Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la liaison d’une protéine membranaire extrinsèque à la surface d’une membrane de nanodisque par microscopie électronique à transmission de coloration négative comme première étape vers la détermination de la structure à haute résolution de la protéine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans plusieurs domaines de recherche en ce qui concerne les activités protéiques qui se produisent dans et sur les membranes cellulaires. Le principal avantage de cette technique est l’empilement caractéristique des formes de nanodisques si la protéine ne peut pas se lier aux membranes.

Ces piles sont clairement visibles par microscopie électronique à transmission. L’implication de cette technique s’étend au développement de médicaments, car les composés peuvent être facilement criblés pour leur capacité à bloquer ou à permettre les interactions entre les protéines membranaires. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des conditions optimales pour la liaison des protéines monotopiques à votre membrane, elle fournit également une structure à faible résolution du complexe de nanodisques de protéines.

Pour commencer la procédure, exprimez et purifiez les protéines d’échafaudage membranaire telles que les MSP1E3D1. Ensuite, à l’aide d’une seringue en verre munie d’une aiguille métallique, versez 305 microlitres de 25 milligrammes par millilitre de POPC sous chloroforme dans une fiole en verre à fond rond. Évaporez le chloroforme sous un léger jet d’azote gazeux dans une hotte.

Faites sécher les lipides restants pendant la nuit dans un dessiccateur sous vide. Dissoudre ensuite le gâteau lipidique séché dans 200 microlitres de tampon standard MSP enrichi de 100 millimolaires de cholate de sodium comme détergent. Agiter le mélange jusqu’à ce qu’il soit transparent pour obtenir une suspension de 50 millimolaires de POPC dans un tampon.

Ensuite, lavez cinq grammes de billes hydrophobes avec 30 millilitres de méthanol à 100 %, puis avec 40 millilitres d’eau ultrapure et enfin avec 10 millilitres de tampon standard MSP. Stockez les billes sous 15 millilitres de tampon standard à quatre degrés Celsius. Combinez ensuite 190 microlitres d’une solution de 0,124 millimolaire de MSP1E3D1 et 61,5 microlitres d’une suspension de 50 millimolaires de POPC dans un tampon, ce qui donne un rapport de un à 130 molaires de MSP à POPC et une concentration de cholate de sodium de 25 millimolaires.

Le rapport idéal du lipide par MSP varie selon le choix du type de lipide et de la lentille MSP et doit être optimisé pour obtenir une préparation homogène des nanodisques. Incuber le mélange sur de la glace humide pendant une heure. Ajoutez ensuite la solution dans un tube contenant 0,5 gramme de haricots hydrophobes lavés par millilitre de mélange de reconstitution pour initier l’auto-assemblage des nanodisques.

Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant 16 heures à sept à huit rotations par minute. Après l’incubation, laissez les billes se déposer par gravité. Retirer et stocker le surnageant à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer une chromatographie d’exclusion stérique.

Avant la chromatographie d’exclusion stérique, centrifuger le mélange à 13 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnageant et jeter la pastille. Équilibrez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique avec un tampon standard MSP jusqu’à ce que la ligne de base à 280 nanomètres soit stable.

Injectez le surnageant dans la colonne et collectez le produit en fractions de 0,5 millilitre. Mesurez l’absorbance des fractions à 280 nanomètres avec un spectrophotomètre UV-vis. Calculez la concentration de nanodisques à l’aide du coefficient d’extinction molaire pour la MSP choisie.

Pour effectuer une électrophorèse sur gel non dénaturante, mélangez d’abord 15 microlitres de l’échantillon avec cinq microlitres du tampon de charge approprié. Remplissez le réservoir cathodique avec un tampon cathodique léger et le réservoir d’anode avec un tampon mobile. Chargez l’échantillon sur un gel de Bis-Tris à 4 à 16 % et commencez la course.

Teignez le gel selon les instructions du fabricant du gel. Pour commencer la préparation d’un complexe protéique monotopique de nanodisque avec cinq lipoxygénases comme protéine, préparez un lot de tampon standard MSP enrichi de chlorure de calcium 1,5 millimolaire. Exprimer et purifier la protéine 5LO.

Préparez immédiatement un mélange de 100 microlitres de 5LO micromolaire 0,8 micromolaire et de nanodisques micromolaires 0,8 dans un tampon étalon MSP enrichi en calcium. Notre exemple d’une protéinase monotopique cinq lipoxygénases dépend des quantités de calcium à lier à la membrane. 5LO est très sensible et doit être utilisé dans les quelques heures suivant la préparation.

Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Conservez l’échantillon du complexe protéique nanodisque obtenu à quatre degrés Celsius pendant un mois maximum. Pour commencer la préparation de l’analyse TEM, dissolvez un gramme de sel de sodium de phosphotungstate dans 50 millilitres d’eau ultrapure à température ambiante.

Ajustez le pH de la solution à 7,4 avec une solution molaire d’hydroxyde de sodium. Filtrez la solution de phosphotungstate sodique à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre et conservez la solution à température ambiante. Ensuite, décharge luminescente d’une grille en cuivre recouverte de carbone de 400 mailles pendant 20 secondes à 30 milliampères pour rendre la surface de la grille hydrophile.

Placez entre 2,5 et cinq microlitres de l’échantillon du complexe protéique monotopique du nanodisque sur la grille et laissez l’échantillon reposer pendant 30 secondes. Utilisez ensuite du papier filtre pour éponger l’excès de solution de la grille. Appliquez immédiatement une goutte de solution de phosphotungstate sodique et laissez reposer la solution pendant 30 secondes.

Épongez l’excès de solution et laissez la grille sécher à l’air. Effectuer la microscopie électronique à transmission avec une tension accélérée de 120 à 200 kilovolts. Excluez les images montrant de longues piles du traitement d’image ultérieur.

Pour les images sélectionnées, utilisez des méthodes de traitement standard pour déterminer les moyennes de classe et générer un modèle 3D à basse résolution de la protéine monotopique du nanodisque. À l’aide de cette méthode, des nanodisques vides ont été préparés avec un rapport de un pour 130 entre les protéines d’échafaudage membranaire et les lipides. Un seul pic majeur a été observé lors de la chromatographie d’exclusion stérique et une seule bande a été observée lors de l’électrophorèse sur gel natif bleu.

Lorsque les nanodisques vides sont traités avec une solution de sel de sodium de phosphotungstate, l’empilement est induit. Ces longs empilements peuvent ensuite être observés par TEM. Cet empilement n’a pas été perturbé par l’inclusion d’ions calcium dans la solution de nanodisque avant l’application de la solution de phosphotungstate sodique.

Lorsqu’une protéine monotopique telle que la cinq lipoxygénase est liée à la surface du nanodisque, l’empilement est entravé par l’obstruction stéarique de la protéine. Les deux côtés du nanodisque sont disponibles pour la liaison, permettant la formation de complexes de nanodisques 5LO un à un et deux à un. L’échantillon de deux complexes de nanodisques 5LO présentait moins d’empilement que l’échantillon individuel.

La liaison 5LO nécessite la présence d’ions calcium. Cela a été confirmé par l’observation d’un empilement dans un mélange de 5LO et de nanodisques sans calcium, ce qui indiquait que 5LO ne s’était pas lié aux surfaces de la membrane. Une fois que la protéine monotopique et les nanodisques sont préparés, l’évaluation de la liaison des protéines à votre membrane peut être effectuée en un après-midi si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’estimer la surface de la protéine sur le nanodisque pour choisir la bonne longueur de MSP. Pour des tailles bien adaptées, au maximum deux protéines extrinsèques peuvent se lier une de chaque côté du disque. Il est également important que le sel de sodium du phosophotungstène soit utilisé pour le support négatif afin d’assurer un empilement maximal, car la liaison est confirmée par la comparaison de l’absence d’empilements aux longues piles d’un échantillon sans protéine monotopique.

L’utilisation des nanodisques au lieu des liposomes permet d’utiliser la diffusion dynamique de la lumière, la diffusion des rayons X aux petits angles pour répondre à des questions supplémentaires sur l’homogénéité, la taille de l’échantillon ou la structure moléculaire. La structure 3D à basse résolution d’une protéine membranaire monotopique liée à un nanodisque pourrait être une première étape facilement accessible sur la voie de la structure à haute résolution de ces protéines liées.