Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained Tribolium castaneum embryons

L’objectif global de ce protocole est d’observer le développement non invasif des embryons de Tribolium castaneum sur de très longues périodes. La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière aide à répondre aux questions liées à la morphogenèse chez l’organisme modèle d’insecte émergent Tribolium castaneum en abordant les modèles de migration et de prolifération cellulaires du blastoderme précoce au début du mouvement musculaire. Le principal avantage de cette méthode est que les facteurs critiques tels que le photoblanchiment et la phototoxicité sont réduits au minimum, même lorsque les embryons sont observés pendant plusieurs jours.

Pour monter un embryon dans la chambre d’échantillonnage à l’aide d’une colonne d’agarose, remplissez d’abord une seringue d’un millimètre avec de l’eau distillée et utilisez un petit tuyau en caoutchouc pour fixer la seringue à un capillaire en verre. Remplissez le capillaire à moitié avec de l’eau distillée, puis utilisez un pinceau pour transférer un embryon sur la face interne de l’ouverture capillaire en verre, et collez le capillaire dans l’agarose liquide, en attirant lentement quelques microlitres de l’agarose avec l’embryon dans le capillaire. Lorsque l’embryon est en place, il devrait y avoir quelques microlitres d’agarose au-dessus et en dessous de l’embryon.

Lorsque l’agarose s’est solidifiée, raccourcissez le capillaire à une longueur d’environ cinq millimètres. Le fragment restant doit être complètement rempli d’agarose et l’embryon doit se trouver dans le deuxième quartile. Ensuite, insérez le cylindre d’acier avec la goupille dans la chambre d’échantillon et collez le fragment capillaire sur le dessus de la goupille, la colonne d’agarose doit dépasser de quelques millimètres de la région du fragment capillaire qui contient l’embryon.

Pour monter l’embryon dans la chambre d’échantillonnage à l’aide d’un hémisphère d’agarose, prélevez d’abord 200 microlitres d’agarose liquide dans une seringue d’un millimètre et utilisez la seringue pour remplir le tuyau en acier avec la chambre d’échantillon d’agarose par le haut du tuyau jusqu’à ce qu’un hémisphère se forme à l’ouverture inférieure. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, prélevez un embryon avec la pointe d’un pinceau et réarrangez l’embryon de manière à ce que l’extrémité antérieure devienne accessible. Trempez l’hémisphère d’agarose dans de l’agarose liquide pour recouvrir l’hémisphère d’une fine pellicule et placez l’embryon avec son extrémité antérieure à la verticale sur le pôle de l’hémisphère d’agarose.

Tournez le tuyau en acier et utilisez la brosse pour corriger la position de l’embryon si nécessaire. Idéalement, moins de la moitié de la surface de l’embryon devrait être recouverte d’agarose et les flancs devraient être aussi raides que possible. Trop d’agarose à la surface de l’embryon entraîne une constriction mécanique et une réduction des échanges de gaz et d’ions, ce qui a un effet dramatique sur le taux de survie de l’embryon.

Ensuite, insérez lentement le tuyau en acier dans la chambre d’échantillonnage. Pour monter l’embryon dans la chambre d’échantillonnage à l’aide d’un support de toile d’araignée, sélectionnez d’abord un embryon avec le pinceau et mettez le pinceau de côté. Ensuite, couvrez le trou oblong du support de toile d’araignée avec cinq à huit microlitres d’agarose liquide, puis retirez la majeure partie de l’agarose jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine pellicule d’agarose.

Placez l’embryon sur le film d’agarose et ajustez soigneusement sa position, en déplaçant l’embryon vers le centre de l’axe des x du trou oblong et en alignant son axe antérieur et postérieur allongé avec l’axe allongé du trou oblong. Assurez-vous de placer l’embryon sur le film d’agarose dans les 10 à 15 secondes suivant son application, c’est-à-dire pendant que l’agarose est encore liquide, sinon il ne se fixera pas correctement. Ensuite, insérez lentement le support de toile d’araignée dans la chambre d’échantillonnage, en positionnant le support de manière à ce qu’il n’interfère pas avec l’excitation et la lumière d’émission.

Pour les tests d’imagerie en direct, configurez d’abord le time-lapse, puis en mode lumière de transmission, positionnez l’embryon le long des axes X et Y au centre du champ de vision sans exposer l’embryon au laser. Faites pivoter l’embryon à 360 degrés par pas de 90 degrés pour examiner le tissu à la recherche de tout dommage qui aurait pu survenir pendant le processus de montage. En mode florescence, définissez la pile Z pour chaque direction, en ajoutant une zone tampon spatiale de 25 à 50 micromètres devant et derrière l’embryon, et définissez l’espacement Z.

Pour l’imagerie à long terme, assurez-vous que la chambre d’échantillonnage est remplie d’un tampon d’imagerie suffisant et couvrez l’ouverture de la chambre d’échantillon. Ensuite, commencez le processus d’imagerie, en surveillant l’acquisition correcte dans toutes les directions dans tous les canaux pour tous les embryons. À la fin de la période d’imagerie, retirez le porte-échantillon de la chambre d’échantillonnage et transférez l’embryon sur une lame d’objet.

Si une colonne d’agarose a été utilisée, utilisez une lame tranchante pour extraire les embryons de l’agarose environnante. Si un hémisphère d’agarose a été utilisé, transférez l’hémisphère avec un côté plat sur la diapositive de l’objet. Pour la méthode du support de toile d’araignée, utilisez un pinceau pour démonter doucement l’embryon du film d’agarose.

Ensuite, incubez l’objet chargé d’embryons et glissez-le dans un petit plat en verre dans une atmosphère humide saturée dans des conditions standard jusqu’à ce que les larves éclosent. Pour traiter les données de l’embryon observé, ouvrez les fichiers d’intérêt dans le logiciel d’analyse d’imagerie approprié et faites pivoter les Z-Stacks pour aligner l’axe antérieur et postérieur de l’embryon avec l’axe Y si nécessaire. Recadrez les Z-Stacks le long des axes X et Y afin qu’il ne reste qu’un minimum d’arrière-plan, puis calculez la projection maximale Z pour chaque Z-Stack.

Ensuite, en fonction de la lignée transgénique et des modalités d’imagerie, effectuez les ajustements d’intensité dynamique appropriés des piles temporelles pour corriger tout photoblanchiment ou flore pour les fluctuations d’expression si nécessaire. À l’aide d’une lignée transgénique exprimant une protéine de fusion Histone 2B M-Emerald sous le contrôle de l’alpha-tububline un promoteur, 66 heures de développement embryonnaire à température ambiante ont été enregistrées, de la rétraction de la bande germinale à la fermeture dorsale. Cette ligne de piégeage peut être utilisée pour visualiser les grappes neuronales dans les appendices de la tête et la dynamique de la migration des cirrosas pendant la fermeture dorsale.

En imageant une lignée transgénique similaire, qui porte le même transgène mais à un emplacement génomique différent, les coupes optiques de la transition de la gastrulation à l’élongation de la bande germinale montrent l’arrangement cellulaire interne de la bande germinale émergente. En utilisant la lignée transgénique glia-bleue, l’acquisition de Z-Stacks dans plusieurs directions via la rotation de l’échantillon permet d’observer la réorganisation des cellules gliales le long et autour du cordon nerveux ventral ainsi que leur dynamique de prolifération de la face dorsale des lobes de la tête chez le même embryon. De petits colorants fluorescents peuvent également être utilisés pour le marquage spécifique des structures intercellulaires afin de mettre en évidence certaines caractéristiques embryonnaires telles que le gar de la cirrhose, les cellules de cirrhose ventrale postérieure ou la tricouche de tissu de la bande germinale de l’amnion séreuse qui émerge lors de la fermeture de la fenêtre de séreuse.

La coloration fluorescente bicolore permet de visualiser davantage deux structures intercellulaires dans le même embryon. Par exemple, le cytosquelette d’actine et l’enveloppe nucléaire. Une fois l’enregistrement terminé, il est important, pour le contrôle de la qualité de l’expérience, de récupérer les embryons et de les élever jusqu’à ce qu’ils deviennent des adultes sains et fertiles.

Cette procédure peut être combinée avec d’autres techniques telles que la différence d’ARN parental pour analyser les phénotypes renversés.