En direct de l'imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

Cette vidéo montre une procédure de montage d’embryons de drosophile pour imager les hémocytes. Leurs macrophages embryonnaires. Les embryons sont pondus par des mouches sur des plaques de gélose au jus de pomme dans une cage de ponte pendant la nuit.

Le lendemain, la plaque agri est retirée et les embryons sont lavés de la plaque agri vers une passoire cellulaire après des lavages supplémentaires pour éliminer les débris. La passoire cellulaire contenant les embryons est immergée dans de l’eau de Javel pour enrober les embryons. Après avoir lavé l’eau de Javel, les embryons sont transférés dans une gouttelette d’eau.

La gouttelette d’eau est ensuite aspirée et les embryons sont recouverts d’huile de carbone. Les embryons correctement stabilisés avec des cytes explosifs visibles sont transférés dans un Petri par membrane entre deux lamelles de recouvrement apposées et soigneusement alignés dans l’huile. Une troisième lamelle est ensuite placée sur les embryons et collée avec du vernis à ongles.

La motilité des hémocytes au sein de l’embryon peut maintenant être imagée à travers la lamelle de couverture supérieure au microscope. Bonjour, je m’appelle Jennifer Zaed et je travaille au laboratoire Brian Strm de la division de location de Séoul et au laboratoire de biophysique moléculaire du Kings College de Londres. Et je suis Ian Evans du Wood Lab du département de biologie et de biochimie de l’Université de Bath.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour monter Josephs bryo sur l’image en direct, le site hhémo, les macrophages embryonnaires de cet organisme. Nous utilisons cette procédure pour étudier la dispersion développementale et la réponse du vent à ces cellules immunitaires importantes et la machinerie cytosquelettique qu’elles utilisent pour mener à bien ces processus. Alors commençons.

Commencez cette procédure en obtenant des lignes OAL TRO appropriées contenant des conducteurs gal quatre spécifiques aux hémocytes et des rapporteurs fluorescents génétiquement codés sous contrôle UAS. Ici, le serpent gal quatre est utilisé pour piloter l’expression d’un marqueur nucléaire rouge fluorescent de l’UAS Red Stinger. Pour une discussion sur la gamme de quatre pilotes GAL recommandés et les constructions UAS, veuillez consulter le protocole écrit ci-joint placer 20 drosophiles de chaque sexe dans une cage de ponte.

La cage de ponte est composée d’une plaque agricole de jus de pomme de 55 millilitres fixée au fond d’un tube en plastique avec de la gaze recouvrant l’autre extrémité pour permettre la circulation de l’air. Alternativement, un simple picer en plastique peut être utilisé avec des trous. En perforant la base, laissez les mouches s’acclimater à la cage de ponte pendant au moins deux jours après s’être acclimatées, passez à une nouvelle grille de jus de pomme préchauffée et laissez les mouches pondre toute la nuit à 25 degrés Celsius.

Pour plus d’informations concernant le prélèvement d’embryons à stades plus discrets, veuillez consulter le protocole écrit ci-joint. Une fois que les mouches ont incubé pendant la durée appropriée pour la ponte, utilisez une bouteille de lavage pour appliquer environ trois millilitres d’eau sur la plaque. Ensuite, à l’aide d’un pinceau à pointe douce, délogez les embryons du jus de pomme, les embryons délogés peuvent être facilement vus à l’œil nu en tenant une passoire cellulaire au-dessus d’un bécher.

Versez l’eau du jus de pomme aate dans la passoire cellulaire pour recueillir les embryons. Ajoutez ensuite plus d’eau au jus de pomme. Aate. Répétez le processus de filtrage jusqu’à ce que le nombre souhaité d’embryons ait été collecté.

Ensuite, à l’aide d’une bouteille de lavage, lavez les embryons dans la passoire cellulaire avec environ 10 millilitres d’eau. Une fois les embryons lavés, placez la passoire cellulaire dans le couvercle du jus de pomme Aerate. Ajoutez suffisamment d’eau de Javel pour suspendre les embryons dans la passoire cellulaire afin de les enrober.

Transférez la passoire cellulaire et le couvercle de la boîte de Pétri dans un microscope de dissection pour suivre la décoration des embryons. Sous un éclairage en fond clair, la décoration est complète lorsque les appendices dorsaux se sont dissous, ce qui devrait se produire dans les deux minutes. Une fois la décoration terminée, retirez la passoire cellulaire contenant les embryons de l’eau de Javel, encore une fois, en tenant la passoire au-dessus d’un bécher.

Utilisez une bouteille de lavage pour laver doucement mais soigneusement l’eau de Javel résiduelle. Appliquez des mouchoirs de laboratoire de couleur bleue sur la face inférieure de la passoire cellulaire pour éponger l’eau restante. Si la couleur bleue passe au blanc ou au rose Il y a de l’eau de Javel résiduelle, continuez à laver en vous assurant que toutes les traces d’eau de Javel ont été éliminées avant de passer à l’étape suivante.

L’élimination de l’excès d’eau de la crépine cellulaire facilite le prélèvement des embryons avec un pinceau à l’étape suivante. Une fois que tout l’eau de Javel a été retirée des embryons, placez une gouttelette d’eau dans un couvercle de boîte de Pétri avec un pinceau fin. Récupérez tous les embryons enrobés de la passoire et mettez-les en suspension dans la gouttelette.

Ensuite, appliquez une lingette chimique à l’extérieur de la passoire cellulaire pour sécher les embryons. Une fois les embryons séchés, ajoutez une goutte d’huile de carbone halo, 700 pour couvrir tous les embryons. Placez ensuite une deuxième petite goutte d’huile à côté de la gouttelette contenant les embryons.

Inspectez les embryons à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente. Identifier les embryons du génotype souhaité à un stade approprié pour imager la migration latérale des cytes. Sur la ligne médiane ventrale.

Choisissez les embryons de stade 13 à 14. Dans cet exemple, les cytes sont identifiés par les noyaux fluorescents et sont visibles dans la tête et le long du cordon nerveux ventral et du vaisseau dorsal en développement pour imager la motilité des hémos après dispersion sur l’embryon, choisissez les embryons de stade 15. À ce stade, les hémos se seront dispersées sur l’ensemble de l’embryon.

Cependant, trois lignes parallèles d’hémos doivent être visibles sur la face ventrale de l’embryon après la migration latérale à partir de la ligne médiane. Une fois les embryons sélectionnés, utilisez une paire de pinces d’horloger incurvées numéro cinq pour prélever les embryons sélectionnés. En prenant soin de ne pas perforer les membranes des flacons.

Placez ensuite les embryons dans la deuxième goutte d’huile sur la face inférieure d’une boîte Petri perm lumax de 50 millimètres. Placez deux petites gouttes d’huile Halo Caron 700 à environ un centimètre l’une de l’autre. Appliquez une lamelle sur chaque goutte sous un éclairage à fond clair sur un microscope à dissection.

Transférez soigneusement jusqu’à 15 embryons à l’aide d’une pince incurvée. Aligner les embryons face ventrale vers le haut et parallèlement au bord de la couverture. Glisse une fois que les embryons sont alignés à une petite goutte d’huile et lui permet de s’étaler pour former une couche homogène entre les deux lamelles.

Une fois que l’huile s’est répandue, cela peut prendre quelques minutes. Vérifiez que les embryons sont toujours ventrals. Côté vers le haut si les embryons ont légèrement roulé.

Repositionnez-les à nouveau avec la pince. Enfin, à l’aide de la pince à épiler numéro trois. Placez une troisième lamelle sur les embryons.

Pontage des deux lamelles précédemment collées. Collez cette lamelle sur la couverture. Supports coulissants à l’aide de vernis à ongles.

Les embryons sont maintenant prêts pour l’imagerie. Cet embryon SRP gal four UAS Red Stinger a été monté ventralement vers le haut et des images en accéléré ont été acquises sur un microscope à dissection fluorescent Leica M 2 0 5. Les cytes sont visualisés par leurs noyaux étiquetés en rouge.

Le film commence aux stades 12 ou 13 du développement, lorsque les cytes quittent la tête et migrent le long de la ligne médiane ventrale. Après environ une heure, les cytes commencent à migrer à partir de la ligne médiane pour se disperser vers des positions latérales le long de la surface ventrale. Pour le reste du développement.

Les hémocytes sont très actifs, migrant dans tout l’embryon. Nous devons vous montrer comment surveiller l’embryon Joseph pour suivre le mouvement ou le côté hémo en direct in vivo. Lors de cette procédure, il est important de manipuler les embryons avec soin, en particulier sur la boîte de pétropermanente, pour éviter de les endommager une fois que les embryons sont dans l’huile, ils sont relativement résistants à la déshydratation, mais il faut veiller à ne pas blanchir les embryons trop longtemps lors du retrait du corion.

Enfin, en montant plusieurs embryons, vous vous donnerez les meilleures chances possibles d’obtenir un embryon dans l’orientation parfaite pour l’imagerie en direct. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.