particulier de protéines par liposome, une caractéristique qui peut être explorée par l&#39;utilisation de nanodiscs 20. Dans un liposome, des cofacteurs et des substrats peuvent être piégés à l&#39;intérieur soluble. Les substances qui sont solubles dans la membrane se partageront le même sort pour les deux types de mimétiques membranaires. Cependant, comme la zone à deux couches est inférieure à nanodiscs, une petite quantité de substance nécessaire pour saturer les membranes nanodisc. Comprendre la fonction des protéines grâce à la détermination de la structure atomique a été essentielle pour de nombreux domaines de la recherche. Méthodes de détermination de la structure des protéines comprennent des rayons X 21; résonance magnétique nucléaire (RMN) , 22, 23; et par microscopie électronique à transmission (MET) 24 à des températures cryogéniques, cryoEM. La résolution par cryoEM a récemment été grandement améliorée, principalement en raison de l&#39;utilisation d&#39;électrons de directetecteurs 25, 26. Les macromolécules sont imagés dans mince, glace vitreuse 27 dans un état quasi-native. Toutefois, en raison du faible contraste entre les molécules biologiques, elles deviennent difficiles à détecter dans la gamme de tailles de 100-200 kDa. Pour les échantillons de taille appropriée, la collecte des données peut être effectuée et le procédé de reconstruction de la particule peut être appliquée pour obtenir une structure 28. Cependant, la détermination de la structure protéique par MET est un processus en plusieurs étapes. Elle débute généralement par l&#39;évaluation de l&#39; échantillon monodispersité par coloration négative TEM 29 en utilisant des sels de métaux lourds comme phosphotungsten (PT) 30 ou de l&#39; uranium 31. Reconstruction d&#39;un modèle à faible résolution de la macromolécule colorées négativement est généralement faite et peut fournir des informations importantes sur la structure moléculaire 29. En parallèle,la collecte de données en utilisant cryoEM peut commencer. Des précautions doivent être prises lors de l&#39;évaluation des données TEM coloration négative pour éviter la mauvaise interprétation de la formation artefact. Un artefact particulier est l&#39;effet de la tache de PT sur des phospholipides et des liposomes 32, ce qui entraîne la formation de longues tiges ressemblant à des piles de pièces de monnaie vues du côté 33. Un tel &quot;rouleau&quot; ou &quot;piles&quot; (ci - après désigné par &quot;piles&quot;) ont été observées au début de HDL 34, et plus tard aussi pour nanodiscs 35. L&#39;empilement et un remodelage des membranes peuvent se produire pour de nombreuses raisons. Par exemple, elle peut être induite par des co-facteurs tels que le cuivre, montré par imagerie MET dans un molybdate d&#39; ammonium 36 tache. Une fraction des lipides de la membrane dans des liposomes contient un groupe de tête iminodiacétique mimant complexation des métaux par l&#39;EDTA, l&#39;empilement ainsi des liposomes après l&#39;addition d&#39;ions cuivre <sup class = &quot;xref&quot;&gt; 36. Gerbage peut aussi être due à une interaction protéine-protéine d&#39;une protéine dans ou sur les bicouches lipidiques (le colorant utilisé est non mentionné) 37. La formation de la pile de phospholipides par PT a été observée dès le début; Cependant, le travail plus tard , a mis l&#39; accent sur la suppression ou la suppression de cette formation d&#39;artefact 38. Ici, nous proposons une méthode pour tirer parti de la nanodisc NaPT induite par empilement pour l&#39;étude des protéines membranaires de liaison par MET. En bref, la liaison sur les protéines nanodiscs empêcherait les nanodiscs d&#39;empilement. Bien que les raisons de l&#39;empilement ne sont pas claires, il a été proposé 39 qu&#39;il y ait une interaction électrostatique entre les phospholipides et le groupe phosphoryle du PT, ce qui provoque les disques à coller à l&#39;autre (figure 1A). L&#39;hypothèse derrière notre protocole est que, quand une protéine se lie à une nanodisc, la majeure partie de la surface phospholipide est non disponi<html> ble pour l&#39;interaction avec le terminal en raison de l&#39;encombrement stérique de la protéine. Cela permettrait d&#39; éviter la formation pile (figure 1B). Deux conclusions peuvent être tirées. En premier lieu, la prévention de l&#39;empilement signifie que la protéine d&#39;intérêt est liée à la membrane. En second lieu , le complexe protéine-ND peut être traitée par des procédés classiques de traitement unique de particules 24, 40 pour obtenir une morphologie grossière du complexe. En outre, des analyses par des méthodes telles que la non-dénaturant électrophorèse sur gel ou la diffusion dynamique de la lumière peut être réalisée. Pour démontrer cette hypothèse, nous avons utilisé la protéine de liaison à la membrane 5-lipoxygénase (5LO), qui est impliqué dans de nombreuses maladies inflammatoires 41, 42. Cette protéine de 78 kDa nécessite des ions calcium à se lier à la membrane 43. Bien que cette association de la membrane a été largement étudiée en utilisant des liposomess = &quot;référence externe&quot;&gt; 44, 45, 46 et des fractions de membrane 47, ceux - ci ne peuvent pas être utilisées pour une analyse TEM et la détermination de la structure. La préparation de nanodiscs commence par le mélange MSP avec des lipides remis en suspension dans le cholate détergent de sodium. Après incubation sur de la glace pendant 1 h, le détergent est lentement éliminé du mélange de reconstitution à l&#39;aide d&#39;une résine adsorbante. Ce type de matériel est souvent faite de forme en petites billes de polystyrène. Ils sont relativement hydrophobes et ont une forte préférence pour un détergent de liaison par rapport aux lipides 48. Après avoir retiré les billes hydrophobes et effectuer une clarification par centrifugation, les nanodiscs sont purifiés par chromatographie d&#39;exclusion stérique (SEC). Les nanodiscs purifiés sont mélangés avec une protéine de membrane monotopique (et cofacteurs possibles) dans un rapport équimolaire (ou plusieurs rapports pour un titrage) et on laisse rEACT (15 min). L&#39;analyse par TEM est effectuée en appliquant ul-quantités d&#39;échantillon sur, grilles revêtues de carbone lueur déchargée puis en effectuant une coloration négative avec NaPT. Le même échantillon à partir de laquelle les aliquotes ont été appliqués aux grilles de MET peut être utilisé pour l&#39;analyse des non-dénaturant ou une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, ainsi que par divers types de mesures d&#39;activité, sans changements majeurs.

<table><tbody><tr><td>Microscope électronique à transmission : JEOL2100F</td> caméra CCD <td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Déchargeur luminescent</td><td>Grille TEM Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographie d’exclusion stérique : Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide : MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bactérie : BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bactéries : BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice de purification : ATP agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Matrice de purification : HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipide : POPC</td><td>Avanti lipides polaires</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL en chloroforme</td></tr><tr><td>Perles hydrophobes : Bio-Beads, SM-2 Résine</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Filtre seringue : 0,2 &mu ; m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Colorant : Phosphotungstate de sodium tribasique hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Détergent : Cholate de sodium hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cholate de sodium</td> 500 mM Cholate <td></td><td></td><td>de sodium. Remettre en suspension dans l’eau miliQ et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Stock</td><td></td><td></td> lipidique <td>50 mM POPC, 100 mM cholate de sodium, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. <bt />Conserver à 4 &deg ; C pour une semaine ; ou Magasin -80 &deg ; C pendant un mois, après avoir purgé la solution avec de l’azote.</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>standard MSP</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Conserver à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Tampon d’anode d’électrophorèse non dénaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampon cathodique d’électrophorèse non dénaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002 % Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Tampon de chargement d’échantillon 4x Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM de Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM de NaCl, 10 % (p/v) de glycérol, 0,001 % de tampon</td></tr><tr><td>de fonctionnement</td><td></td><td></td> d’électrophorèse dénaturante Ponceau <td>S Recette maison : 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de glycine, 0,1 % (p/v) SDS</td></tr><tr><td>Dénaturation Électrophorèse 5x Tampon de chargement</td><td></td><td></td><td>d’échantillon Recette interne : 0,05 % (p/v) de bromophénolbleu, 0,2 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20 % (v/v) de glycérol, 10 % (p/v) FDS, 10 mM de 2-mercaptoéthanol</td></tr><tr><td>Bouillon formidable</td><td></td><td></td><td>Tryptone - 12,0 g, Extrait de levure - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 et 0,72 M K2HPO4, Glycérol - 4 mL. Tryptone, extrait de levure et glycérol ont été préparés à 900 mL et autoclavés séparément. KH2PO4 et K2HPO4 ont été préparés et autoclavés séparément. Les deux ont été mélangés avant d’utiliser le support.</td></tr></tbody></table>

méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Les protéines monotopiques exercent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à la surface d’une membrane, et ces interactions dépendent de la composition lipidique spécifique et de la disponibilité d’une surface suffisante pour remplir la fonction. Les nanodisques sont utilisés pour fournir une surface membranaire de taille et de teneur en lipides contrôlées. En l’absence de protéines extrinsèques liées, les nanodisques colorés au phosphotungstate de sodium apparaissent comme des piles de pièces de monnaie lorsqu’ils sont vus de côté par microscopie électronique à transmission (MET). Ce protocole est donc conçu pour favoriser intentionnellement l’empilement ; Par conséquent, la prévention de l’empilement peut être interprétée comme la liaison de la protéine de liaison membranaire au nanodisque. Dans une étape ultérieure, les images TEM des complexes protéine-nanodisque peuvent être traitées avec des méthodes standard à particule unique pour produire des structures à faible résolution comme base pour des travaux cryoEM à plus haute résolution. De plus, les nanodisques fournissent des échantillons adaptés à la MET ou à l’électrophorèse sur gel non dénaturant. Pour illustrer la méthode, la liaison de la 5-lipoxygénase induite par Ca2+ sur des nanodisques est présentée.

La méthode que nous proposons dépend de la préparation de nanodiscs pour fournir la surface de la membrane pour la liaison protéine-membrane monotopique. Comme il n&#39;y a pas de protéine transmembranaire incorporé dans la bicouche nanodisc lipidique, les nanodiscs sont ici désignés comme «nanodiscs vides» (figure 2A). Ceux - ci ont un poids moléculaire calculé de 256 kDa , pour une composition de deux protéines d&#39;échafaudage et MSP1E3D1 environ 260 molécules de POP...

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la fixation d'une protéine membranaire extrinsèque sur une surface membranaire de nanodisque par microscopie électronique en transmission avec coloration négative, dans un premier temps en vue de la détermination de la structure de haute résolution de la protéine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans plusieurs domaines de recherche, car elle concerne les activités protéiques qui se produisent dans les membranes cellulaires et à leur surface. Le principal avantage de cette technique réside dans les empilements caractéristiques de nanodisques qui se forment lorsque la protéine ne peut pas se lier aux membranes.Ces empilements sont clairement visibles par microscopie électronique en transmission. L'application de cette technique s'étend au développement de médicaments, car les composés peuvent être facilement criblés pour évaluer leur capacité à bloquer ou à favoriser les interactions entre protéines membranaires. Bien que cette méthode permette de déterminer les conditions optimales de liaison d'une protéine monotopique à votre membrane, elle fournit également une structure de faible résolution du complexe protéique en nanodisque.Pour commencer la procédure, exprimez et purifiez une protéine d'échafaudage membranaire telle que MSP1E3D1. Ensuite, à l'aide d'une seringue en verre munie d'une aiguille métallique, distribuez 305 microlitres de 25 milligrammes par millilitre de POPC dans le chloroforme dans un ballon en verre à fond rond. Évaporez le chloroforme sous un flux doux d'azote dans une hotte.Séchez le reste des lipides toute la nuit dans un dessiccateur sous vide. Ensuite, dissolvez le résidu lipidique sec dans 200 microlitres de tampon standard MSP enrichi avec 100 millimolaire de cholate de sodium en tant que détergent. Vortexez le mélange jusqu'à ce qu'il devienne transparent afin d'obtenir une suspension contenant 50 millimolaire de POPC dans le tampon.Ensuite, lavez cinq grammes de billes hydrophobes avec 30 millilitres de méthanol à 100 %, puis avec 40 millilitres d'eau ultrapure et enfin avec 10 millilitres de tampon standard MSP. Conservez les billes dans 15 millilitres de tampon standard à quatre degrés Celsius. Combinez ensuite 190 microlitres d'une solution de MSP1E3D1 à 0,124 millimolaire et 61,5 microlitres d'une suspension de POPC à 50 millimolaire dans le tampon, obtenant ainsi un rapport molaire de un à 130 de MSP par rapport à POPC et une concentration en cholate de sodium de 25 millimolaire.Le rapport idéal entre le lipide et la MSP varie selon le type de lipide et la lentille MSP choisis, et doit être optimisé afin d'obtenir une préparation homogène de nanodisques. Incuber le mélange sur de la glace fondante pendant une heure. Puis ajouter la solution à un tube contenant 0,5 gramme de billes hydrophobes lavées par millilitre de mélange de reconstitution afin d'initier l'auto-assemblage des nanodisques.Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant 16 heures à sept à huit rotations par minute. Après l'incubation, laisser les billes se déposer par gravité. Retirer et conserver le surnageant à quatre degrés Celsius jusqu'au moment de réaliser la chromatographie d'exclusion par taille.Avant la chromatographie d'exclusion par taille, centrifuger le mélange à 13 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnageant et éliminer le culot. Équilibrer une colonne de chromatographie d'exclusion par taille avec le tampon standard MSP jusqu'à ce que la ligne de base à 280 nanomètres soit stable.Injecter le surnageant sur la colonne et recueillir le produit en fractions de 0,5 millilitre. Mesurer l'absorbance des fractions à 280 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible. Calculer la concentration des nanodiscs en utilisant le coefficient d'extinction molaire du MSP choisi.Pour réaliser une électrophorèse sur gel non dénaturant, mélangez d'abord 15 microlitres d'échantillon avec cinq microlitres de tampon de charge approprié. Remplissez le réservoir cathodique avec le tampon cathodique clair et le réservoir anodique avec le tampon de migration. Chargez l'échantillon sur un gel Bis-Tris de 4 à 16 % et commencez la course.Colorer le gel selon les instructions du fabricant. Pour commencer la préparation d'un complexe protéique monotopique en nanodisque avec cinq lipoxygénase comme protéine, préparer un lot de tampon MSP standard enrichi avec 1,5 millimolaire de chlorure de calcium. Exprimer et purifier la protéine 5LO.Préparez immédiatement un mélange de 100 microlitres contenant 0,8 micromolaire de 5LO et 0,8 micromolaire de nanodisques dans un tampon standard MSP enrichi en calcium. Notre exemple de la cinq lipoxygénase, une protéinase monotopique, dépend des concentrations de calcium pour se lier à la membrane. La 5LO est très sensible et doit être utilisée dans les quelques heures suivant sa préparation.Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Conserver l'échantillon du complexe protéique en nanodisque obtenu à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à un mois. Pour commencer la préparation à l'analyse en microscopie électronique en transmission (TEM), dissoudre un gramme de sel de sodium de phosphotungstate dans 50 millilitres d'eau ultrapure à température ambiante.Régler le pH de la solution à 7,4 à l’aide d’une solution monomolaire d’hydroxyde de sodium. Filtrer la solution de phosphotungstate de sodium à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre et conserver la solution à température ambiante. Ensuite, effectuer une décharge lumineuse sur une grille en cuivre recouverte de carbone de 400 mailles pendant 20 secondes à 30 milliampères afin de rendre la surface de la grille hydrophile.Placez entre 2,5 et 5 microlitres de l'échantillon du complexe protéique monotopique dans des nanodiscs sur la grille et laissez l'échantillon reposer pendant 30 secondes. Utilisez ensuite du papier filtre pour éliminer la solution excédentaire sur la grille. Appliquez immédiatement une goutte de solution de phosphotungstate de sodium et laissez la solution agir pendant 30 secondes.Éliminer l'excès de solution par absorption et laisser sécher la grille à l'air. Réaliser une microscopie électronique en transmission avec une tension accélératrice de 120 à 200 kilovolts. Exclure les images montrant des empilements allongés de l'analyse d'image ultérieure.Pour les images sélectionnées, utiliser des méthodes de traitement standard afin de déterminer les moyennes par classe et de générer un modèle tridimensionnel à faible résolution de la protéine monotopique dans le nanodisque. À l’aide de cette méthode, des nanodisques vides ont été préparés selon un rapport de un à 130 entre les protéines d’échafaudage membranaires et les lipides. Un seul pic majeur a été observé lors de la chromatographie par exclusion stérique et une seule bande a été détectée en électrophorèse native bleue.Lorsque les nanodisques vides sont traités avec une solution de sel de sodium de phosphotungstique, un empilement est induit. Ces longs empilements peuvent ensuite être observés par microscopie électronique en transmission (MET). Cet empilement n'a pas été perturbé par l'ajout d'ions calcium dans la solution de nanodisques avant l'application de la solution de sel de sodium de phosphotungstique.Lorsqu'une protéine monotopique, comme la 5-lipoxygénase, est liée à la surface d'un nanodisque, l'empilement est entravé par un encombrement stérique dû à la protéine. Les deux faces du nanodisque sont disponibles pour la liaison, permettant la formation de complexes nanodisque-5LO dans des rapports de un à un et de deux à un. L'échantillon de complexes nanodisque-5LO en rapport deux à un a présenté un moindre empilement par rapport à l'échantillon en rapport un à un.La liaison de la 5-LO nécessite la présence d'ions calcium. Ceci a été confirmé par l'observation d'un empilement dans un mélange de 5-LO et de nanodisques sans calcium, ce qui indiquait que la 5-LO ne s'était pas liée aux surfaces membranaires. Une fois que la protéine monotopique et les nanodisques sont préparés, l'évaluation de la liaison de la protéine à votre membrane peut être réalisée en une après-midi, à condition qu'elle soit effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'estimer la surface occupée par la protéine sur le nanodisque afin de choisir la longueur appropriée de MSP. Pour des tailles bien adaptées, un maximum de deux protéines extrinsèques peuvent se lier, une de chaque côté du disque. Il est également essentiel d'utiliser le sel sodique du phosphotungstène pour la prise de contraste négative afin d'assurer un empilement maximal, car la liaison est confirmée par comparaison entre l'absence d'empilements et les longs empilements d'un échantillon ne contenant pas de protéine monotopique.L'utilisation de nanodisques au lieu de liposomes permet de recourir à la diffusion dynamique de la lumière et à la diffusion des rayons X aux petits angles afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'homogénéité, la taille ou la structure moléculaire de l'échantillon. La structure tridimensionnelle à faible résolution d'une protéine membranaire monotopique liée à un nanodisque pourrait constituer une première étape facilement accessible vers la détermination de la structure à haute résolution de ces protéines liées.

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