Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire Drosophila tissus In Situ

L’objectif général de cette procédure est de visualiser ou d’assouvir les tissus en C deux à l’aide de la microscopie à fluorescence après sonication. Pour ce faire, il suffit d’abord de collecter des échantillons d’embryons et de larves, puis de les fixer à l’aide de formaldéhyde, d’heptane et de méthanol. La deuxième étape consiste à sonicer l’échantillon fixé afin de retirer la cuticule pour permettre la pénétration des anticorps.

Ensuite, l’échantillon est immuno-coloré avec des anticorps primaires et secondaires fluorescents. La dernière étape consiste à monter l’échantillon dans une solution Antifa à base de glycérol. En fin de compte, la microscopie confocale ou épi-fluorescente est utilisée pour visualiser le tissu en développement ainsi que l’expression et la localisation des protéines.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que la dissection tissulaire est qu’elle permet de visualiser une variété de tissus en développement. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’étape de sonication dépend d’un certain nombre de facteurs pour atteindre une efficacité maximale, y compris le bon positionnement de la sonde sonique. Ashley Fiddler et Lauren Bole, deux talentueuses chercheuses de premier cycle de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer l’expérience, retirez soigneusement les embryons recueillis sur une plaque de gélose à l’aide d’un petit pinceau associé à un tampon phosphate Triton X 100 ou à une solution PBTX. Ensuite, essuyez le pinceau chargé d’échantillons contre l’arête intérieure d’une crépine de cellule. Placez un couvercle de boîte de Pétri sous la passoire de la cellule.

Rincez ensuite le pinceau et les parois de la passoire cellulaire avec un flacon pulvérisateur contenant du PBTX. Une fois que l’échantillon a été transféré dans la passoire, versez suffisamment de PBTX dans la passoire pour soulever l’échantillon hors du grillage. Répétez cette étape trois fois pour éliminer les levures et les déchets de mouches, retirez le PBTX.

Versez ensuite une solution d’eau de Javel à 50 % dans la passoire et laissez les larves reposer dans la solution pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution. Ensuite, lavez l’échantillon avec du PBTX et laissez-le reposer dans la solution pendant trois minutes.

Répétez l’étape cinq fois, séchez le fond de la passoire cellulaire. Ensuite, à l’aide d’un pinceau marié à du PBTX, transférez l’échantillon dans un flacon à scintillation contenant 1,75 millilitre de pems. Dans une hotte, ajoutez 250 microlitres de formaldéhyde à 37 % et huit millilitres de réactif.

Heptane dans le flacon à scintillation et agitez le flacon à 200 tr/min pendant 20 minutes. Ajoutez ensuite 10 millilitres de méthanol dans le flacon à scintillation sans retirer la phase aqueuse et agitez vigoureusement à 500 tr/min. Après avoir secoué, versez immédiatement le contenu dans une passoire cellulaire au-dessus d’un récipient à déchets liquides.

Ajoutez du méthanol supplémentaire dans le flacon et faites passer le contenu dans la passoire de la cellule. Pour s’assurer que tout l’échantillon a été retiré. Essayez le fond de la passoire cellulaire avec du tissu de laboratoire.

Ensuite, appliquez un pinceau pour transférer l’échantillon de la passoire dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de méthanol. Attendez que l’échantillon se dépose. Ensuite, retirez le méthanol à l’aide d’une pipette et remplacez-le par une aliquote fraîche de 0,5 millilitre de méthanol.

Répétez cette étape trois fois et ajoutez un dernier 0,5 millilitre de méthanol dans le tube avant de le stocker à moins 20 degrés Celsius. Pour plus tard, récupérez l’échantillon stocké dans le congélateur et retirez le méthanol à l’aide d’une pipette. Ajoutez ensuite un millilitre d’une solution de tampon de phosphate de méthanol à 50 % ou de PBTW dans le tube et secouez le tube pendant trois minutes.

Ensuite, rincez l’échantillon avec un millilitre de PBTW deux fois pour laisser l’échantillon se décanter avant de prélever le PBTW avec une pipette, ajoutez 1,0 millilitre de sérum de bovin tamponné au phosphate d’albumine et de BBTW dans le flacon et secouez-le pendant trois minutes. Laissez l’échantillon se déposer et retirez le BBTW à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape deux fois.

En prenant soin d’enlever autant de BBTW que possible sans rien perdre de l’échantillon. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de BBTW dans le tube et placez-le sur de la glace. Ensuite, réglez le sonique sur une amplitude maximale de 10 % et une durée de fonctionnement de deux secondes avec une constante d’expression, nettoyez la sonde de l’ateur en plaçant la pointe de la sonde dans un tube conique de 50 millilitres rempli d’eau déminéralisée et faites fonctionner le sonique.

Séchez ensuite la sonde de sonicate avec un chiffon de laboratoire. Immergez la sonde dans le tube, à trois ou quatre millimètres au-dessus de l’échantillon et lancez la sonication. Retirez ensuite le tube et placez-le sur de la glace pendant 30 secondes pour éviter la surchauffe due à la sonication et permettre à l’échantillon de se déposer au fond du tube.

Répétez cette étape selon l’âge de l’échantillon une fois la sonication terminée. Rincez l’échantillon deux fois avec un millilitre de BBTW. Après chaque rinçage, laissez l’échantillon se déverser avant de sécher BBTW À l’aide d’une pipette, ajoutez un millilitre de BBTW dans le flacon et placez-le sur une bascule.

Après trois minutes, laissez l’échantillon se déposer et retirez le BBTW à l’aide d’une pipette. Ensuite, répétez cette opération. Deuxième étape, bloquez l’échantillon avec 0,5 millilitre de sérum normal à 5 % dilué dans du BBTW dans le tube, et placez l’échantillon sur une bascule pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution d’anticorps primaires et secouez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius, laissez l’échantillon se déposer au fond du tube. Ensuite, prélevez les anticorps primaires à l’aide d’une pipette et rincez deux fois avec un millilitre de BBTW. Ajoutez un millilitre de BBTW dans le flacon, puis placez-le sur une bascule pendant trois minutes.

Retirez ensuite le BBTW à l’aide d’une pipette et répétez l’opération. Pas à pas cinq fois, bloquez l’échantillon avec une solution sérique normale BBTW à 5 % et secouez-le pendant 30 minutes. Retirez ensuite la solution.

Ajouter l’anticorps secondaire dilué à 5 % de solution sérique normale de BBTW et envelopper le tube dans du papier d’aluminium. Ensuite, secouez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Prélevez les anticorps secondaires à l’aide d’une pipette et rincez l’échantillon avec un millilitre de PBTW deux fois.

Ensuite, ajoutez un millilitre de PBTW dans le flacon et placez-le sur une bascule pendant cinq minutes. Laissez ensuite l’échantillon se déposer et retirez le PBTW à l’aide d’une pipette. Répétez cette opération.

Étape trois fois. Ajoutez 80 à 100 microlitres de solution de CO DAB dans le tube et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Enfin, pour monter l’échantillon, utilisez cinq à 10 microlitres de dab BCO p lene diamine, ou PPD anti fade.

Ensuite, visualisez-le avec la microscopie à fluorescence. Ces projections Z de quatre coupes confocales démontrent l’efficacité du protocole pour visualiser les caractéristiques morphologiques ainsi que les cellules individuelles dans C deux de la fin de l’embryon jusqu’au début et au milieu des trois stades du développement de la drosophile. Le développement des testicules est un système particulièrement efficace pour illustrer l’efficacité du protocole, car la maturation des testicules est dynamique tout au long du développement larvaire.

Ces images mettent en évidence les cellules germinales dans les cellules rouges et les cellules centrales et les zones FU dans les coupes confocales simples vertes du milieu L trois cerveaux. Immunocoloration des cellules mères ganglionnaires, neurones indifférenciés en vert et neurones immatures et primaires. En rouge, on observe une forte coloration avec des motifs d’expression distincts dans les lobes cérébraux et le cordon nerveux ventral, en fonction de l’orientation du montage, l’imagerie permet de visualiser le tissu cérébral à partir de la surface dorsale, de la surface ventrale ou en coupe transversale sagittale.

Cette technique in situ deux permet aux biologistes d’explorer le développement des organes dans la morphogenèse des tissus chez les organismes où la cuticule protectrice empêche la pénétration des anticorps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sonicer et d’immunocolorer des échantillons d’œsophage embryonnaire et larvaire à un stade avancé afin de visualiser les tissus en développement en C deux. N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde, de l’heptane et du méthanol peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte.

Le port de gants appropriés et d’une blouse de laboratoire doit toujours être observé lors de l’exécution de cette procédure.