Une approche simple pour effectuer des mesures TEER à l'aide d'une Volt-Amperemètre auto-faite avec fréquence de sortie programmable
5 octobre 2019
Ici, nous démontrons comment mettre en place un volt-amperemètre bon marché avec la fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour les mesures de résistance électrique transépithéliale/endothéliale.
La mesure de l’impédance électrique transepitheliale a été utilisée depuis les années 1980 pour déterminer la confluence et la fonction de barrière des monocouches épithéliales dans la culture cellulaire. La technique sous-jacente est une détection à quatre terminaux qui utilise différentes paires d’électrodes de transport de courant et de détection de tension pour effectuer des mesures plus précises. Il existe plusieurs dispositifs disponibles dans le commerce pour mesurer l’impédance transepithelial, mais malgré la facilité d’utilisation et la fiabilité élevée, il ya aussi quelques inconvénients que la fréquence de sortie non traduisible et leur coût.
Ainsi, nous représentons la façon de construire un volt-ammètre rentable et programmable. Dans un premier temps, nous voulons montrer comment fonctionne la mesure TEER avec des appareils disponibles dans le commerce. Pour ce faire, nous avions cultivé une couche cellulaire de cellules de papillome épithélial choroïde plexus sur les filtres Transwell avec une taille poreuse de trois micromètres.
Cet arrangement a été décrit par Schroten et autres comme modèle in vitro de la barrière de fluide sang-céphalo-rachidien. Maintenant, une électrode baguette est reliée à un volt-ammètre épithélial.
L’appareil est allumé et réglé pour mesurer la résistance. L’électrode est stérilisée à 80% d’éthanol et par la suite équilibrée dans un milieu approprié. L’impédance à mesurer servira de valeur de référence afin d’évaluer la fiabilité du volt-ammètre qui sera assemblé par la suite.
Dans cet exemple, nous enrôlés une impedance de 680 ohms. Commençons par l’assemblage d’un volt-ammètre à petit budget avec fréquence de sortie programmable. Tout d’abord, vous aurez besoin d’un chargeur USB standard, et d’une rallonge USB comme alimentation à courant direct de cinq volts.
Un microcontrôleur 8 bits sur une carte de développement USB sera ensuite utilisé pour générer un courant d’onde carrée. Quatre câbles avec bouchons banane sont reliés à deux multimètres standard pour mesurer la tension et le courant. S’il vous plaît assurez-vous que les multimètres sont capables de mesurer le courant dans une gamme de certains microampères avec TrueRMS.
Un connecteur RJ14 femelle peut être trouvé sur les câbles téléphoniques standard. Assurez-vous juste que le connecteur a six broches dont au moins les quatre intérieurs sont câblés. Enfin, vous aurez besoin d’un équipement standard, comme nos câbles, un terminal de lustre, une résistance de 120 kiloohm, et quelques outils comme décapants d’isolation, un outil de sertissage, ferrules d’extrémité de fil, et fer à souder.
L’appareil est assemblé exactement comme illustré dans le diagramme de mise en page. Dans un premier temps, l’extension USB est connectée au microcontrôleur. Pendant le fonctionnement normal, il est alimenté par un chargeur USB DC de cinq volts, qui peut facilement être connecté à un ordinateur personnel pour la programmation.
Deux câbles sont dépouillés et sertis avec des ferrules d’extrémité de fil d’un côté. L’autre côté est soudé soit directement à épingler zéro et deux du microcontrôleur ou à soudé pattes, qui à leur tour sont coupés sur les broches respectives. Ensuite, les câbles de livraison d’énergie sont connectés à un terminal de lustre.
Le premier multimètre sera utilisé pour mesurer le courant et est relié en série avec une résistance de 120 kiloohm et des électrodes de baguette qui passent actuellement. Cet arrangement garantit que le courant de sortie est limité, de sorte que la mesure n’aura aucun impact sur la viabilité des cellules. Les quatre conducteurs de la rallonge téléphonique sont démontés et sertis aux ferrules comme indiqué auparavant.
Une fois le câble préparé, vous devrez tester la continuité des conducteurs et des broches. Dans notre exemple, les broches trois à six sont reliées au conducteur blanc, brun, vert et jaune. Maintenant épingler cinq et six, qui est vert et jaune, sont connectés au terminal lustre pour appliquer la tension à la paire d’électrodes externes.
Enfin, vous devrez connecter le deuxième multimètre, qui sera utilisé pour mesurer la chute de tension transepithelial, aux broches trois et quatre, c’est-à-dire, dans notre exemple, au conducteur blanc et brun. Nous avons décidé de monter l’installation dans un châssis en plastique bon marché. Avant la première utilisation, le microcontrôleur doit être programmé.
Le code source est écrit en C+et peut être téléchargé par USB. En bref, épinglez zéro dans un mode de sortie centrale. Lorsqu’elle est allumée, la boucle de fonction commence à alterner sous forme d’épingles entre le sol et plus cinq volts avec un retard variable.
Dans notre exemple, nous avons utilisé un temps théorique de demi-oscillation de 40 millisecondes. Voyons comment les résultats de mesure se comparent aux valeurs de référence que nous avions obtenues auparavant. L’électrode baguette est repositionnée sur le volt-ammètre récemment assemblé.
L’appareil est alimenté en trois étapes. C’est-à-dire brancher un chargeur USB, passer du multimètre gauche à la mesure de tension AC, et passer du deuxième multimètre au microampère. Attention, cette alternance de courant doit être choisie explicitement.
Dans cet exemple, la baisse potentielle à travers le système de filtre Transwell est mesurée comme environ 25 millivolts, tandis que nous entrons un courant de 37,1 microamperes. Selon la loi d’Ohm, l’impedance électrique peut être facilement calculée à 674 ohms, ce qui est très proche de la valeur de référence de 680. Nous avons montré que les valeurs de mesure sont fiables sur une plage de zéro à 1,8 kiloohms.
Ainsi, le volt-ammètre décrit peut être utilisé à la fois pour des expériences initiales et pour d’autres études. Toutefois, si vos résultats sont publiés, vous voudrez peut-être toujours prendre en charge vos données, en mesurant le flux de molécules à travers la couche cellulaire respective.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode économique pour mesurer l'impédance électrique transepithéliale à l'aide d'un volteamperemètre programmable conçu pour être utilisé avec des électrodes de type baguettes. Cette approche améliore l'accessibilité des mesures de résistance dans les monocouches épithéliales, essentielles pour évaluer la fonction barrière en culture cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Mesures d'impédance électrique
- Évaluation de la fonction barrière
Contexte
- La mesure de l'impédance électrique transepithéliale est utilisée depuis les années 1980 pour évaluer les monocouches épithéliales.
- Les dispositifs standards pour cette mesure peuvent être coûteux et ne pas offrir de fréquences de sortie adaptables.
- Cette étude présente une alternative abordable qui préserve la précision et la fiabilité.
Méthodes utilisées
- Assemblage d'un volteammètre à l'aide de composants électroniques standard.
- Cultures de cellules de papillome épithélial du plexus choroïde sur filtres Transwell en tant que système modèle.
- Mise en œuvre de la détection à quatre bornes pour améliorer la précision des mesures.
Résultats principaux
- Le volteammètre assemblé a fourni des mesures d'impédance fiables, les valeurs mesurées correspondant étroitement aux valeurs de référence.
- Les mesures d'impédance électrique ont présenté un intervalle de fiabilité allant de 0 à 1,8 kiloohms.
- Les résultats des mesures ont validé l'utilité de l'appareil tant pour les expériences initiales que pour des études ultérieures.
Conclusions
- La présente étude démontre une solution réalisable et peu coûteuse pour effectuer des mesures de résistance électrique dans des cultures cellulaires.
- Les résultats sont importants pour faire progresser les techniques de recherche biologique et l'évaluation des propriétés des couches cellulaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Des solutions rentables et programmables de mesure de la résistance transépithéliale (TEER) permettent une évaluation évolutive de la fonction de barrière épithéliale, soutenant la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques en découverte de médicaments. En fournissant des données quantitatives fiables d'impédance, cette approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques des barrières hémato-encéphalique, hémato-encéphalorachidienne, gastro-intestinale et pulmonaire. La méthode facilite le tri du portefeuille en réduisant l'incertitude biologique dans les flux de travail d'identification des candidats prometteurs.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une évaluation quantitative de l'intégrité de la barrière dans des modèles cellulaires pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en corrélant des perturbations génétiques ou pharmacologiques avec des modifications mesurables de la résistance transepithéliale.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant des lectures d'impédance reproductibles et programmables en fréquence, reflétant la formation des jonctions serrées et la santé de la monocouche.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des sorties standardisées et quantitatives pour évaluer les effets de composés sur la fonction barrière dans des formats compatibles avec le criblage à haut débit.
- Valeur opérationnelle : Permet la reproductibilité des tests grâce à une fréquence de sortie programmable et à une détection à quatre bornes, réduisant ainsi la variabilité des mesures entre les expériences.
- Évolutivité : Autorise la réutilisation de la plateforme sur plusieurs lignées cellulaires et formats Transwell en raison d'une conception matérielle peu coûteuse et personnalisable.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les étapes précliniques en fournissant des paramètres de barrière pertinents sur le plan pathologique, prédictifs de la perméabilité in vivo et de l'intégrité tissulaire.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant en identifiant précocement dans le processus les composés susceptibles de perturber la fonction barrière.
- Alignement sur les biomarqueurs : Permet de corréler les variations de la résistance transépithéliale (TEER) avec des biomarqueurs translationnels de la santé épithéliale et de la modulation des jonctions serrées.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés candidats et l'évaluation des barrières précliniques, permettant une progression fondée sur des données relatives à l'intégrité fonctionnelle de l'épithélium.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification des hypothèses et l'élucidation des voies en reliant des interventions génétiques ou pharmacologiques à des modifications mesurables de l'impédance épithéliale.
- Écrans : Offre une prêts des tests et des résultats quantitatifs d'impédance permettant une comparaison fiable des conditions expérimentales à travers des bibliothèques de composés.
- Analytique : Fournit des mesures précises de résistance (plage de 0 à 1,8 kΩ) et des signaux programmables en fréquence qui permettent des comparaisons statistiques et la normalisation des données.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant des systèmes barrières humains (par exemple, barrière sang-liquide céphalorachidien) à l'aide de lignées cellulaires validées.
- Réutilisation institutionnelle : Représente une capacité réutilisable et peu coûteuse d'évaluation de la fonction barrière dans le cadre de multiples projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des mécanismes liés aux barrières.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à une commande programmable de la fréquence et à une architecture de détection à quatre bornes.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'assemblage interne de systèmes fiables de mesure de la résistance transépithéliale (TEER), réduisant ainsi la dépendance aux dispositifs commerciaux coûteux.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire la priorisation ajustée au risque en identifiant précocement les facteurs de risque liés à la perturbation des barrières, atténuant ainsi les risques d'échec en phase avancée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en électronique pour l'assemblage, notamment le soudage, le sertissage et les tests de continuité des câbles et connecteurs personnalisés.
- Suppose l'accès à une carte de développement USB, à un microcontrôleur 8 bits, à des multimètres standards dotés d'une fonction microampère TrueRMS et à une résistance de 120 kΩ pour la limitation du courant.
- Exige une standardisation interéquipes de la préparation des électrodes, de l'équilibrage du milieu et du chronométrage des mesures afin d'assurer la reproductibilité des résultats.
- Requiert l'adaptation des techniques de positionnement et de stabilisation des électrodes en forme de baguettes lorsqu'elles sont appliquées à différentes tailles de pores de Transwell ou à des épaisseurs variables de monocouche cellulaire.
- Limité aux mesures d'impédance dans la plage de 0 à 1,8 kΩ ; les systèmes à résistance plus élevée peuvent nécessiter des ajustements de la résistance de limitation de courant ou du gain de l'amplificateur.
