Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Cette vidéo se concentrera sur la préparation de la salmonelle de levure pour la cryo-tomographie électronique Nous passerons par le flux de travail de la culture cellulaire à la cryo-tomographie électronique Saccharomyces cerevisiae sont cultivés pour la préparation d’échantillons d’ions en suspension Il est recommandé de travailler dans des conditions stériles à l’intérieur de la boîte à flux laminaire dix millilitres de levure stérile extraite au milieu pour la culture cellulaire est ajouté pour stériliser la fiole de culture un millilitre de glucose stérile vingt pour cent est ajouté à la fiole avec le milieu de culture une colonie de levure est soigneusement cueillie dans notre plaque de culture et transférée dans le milieu de croissance préparé dans la fiole de culture la fiole de culture est ensuite recouverte de feuille et bien mélangée pour disperser les cellules la culture cellulaire est placée dans l’incubateur et cultivée à trente degrés avec une agitation constante jusqu’à ce que la phase exponentielle soit atteinte la culture cellulaire de levure est cultivée jusqu’à la phase exponentielle et la densité physique cellulaire est mesurée par maintien du compteur contre un milieu propre comme échantillon de référence La culture cellulaire est concentrée sur OD1 ou OD30 en plus de cinq pour cent de glycérol avant la congélation blanche La surface des grilles électro-microscopiques est nettoyée et activée pour l’application de la suspension cellulaire par des grilles de plasma sont placées dans une chambre de décharge de lueur face au carbone vers le haut et la procédure de nettoyage du plasma est réglée sur trente à quarante-cinq secondes Les grilles EM ont maintenant et elles sont prêtes pour la cellule exemple d’application La vitrification de la suspension de cellules de levure sur les grilles EM se fait par congélation blanche dans l’éthane liquide à l’aide de la machine Vitrobot La préparation de l’éthane liquide a lieu en liquéfiant le gaz éthane dans une tasse métallique refroidie avec de l’azote liquide La grille EM avec suspension cellulaire est effacée par du papier filtre de la face arrière et par du plastique non adhésif plié de la face avant du carbone La température à l’intérieur de la chambre Vitrobot est réglée sur dix-huit degrés et une humidité à cent pour cent de temps d’attente, le temps de transfert et la force de transfert sont également réglés sur l’écran Vitrobot La grille de décharge lumineuse est choisie par la pince à épileuse Vitrobot et montée sur l’instrument à trois points cinq microlitres de suspension Saccharomyces cerevisiae est appliquée sur le côté carbone de la grille à l’intérieur de la chambre climatique Vitrobot La suspension doit être correctement mélangée avant que chaque application de la grille de grille ne soit gelée blanche dans les grilles d’électro-microscopie à éthane liquide avec des cellules vitrifiées sont stockées dans des conditions d’azote liquide ou montées dans la cartouche de grille pour le chargement dans le microscope cryo SEM La grille avec des cellules vitrifiées est ensuite fixée dans la cartouche de grille adaptée au chargement sur les microscopes SEM et TEM L’anneau C-clip est monté sur l’outil de clipsage et refroidi dans la grille d’azote liquide est placé sur la cartouche de grille carbone face vers le bas et clipsé avec le L’échantillon d’anneau C-clip est ensuite placé dans la boîte de grille spéciale L’échantillon pour la préparation de lamila est chargé au microscope FIB / SEM à double faisceau et s’adapte au pot de charge de la chambre de préparation cryo-étape est correctement refroidi et rempli avec un porte-échantillon d’azote liquide appelé navette est placé dans le et refroidi ainsi que la boîte de grille avec échantillon est transférée du dewar de stockage au pot et les grilles sont placées dans deux fentes dans le côté carbone navette avec cellules tournées vers le haut en cas d’utilisation de cartouches de grille FIB la découpe de la cartouche de grille doit être soigneusement alignée à douze heures dans les grilles de navette sont serrées par la vis et la navette est retournée vers le bas à la position de chargement le pot de chargement est placé dans la station de transfert et recouvert d’un couvercle Chambre de transfert avec pot de chargement est placé sur le dessus du couvercle et pompé à travers le la navette à vide faible avec des grilles est fixée sur la tige et fermée à l’intérieur des petites chambres de chambre de transfert collectées dans la chambre de préparation sont pompées et la navette est insérée sur l’étage cryogénique dans l’étage de la chambre SEM à vide poussé est incliné à quarante-cinq degrés et déplacé de quatre millimètres sur la position centrale de la grille insérant l’aiguille du système d’injection de gaz crée une couche protectrice de l’organique sur l’échantillon biologique contre les dommages causés par le rayonnement pendant la focalisation Les grilles de fraisage à faisceau d’ions sont ensuite recouvertes d’un mince voile de métal inorganique pour créer une couche conductrice sur le matériau biologique Le fraisage par faisceau d’ions focalisé de la lamelle dans un groupe de cellules ou une monocouche se fait en quelques étapes étape est déplacé vers l’angle de fraisage région d’intérêt est trouvé et des motifs de fraisage supérieur et inférieur sont créés lamelle rugueuse est fraisé avec une diminution progressive du courant FIB et de l’épaisseur de la lame le polissage final de la lame est effectué uniquement avec un motif supérieur et un faible courant FIB pour éviter les dommages à l’extrémité avant et l’effet de rideau sur le faisceau d’électrons de surface de la lamelle montre la progression pendant le processus de fraisage ici, nous pouvons voir la lame finie polie L’épaisseur finale de la lame doit être inférieure à deux cent cinquante nanomètres pour être transparente pour la transmission du faisceau d’électrons l’illustration de la lamelle fraisée en grappe de cellules et monocouche avec des avantages et des inconvénients de les deux types d’échantillons de grilles avec lamali sont très doucement transférés à travers la chambre de préparation vers le pot de chargement, le pot est refroidi et rempli d’azote liquide frais et propre pour éviter la contamination par la glace des grilles de lamali broyées sont retirés de la navette et renvoyés à l’échantillon de boîte de grille avec lamali fraisé est finalement transféré à la grille de cryomicroscope électronique à transmission doit être tourné à quatre-vingt-dix degrés avant d’être inséré dans la cassette du chargeur automatique TEM pour assurer une orientation correcte de la lamelle par rapport à l’accès d’inclinaison TEM, les lamili sont filtrés et la région d’intérêt pour l’acquisition de données tomographiques cryo-électroniques est localisée L’axe principal de Lamella est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du microscope pour voir le champ de vision droit à des angles d’inclinaison élevés La méthode dosimétrique est utilisée pour collecter les données de cryo-tomographie électronique collectées Le tomogramme est ensuite traité dans le logiciel Etomo et la monocouche segmentée dans Amira Dans ce protocole, nous vous avons montré comment préparer efficacement un échantillon de cellule de levure pour une micro-machine à lamelles en utilisant le fraisage par faisceau d’ions cryo focalisé et comment préparer et traiter les données de tomographie électronique et les lamali cellulaires