Name: Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez la préparation de lamellules de Saccharomyces cerevisiae par cryo-FIB pour la cryo-tomographie électronique. Ce protocole détaillé couvre la culture cellulaire, la vitrification et le micro-usinage pour l'étude structurale in situ.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La préparation des échantillons cellulaires pour cryo-ET est un flux de travail complexe qui nécessite l’utilisation de plusieurs instruments haut de gamme. La qualité de l’échantillon peut être compromise à chaque étape de préparation, ce qui influence le débit de l’ensemble du protocole. En outre, la nécessité du transfert d’échantillons entre instruments individuels présente un risque supplémentaire de contamination ou de dévitrification des échantillons. Par conséquent, l’optimisation des étapes individuelles du flux de travail de préparation des échantillons est d’une grande importance pour augmenter le débit et la reproductibilité du flux de travail de préparation des lamelles. Le protocole présenté ici décrit la préparation optimisée de Saccharomyces cerevisiae pour la caractérisation structurale de complexes macromoléculaires in situ par cryo-ET.
Le protocole décrit la préparation de deux types d’échantillons de levure qui diffèrent principalement par la concentration des cellules sur la grille TEM. Les deux échantillons de levure ont donné des lamelles de haute qualité pour cryo-ET et la sélection du type d’échantillon peut être effectuée conformément aux objectifs de l’étude particulière. La levure forme des grappes isolées de quelques cellules dispersées aléatoirement sur la surface de la grille dans le premier cas, tandis qu’une monocouche continue de cellules est présente sur la surface de la grille TEM pour le deuxième type d’échantillon. Le premier convient à la préparation rapide des lamelles grâce au petit volume du matériau qui doit être fraisé. La lamelle finale est assez courte et, par conséquent, ne contient que 2 à 4 sections transversales cellulaires. Les zones adaptées à la préparation des échantillons sont réparties de manière aléatoire sur la surface de la grille, y compris les carrés de la grille, ce qui peut restreindre partiellement l’automatisation du flux de travail de préparation de la lamelles. Ce dernier type d’échantillon nécessite l’utilisation de courants plus importants pendant la phase de broyage initiale pour conserver le temps de fraisage global. De plus, ce type d’échantillon est plus sujet aux artefacts qui proviennent d’un fraisage inégal (rideaux). Par conséquent, le SIG est pulvérisé sur la surface de l’échantillon pendant une période 50% plus longue que dans le cas de l’échantillon avec de petits amas cellulaires pour former une couche protectrice plus épaisse. Ensuite, l’échantillon est pulvérisé avec une couche supplémentaire d’iridium (alternativement du platine ou de l’or) pour durcir la couche SIG, la rendre plus rigide et augmenter la conductivité de surface de l’échantillon. FiBM de zones supplémentaires de chaque côté de la lame (~ 2-5 μm du bord de la lame) au cours de la première étape du fraisage de la lame rugueuse s’est avéré bénéfique pour diminuer le nombre de lamelles cassées, probablement en raison de la diminution de la tension dans la section transversale finale23. La lame finale est longue et contient environ 10 sections transversales cellulaires, ce qui augmente le nombre de régions adaptées à la cryo-ET. La vitrification incorrecte du milieu ou du tampon entre les cellules peut être facilement atténuée par l’ajout du cryo-protection à la solution tampon (5% de glycérol utilisé dans cette étude). Étant donné que la plupart des carrés conviennent à la préparation de lamelles, l’échantillon avec des cellules organisées en une monocouche continue est bien adapté à la préparation de lamelles non supervisées.
Un autre aspect important du flux de travail de préparation de la lamelles est le transfert au microscope électronique à transmission et le positionnement correct de la lame sur l’axe d’inclinaison de l’étage du microscope. De manière optimale, l’axe principal de la lame est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du microscope, ce qui permet de suivre et de faire la mise au point à la hauteur de la région imagée et empêche les bords de la lame de protéger le champ de vision à des angles d’inclinaison élevés. Lors de la collecte des données cryo-ET à l’aide du schéma dose-symétrique18, l’échantillon doit être initialement tourné au microscope pour compenser l’inclinaison de la lamelle par rapport au plan de la grille.

Les récents développements technologiques et logiciels ont fait de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) des spécimens biologiques vitrifiés l’une des techniques clés de la recherche en biologie structurale au cours de la dernière décennie1,2. La préparation d’un échantillon pour cryo-EM consiste généralement en l’application d’une protéine purifiée ou d’un complexe de protéines avec de l’acide nucléique sur le support de l’échantillon (grille TEM), suivie de l’élimination de la majeure partie du liquide avec un papier filtre, et de la congélation plongeante de la grille avec la couche mince résiduelle d’un échantillon dans de l’éthane liquide ou du propane3 . L’échantillon est ainsi fixé dans une fine couche (généralement <80 nm) de tampon amorphe à l’état entièrement hydraté, dans des conditions quasi natives, et sans qu’il soit nécessaire de fixer chimiquement ou de contraster les métaux lourds. L’imagerie de l’échantillon structurellement homogène au microscope électronique à transmission donne alors des données qui peuvent être utilisées pour la détermination de la structure tridimensionnelle de la macromolécule à une résolution quasi atomique à l’aide d’un seul protocole d’analyse departicules 2. Une telle structure in vitro correspond à la représentation de la macromolécule dans les conditions et le traitement utilisés lors de la préparation de l’échantillon. Bien que les structures déterminées dans les conditions in vitro correspondent généralement à l’état pleinement fonctionnel de la macromolécule, la capacité d’imager les relations spatiales entre diverses macromolécules à l’intérieur de la cellule fournirait un contexte fonctionnel supplémentaire aux données structurelles.
La cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est utilisée pour reconstruire des volumes 3D d’objets pléomorphes ou de complexes macromoléculaires in situ4,5. L’avantage du cryo-ET est que l’information tridimensionnelle est obtenue en imageant une seule entité. Cependant, la résolution à laquelle des complexes macromoléculaires individuels ou des organites sont observés est très limitée. Par conséquent, la moyenne des macromolécules (moyenne des sous-tomogrammes, STA) avec la même structure à partir d’un plus grand nombre de tomogrammes est nécessaire pour atteindre des modèles de résolution 4-8 Å à partir des données cryo-ET6,7. Il a récemment été démontré que cryo-ET et STA peuvent également être appliqués pour déterminer des structures à haute résolution de machines macromoléculaires telles que les ribosomes dans le contexte de l’environnement cellulaire7. Cependant, l’utilisation de la microscopie électronique à transmission est limitée par l’épaisseur de l’échantillon. En général, ce n’est pas un problème pour la cryo-EM à particule unique où l’optimisation des conditions de vitrification peut éventuellement entraîner l’incorporation de l’échantillon dans une fine couche de glace. D’autre part, la plupart des cellules ne sont en fait pas transparentes en électrons pour le faisceau d’électrons de 300 keV. Le chemin libre moyen inélastique dans les échantillons biologiques vitrifiés pour les électrons de 300 keV est d’environ 395 nm8, ce qui signifie que les études cryo-ET sont limitées à la périphérie cellulaire pour la plupart des cellules.
Différentes techniques ont été développées pour éclaircir l’échantillon jusqu’à une épaisseur suffisante pour la cryo-ET. La cryo-ultramicrotomie utilise le tranchage mécanique de l’échantillon avec un couteau diamanté à la température de l’azote liquide (-196 °C) pour fournir des sections d’épaisseur de 60 à 80 nm adaptées à la cryo-ET9,10,11. Plusieurs sections peuvent être préparées à partir d’une seule cellule et l’analyse des données peut éventuellement produire des informations structurelles 3D pour la plus grande partie de la cellule. Cependant, le tranchage mécanique peut provoquer plusieurs artefacts tels que des sections courbes, des crevasses ou une compression d’échantillon, ce qui peut influencer la structure résultante et biaiser les données cryo-ET10,11,12. Le micro-usinage par faisceau d’ions cryoconsoités (cryo-FIBM) représente une approche alternative où une section cellulaire mince est préparée par ablation progressive de l’échantillon à l’aide d’un faisceau focalisé d’ions Ga+ (FIB) dans un processus en plusieurs étapes, ce qui peut entraîner une section cellulaire (lamelles) de 80 à 300 nm d’épaisseur13,14,15 . Contrairement à la cryo-ultramicrotomie, une seule lamelle est préparée à partir d’une seule cellule, ce qui représente environ 0,3 à 3% de son volume, et le micro-usinage de plusieurs cellules est généralement nécessaire pour trouver une région d’intérêt dans la section transversale fraisée. En outre, le débit de l’ensemble du flux de travail est encore assez faible, souvent limité à 6 à 8 lamelles de haute qualité provenant d’une session cryo-FIBM de 8 heures. D’autre part, les sections transversales cryo-FIBM sont dépourvues de tout artefact de compression et fournissent une entrée appropriée pour la cryo-ET haute résolution. De plus, le transfert de la lamelle au support de l’échantillon pour la cryo-ET n’est pas nécessaire car l’échantillon est conservé sur la grille TEM pendant tout le processus de préparation de la lamelle et la même grille peut ensuite être transférée à TEM. Nous nous attendons à ce que le débit du cryo-FIBM soit bientôt considérablement amélioré, principalement grâce à la disponibilité de logiciels pour le fraisage non supervisé des lamelles16,17 et à l’utilisation de FIB fonctionnant sur le principe du plasma à couple de charge, ce qui permettra une ablation plus rapide du matériau.
Saccharomyces cerevisiae (levure) sont des cellules eucaryotes de forme sphérique et de diamètre d’environ 2-5 μm. Grâce à sa taille, son accessibilité, sa génétique, son temps de génération et sa manipulation simple, la levure est largement étudiée en tant qu’organisme modèle eucaryote dans la recherche en biologie cellulaire et moléculaire similaire à Escherichia coli, qui est bien étudiée en tant qu’organisme modèle procaryote en bactériologie. La levure peut être facilement cultivée en suspension et une grande quantité de cellules est générée en peu de temps (temps double de 1 à 2 heures). Plus important encore, la levure partage une structure cellulaire interne complexe avec les cellules animales et végétales tout en conservant un petit génome composé d’une faible teneur en ADN non codant. La caractérisation structurale du protéome de levure à partir des données in situ à haute résolution peut donc aider à fournir une description mécaniste de la grande quantité de données fonctionnelles disponibles dans la littérature.
Ici, nous fournissons un protocole complet pour l’acquisition de données cryo-ET in situ sur l’échantillon de levure, qui couvre toutes les étapes de la culture de l’échantillon jusqu’à la préparation de la lame cryo-FIBM, et le transfert de l’échantillon à TEM pour l’acquisition de données cryo-ET.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>éthane</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>souche BY4741</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><fort>Jetables</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buvards</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>C-clip anneau</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Bâtonnets d’épandage</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation stériles</td><td>BRAND</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles en plastique</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>grilles TEM</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>balances</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cryo-FIB/SEM</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à flux laminaire</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Nouveau-Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV/VIS</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>Robot de vitrification</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et micro-usinage cryo-fib de saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Aujourd’hui, la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est la seule technique qui peut fournir des données structurelles à résolution quasi atomique sur des complexes macromoléculaires in situ. En raison de la forte interaction d’un électron avec la matière, les études cryo-ET à haute résolution sont limitées aux échantillons d’une épaisseur inférieure à 200 nm, ce qui limite l’applicabilité de la cryo-ET uniquement aux régions périphériques d’une cellule. Un flux de travail complexe qui comprend la préparation de sections transversales cellulaires minces par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé (cryo-FIBM) a été introduit au cours de la dernière décennie pour permettre l’acquisition de données cryo-ET à partir de l’intérieur de cellules plus grandes. Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles cellulaires à partir d’un échantillon vitrifié par congélation plongeante en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme exemple prototypique d’une cellule eucaryote largement utilisée dans la recherche en biologie cellulaire et moléculaire. Nous décrivons des protocoles pour la vitrification de S. cerevisiae en plaques isolées de quelques cellules ou d’une monocouche continue des cellules sur une grille TEM et fournissons un protocole pour la préparation de lamelles par cryo-FIB pour ces deux échantillons.

La culture saccharomyces cerevisiae a été récoltée au milieu de la phase de croissance exponentielle. Nous avons préparé deux types d’échantillons dans lesquels les cellules étaient soit distribuées sous forme de petits groupes de plusieurs cellules sur la surface de la grille TEM (Figure 1A, C) ou formaient une monocouche continue sur des carrés de grille individuels de la grille TEM ( Figure1B, D). Le facteur discriminant pour la préparation de l’échantillon avec des îlots cellulaires distincts ou la monocouche cellulaire est la concentration de la culture cellulaire appliquée à la grille TEM. La culture cellulaire récoltée a été concentrée àOD 600 = 1,0 pour le premier cas, ou à OD600 = 30 à 60 pour le second cas, respectivement. L’échantillon pour la préparation de la monocouche cellulaire a été complété par du glycérol à 5% v /v avant la vitrification. Le glycérol est essentiel pour la vitrification de la solution tampon, qui remplit l’espace entre les cellules(Figure 2),car les réflexions du tampon cristallin peuvent être préjudiciables au suivi et à la mise au point de la position lors de la collecte de données cryo-ET.
De plus, la culture de suspension de levure a été épongée contre le matériau non absorbant tel que le tampon de buvard en PTFE ou le tampon imprimé en 3D personnalisé en matériau FlexFill 98A. Le papier buvard a été positionné uniquement à l’arrière de la grille par rapport à l’application de l’échantillon (back-blotting). La stratégie de rétro-blotting est recommandée pour la congélation en suspension car le buvard avec le papier filtre des deux côtés entraîne l’adhérence des cellules au papier buvard (Figure 1E).
Le protocole décrit ici utilise des grilles TEM clipsées dans la cartouche de grille, ce qui constitue un support stable pour la grille et facilite la manipulation de l’échantillon après la vitrification. Cela impose la nécessité que d’autres porte-échantillons et navettes dans les microscopes FIB/SEM et TEM puissent accepter une telle cartouche de grille.
Lors du transfert de l’échantillon dans le microscope FIB/SEM, l’échantillon a d’abord été recouvert d’une couche de 0,3 à 1,0 μm de platine méthylcyclopentadiényle à l’aide du système d’injection de gaz au microscope (SIG). Une couche supplémentaire d’iridium inorganique a été pulvérisée sur la surface de l’échantillon pour durcir la couche SIG et rendre la surface conductrice. Les lamelles ont été fraisées en plusieurs étapes(figure 3)où (I) le courant de fraisage, (II) la largeur de la lame et (III) la distance de la zone de fraisage au-dessus et au-dessous des échantillons ont été réduits progressivement. L’étape finale de fraisage (« polissage ») a été effectuée à faible courant (10-30 pA) uniquement à partir de la face supérieure de la lame et avec l’échantillon incliné de 1° supplémentaire vers le faisceau Ga+. L’utilisation du protocole décrit a en moyenne abouti à 8 à 10 lamelles préparées sur deux grilles TEM en une session de 6 à 8 heures.
Les grilles TEM avec les lamelles ont ensuite été transférées dans un microscope électronique à transmission. Les lamelles ont d’abord été criblées et seules celles qui présentaient un rideau minimal (artefacts provenant d’un fraisage inégal sur la surface de la lame), un faible niveau de contamination de surface et un bon contraste cellulaire (généralement observé pour les lamelles d’une épaisseur de &lt;200 nm) ont été sélectionnées pour l’acquisition des données cryo-ET. De plus, les lamelles contenant des fissures sur toute la longueur ont été éliminées de la collecte de données. En général, environ 50 % des lamelles transférées à la GDT convenaient à l’acquisition de données. Les séries d’inclinaison ont été collectées sur le détecteur d’électrons directs K2 post-GIF avec la fente de sélection d’énergie réglée sur 20 eV. La collecte de données a été réalisée dans le logiciel SerialEM18 et les séries d’inclinaison ont été collectées à l’aide d’un schéma symétrique de dose19 avec une plage d’inclinaison de ±60° et un incrément de 3°. Les données ont été acquises au grossissement correspondant à la taille de pixel de 3,47 A/px. La dose globale de 65 e/Å2 a été répartie uniformément sur les différents sous-cadres. Les images d’inclinaison ont été collectées sous la forme d’un ensemble de trois images, qui ont ensuite été corrigées pour les dommages causés par le mouvement et le rayonnement lors de l’acquisition de données à l’aide du programmeMotionCor2 20. Les paramètres de la fonction de transfert de contraste ont été estimés à l’aide de Ctffind421. Les séries d’inclinaison ont été traitées dans eTomo18. La routine de suivi des correctifs a été utilisée pour aligner les images. Le tomogramme a été reconstruit à l’aide d’un algorithme de rétroprojection pondéré après 2x binning des images, puis filtré à l’aide d’un filtre de type SIRT (défini sur 8 itérations) dans IMOD18. La segmentation du tomogramme a été effectuée manuellement dans le logiciel Amira22. Les tomogrammes reconstruits fournissent une représentation à haute résolution de l’intérieur cellulaire de la levure et nous permettent d’observer des organites tels que des vacuoles ou des mitochondries à un niveau de détail élevé ou d’étudier des complexes macromoléculaires tels que des microtubules, ou des complexes de pores nucléaires in situ et dans des conditions quasi natives (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Figure 1 : Images FIB et SEM de S. cerevisiae vitrifiée Images FIB (A) et SEM (C) des petits amas de levures vitrifiés sur la grille TEM. Images FIB (B) et SEM (D) de la levure formant une monocouche continue sur la surface de la grille. L’échantillon a été recouvert d’un SIG et d’une couche d’irridium avant l’imagerie. Les barres d’échelle dans les panneaux A-B correspondent à 10 μm. L’échantillon de levure est comprimé contre un matériau non absorbant tel que le PTFE ou le FlexFill 98A (vert) et avec le papier buvard positionné à l’arrière de la grille (blanc, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Figure 2 : S. cerevisiae lamellae Image TEM d’une lamelle micro-usinée à partir de l’échantillon avec de la levure monocouche continue sur la surface de la grille. Les réflexions observées entre les cellules contenaient un milieu/tampon mal vitrifié(A,surligné de cercles rouges). Une image TEM de lamelle générée sur la levure vitrifiée en une monocouche continue avec l’ajout de 5% de glycérol dans le milieu/tampon (B). La barre d’échelle correspond à 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Figure 3 : Flux de travail Cryo-FIBM Représentation schématique du processus de fraisage à lamelles. Les premières étapes de fraisage brut sont effectuées à des courants FIB élevés des deux côtés de la position provisoire de la lame (surlignée en vert), tandis que l’étape de polissage finale est effectuée uniquement à partir du côté supérieur et à un faible courant FIB (surligné en orange, voir la vidéo d’accompagnement à 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Figure 4 : Organites de levure et complexes macromoléculaires représentés par cryo-ET Tranches des tomogrammes reconstruits représentant une vacuole (A, barre d’échelle: 200 nm), des ribosomes (B, barre d’échelle: 200 nm), un noyau paracristallin de peroxysome (C, barre d’échelle: 100 nm), un microtubule (flèche blanche) à proximité d’une structure fibreuse non identifiée (flèche noire, D, barre d’échelle: 100 nm), détails de plusieurs microtubules (E, barre d’échelle: 50 nm), une membrane nucléaire avec des pores indiqués par des flèches (F, barre d’échelle 200nm), mitochondrie (G,H, barre d’échelle: 100 nm, les flèches indiquent cristae individuelle), un faisceau de structures filamenteuses non identifiées (I, barre d’échelle: 100 nm). Les panneaux B, C, D, E, G contiennent une section de tomogrammes préparés à partir de petits amas de cellules tandis que les sections de tomogrammes collectées sur les lamelles à partir d’une monocouche des cellules sont représentées dans les panneaux A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles d’échantillons biologiques congelés par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé pour des études structurelles à haute résolution de macromolécules in situ avec cryo-tomographie électronique. Le protocole présenté fournit des lignes directrices pour la préparation de lamelles de haute qualité avec une reproductibilité élevée pour la caractérisation structurelle des macromolécules à l’intérieur des Saccharomyces cerevisiae.

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Cette vidéo se concentrera sur la préparation de la salmonelle de levure pour la cryo-tomographie électronique Nous passerons par le flux de travail de la culture cellulaire à la cryo-tomographie électronique Saccharomyces cerevisiae sont cultivés pour la préparation d’échantillons d’ions en suspension Il est recommandé de travailler dans des conditions stériles à l’intérieur de la boîte à flux laminaire dix millilitres de levure stérile extraite au milieu pour la culture cellulaire est ajouté pour stériliser la fiole de culture un millilitre de glucose stérile vingt pour cent est ajouté à la fiole avec le milieu de culture une colonie de levure est soigneusement cueillie dans notre plaque de culture et transférée dans le milieu de croissance préparé dans la fiole de culture la fiole de culture est ensuite recouverte de feuille et bien mélangée pour disperser les cellules la culture cellulaire est placée dans l’incubateur et cultivée à trente degrés avec une agitation constante jusqu’à ce que la phase exponentielle soit atteinte la culture cellulaire de levure est cultivée jusqu’à la phase exponentielle et la densité physique cellulaire est mesurée par maintien du compteur contre un milieu propre comme échantillon de référence La culture cellulaire est concentrée sur OD1 ou OD30 en plus de cinq pour cent de glycérol avant la congélation blanche La surface des grilles électro-microscopiques est nettoyée et activée pour l’application de la suspension cellulaire par des grilles de plasma sont placées dans une chambre de décharge de lueur face au carbone vers le haut et la procédure de nettoyage du plasma est réglée sur trente à quarante-cinq secondes Les grilles EM ont maintenant et elles sont prêtes pour la cellule exemple d’application La vitrification de la suspension de cellules de levure sur les grilles EM se fait par congélation blanche dans l’éthane liquide à l’aide de la machine Vitrobot La préparation de l’éthane liquide a lieu en liquéfiant le gaz éthane dans une tasse métallique refroidie avec de l’azote liquide La grille EM avec suspension cellulaire est effacée par du papier filtre de la face arrière et par du plastique non adhésif plié de la face avant du carbone La température à l’intérieur de la chambre Vitrobot est réglée sur dix-huit degrés et une humidité à cent pour cent de temps d’attente, le temps de transfert et la force de transfert sont également réglés sur l’écran Vitrobot La grille de décharge lumineuse est choisie par la pince à épileuse Vitrobot et montée sur l’instrument à trois points cinq microlitres de suspension Saccharomyces cerevisiae est appliquée sur le côté carbone de la grille à l’intérieur de la chambre climatique Vitrobot La suspension doit être correctement mélangée avant que chaque application de la grille de grille ne soit gelée blanche dans les grilles d’électro-microscopie à éthane liquide avec des cellules vitrifiées sont stockées dans des conditions d’azote liquide ou montées dans la cartouche de grille pour le chargement dans le microscope cryo SEM La grille avec des cellules vitrifiées est ensuite fixée dans la cartouche de grille adaptée au chargement sur les microscopes SEM et TEM L’anneau C-clip est monté sur l’outil de clipsage et refroidi dans la grille d’azote liquide est placé sur la cartouche de grille carbone face vers le bas et clipsé avec le L’échantillon d’anneau C-clip est ensuite placé dans la boîte de grille spéciale L’échantillon pour la préparation de lamila est chargé au microscope FIB / SEM à double faisceau et s’adapte au pot de charge de la chambre de préparation cryo-étape est correctement refroidi et rempli avec un porte-échantillon d’azote liquide appelé navette est placé dans le et refroidi ainsi que la boîte de grille avec échantillon est transférée du dewar de stockage au pot et les grilles sont placées dans deux fentes dans le côté carbone navette avec cellules tournées vers le haut en cas d’utilisation de cartouches de grille FIB la découpe de la cartouche de grille doit être soigneusement alignée à douze heures dans les grilles de navette sont serrées par la vis et la navette est retournée vers le bas à la position de chargement le pot de chargement est placé dans la station de transfert et recouvert d’un couvercle Chambre de transfert avec pot de chargement est placé sur le dessus du couvercle et pompé à travers le la navette à vide faible avec des grilles est fixée sur la tige et fermée à l’intérieur des petites chambres de chambre de transfert collectées dans la chambre de préparation sont pompées et la navette est insérée sur l’étage cryogénique dans l’étage de la chambre SEM à vide poussé est incliné à quarante-cinq degrés et déplacé de quatre millimètres sur la position centrale de la grille insérant l’aiguille du système d’injection de gaz crée une couche protectrice de l’organique sur l’échantillon biologique contre les dommages causés par le rayonnement pendant la focalisation Les grilles de fraisage à faisceau d’ions sont ensuite recouvertes d’un mince voile de métal inorganique pour créer une couche conductrice sur le matériau biologique Le fraisage par faisceau d’ions focalisé de la lamelle dans un groupe de cellules ou une monocouche se fait en quelques étapes étape est déplacé vers l’angle de fraisage région d’intérêt est trouvé et des motifs de fraisage supérieur et inférieur sont créés lamelle rugueuse est fraisé avec une diminution progressive du courant FIB et de l’épaisseur de la lame le polissage final de la lame est effectué uniquement avec un motif supérieur et un faible courant FIB pour éviter les dommages à l’extrémité avant et l’effet de rideau sur le faisceau d’électrons de surface de la lamelle montre la progression pendant le processus de fraisage ici, nous pouvons voir la lame finie polie L’épaisseur finale de la lame doit être inférieure à deux cent cinquante nanomètres pour être transparente pour la transmission du faisceau d’électrons l’illustration de la lamelle fraisée en grappe de cellules et monocouche avec des avantages et des inconvénients de les deux types d’échantillons de grilles avec lamali sont très doucement transférés à travers la chambre de préparation vers le pot de chargement, le pot est refroidi et rempli d’azote liquide frais et propre pour éviter la contamination par la glace des grilles de lamali broyées sont retirés de la navette et renvoyés à l’échantillon de boîte de grille avec lamali fraisé est finalement transféré à la grille de cryomicroscope électronique à transmission doit être tourné à quatre-vingt-dix degrés avant d’être inséré dans la cassette du chargeur automatique TEM pour assurer une orientation correcte de la lamelle par rapport à l’accès d’inclinaison TEM, les lamili sont filtrés et la région d’intérêt pour l’acquisition de données tomographiques cryo-électroniques est localisée L’axe principal de Lamella est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du microscope pour voir le champ de vision droit à des angles d’inclinaison élevés La méthode dosimétrique est utilisée pour collecter les données de cryo-tomographie électronique collectées Le tomogramme est ensuite traité dans le logiciel Etomo et la monocouche segmentée dans Amira Dans ce protocole, nous vous avons montré comment préparer efficacement un échantillon de cellule de levure pour une micro-machine à lamelles en utilisant le fraisage par faisceau d’ions cryo focalisé et comment préparer et traiter les données de tomographie électronique et les lamali cellulaires

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Cryo Electron Microscope, soit à balayage (MEB) ou de transmission (TEM), sont largement utilisés pour la caractérisation des échantillons biologiques ou d'autres matériaux avec une forte teneur en eau 1. Une SEM / Focused Ion Beam (FIB) est utilisé pour identifier les caractéristiques d'intérêt dans des échantillons et extraire une lame mince, électron-transparent pour le transfert à un cryo-MET.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Cet article décrit la méthodologie de cryo-microscopie électronique, qui est utilisée pour obtenir des images microscopiques de haute qualité de macromolécules dans leur état proche de leur natif. La méthode produit des images adaptées à un traitement informatisé ultérieur en utilisant l’approche de la particule unique, conçue pour générer la reconstruction 3D d’une macromolécule.

À faire et à ne pas faire de cryo-microscopie électronique: Notions sur la préparation de l&#39;échantillon et de collecte de données de haute qualité pour la reconstruction 3D macromoléculaire

Nous présentons un protocole sur la façon d'utiliser à haut débit tomographie cryo-électronique pour déterminer haute résolution dans les structures in situ de machines moléculaires. Le protocole permet de grandes quantités de données à traiter, évite les goulots d'étranglement communs et de réduire l'indisponibilité des ressources, permettant à l'utilisateur de se concentrer sur des questions biologiques importantes.

Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Méthodes pour la préparation du volume des échantillons de taille nanolitres pour microscopie électronique à transmission et un instrument est présenté. Aucune étape de papier-buvard est requise, afin d’éviter les conséquences négatives que cela peut avoir pour les protéines, considérablement réduisant la perte de l’échantillon et permettant l’analyse de lysat pour la protéomique visuel unique cellule.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Utilisation du broyage par faisceau d’ions focalisés pour produire des lamelles vitreuses sur grille à partir d’échantillons biologiques congelés pour la cryotomographie électronique.

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

La demande croissante de collecte de données à grande échelle en tomographie électronique cryogénique nécessite des routines d’acquisition d’images à haut débit. Décrit ici est un protocole qui met en œuvre les développements récents de stratégies d’acquisition avancées visant à maximiser l’efficacité du temps et le débit de la collecte de données tomographiques.

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La détermination de la structure des complexes macromoléculaires à l’aide de cryoEM est devenue une routine pour certaines classes de protéines et de complexes. Ici, ce pipeline est résumé (préparation des échantillons, criblage, acquisition et traitement des données) et les lecteurs sont dirigés vers des ressources et des variables plus détaillées qui peuvent être modifiées dans le cas d’échantillons plus difficiles.

Cryo-microscopie électronique à particule unique : de l’échantillon à la structure

Nous présentons ici un pipeline pour le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélatifs 3D sur le guidage de la préparation d’échantillons cellulaires pour la cryo-tomographie électronique. La position 3D des protéines d’intérêt marquées par fluorescence est d’abord déterminée par cryo-microscopie à fluorescence, puis ciblée pour le broyage. Le protocole convient aux cellules de mammifères, de levures et de bactéries.

Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution

L’objectif de ce protocole est de diriger l’adhésion et la croissance des cellules vers des zones ciblées de grilles pour la cryo-microscopie électronique. Ceci est réalisé en appliquant une couche antisalissure qui est ablation dans des modèles spécifiés par l’utilisateur, suivie d’un dépôt de protéines de matrice extracellulaire dans les zones à motifs avant l’ensemencement cellulaire.

Micromodélisation de microscopie électronique à transmission pour diriger le positionnement des cellules dans les flux de travail de cryo-tomographie électronique à cellules entières

Une puce à micro-motifs nouvellement développée avec des fenêtres en oxyde de graphène est fabriquée en appliquant des techniques de système microélectromécanique, permettant une imagerie efficace et à haut débit par microscopie électronique cryogénique de diverses biomolécules et nanomatériaux.

Fabrication d’une puce à micro-motifs avec épaisseur contrôlée pour la microscopie électronique cryogénique à haut débit

Cette méthode fournit un protocole accessible et flexible pour la préparation de grilles de microscopie électronique (EM) pour la cryotomographie cellulaire in situ et la microscopie optique et électronique corrélative (CLEM).

Préparation d’échantillons pour la cryotomographie in situ de cellules de mammifères

Découvrez la préparation de lamellules de Saccharomyces cerevisiae par cryo-FIB pour la cryo-tomographie électronique. Ce protocole détaillé couvre la culture cellulaire, la vitrification et le micro-usinage pour l'étude structurale in situ.

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

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