Quantification et Taille-profilage des vésicules extracellulaires Utilisation accordable résistive Pulse Sensing

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier et de dimensionner le profil des vésicules extracellulaires à l’aide de la détection d’impulsions résistives accordables. L’approche standard consiste à comparer les mesures de blocage actuelles prises à partir de vésicules extracellulaires purifiées avec celles prises à partir d’étalons de billes de polystyrène. Une deuxième approche pour caractériser les vésicules extracellulaires consiste à doper l’échantillon avec des billes de polystyrène, ce qui est utilisé lors du travail avec des échantillons complexes tels que des vésicules extracellulaires non purifiées.

Dans les milieux de culture cellulaire, les données résultantes caractérisent la taille et le nombre des vésicules extracellulaires, qu’elles soient purifiées ou non. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le western blot ou la cytométrie en flux d’ex-vésicules extracellulaires liées à des billes de latex, est que cette méthode caractérise les particules directement dans les fluides biologiques sans qu’il soit nécessaire de les isoler physiquement ou de les étiqueter. En général, les personnes qui ne connaissent pas la méthode auront du mal car les vésicules extracellulaires sont de taille hétérogène.

Lorsque vous essayez de détecter les petites vésicules, les plus grandes vésicules peuvent obstruer le nanopore. Nous avons ajouté quelques trucs et astuces pratiques au protocole pour revenir rapidement à des conditions de travail. Nous avons essayé de réduire la production de vésicules extracellulaires et avions besoin d’une méthode pour quantifier la concentration des vésicules en culture cellulaire. Snet.

À la recherche de méthodes pour caractériser les nanoparticules, nous sommes tombés sur TRPS et avons modifié ses protocoles pour qu’ils soient plus adaptés à la caractérisation des sles et à la culture cellulaire. S surnageants et autres fluides biologiques Commencez par connecter l’instrument TRPS à un ordinateur avec les yeux rivés sur le logiciel de la suite de contrôle installé dessus. Assurez-vous de minimiser les interférences électriques, comme indiqué dans le protocole texte.

Maintenant, choisissez la taille Nanopore. Un NP 100 est le meilleur choix pour les vésicules de 70 à 200 nanomètres, tandis qu’un NP 150 peut être utilisé pour des vésicules de 85 à 300 nanomètres. Un NP 200 est mieux adapté pour mesurer des vésicules de 100 à 400 nanomètres.

Sélectionnez ensuite les particules d’étalonnage de polystyrène complémentaires pour le NP 100 et le NP 150 Sélectionnez les particules d’étalonnage CPC 100 pour le NP 200. Utilisez des particules d’étalonnage CPC 200. Faites vortex les particules d’étalonnage pendant 30 secondes.

S’ils sont toujours agrégés, utilisez la sonication puis diluez les particules d’étalonnage dans le PBS à la concentration cible. Sur la base de la taille des nanopores, le volume final doit être d’au moins 40 microlitres. Mouillez maintenant la cellule inférieure du fluide de l’instrument en appliquant 78 microlitres de PBS et en le retirant immédiatement.

Cela réduit le risque de formation de bulles sous le nanopore. Ensuite, placez le Nanopore dans les bras de l’instrument. Mesurez la distance entre les deux bras opposés à l’aide d’un pied à coulisse numérique.

Entrez cette valeur dans le logiciel sous le champ appelé étirement et une fois saisie, cliquez sur calibrer l’étirement à l’aide de la roue latérale qui contrôle la distance entre les bras opposés. Étirez le nanopore à 47 millimètres. Une fois étiré à la bonne taille, réappliquez 78 microlitres de PBS sur la cellule liquide inférieure.

Commencez le processus d’étalonnage en plaçant la cellule de fluide supérieure sur le nanopore et en fixant la cage de blindage. Ajoutez ensuite 40 microlitres de particules d’étalonnage diluées dans la cellule de fluide supérieure. Appliquez maintenant au moins 0,8 kilopascals de pression positive.

À l’aide du module de pression variable ou VPM, sélectionnez une tension positive et cliquez sur Activer. Ensuite, réduisez lentement l’étirement tout en analysant le blocus. Événements causés par les particules d’étalonnage.

Au fur et à mesure que l’étirement diminue, la hauteur du blocus augmentera progressivement et le rapport signal/bruit s’améliorera ainsi. L’augmentation de la tension peut également augmenter la hauteur du blocus, mais peut également générer plus de bruit RMS. Arrêtez de réduire l’étirement lorsque les blocages observés dépassent de manière appropriée les niveaux de fond indiqués sur le panneau de suivi du signal.

Deuxièmement, observez le taux de particules. Cependant, il y a une limite moins stricte. Le taux de particules doit idéalement être d’au moins 100 par minute.

Cependant, si le taux de particules est supérieur à 2000 par minute, diluez l’échantillon et recalibrez l’instrument. Un taux aussi élevé peut conduire à des mesures imprécises pour cette démonstration. Des vésicules extracellulaires préalablement purifiées d’une lignée cellulaire de tumeur cérébrale sont caractérisées.

Commencez par charger les particules d’étalonnage dans la presse à cellules fluides supérieures. Allumez, puis appliquez une pression à l’aide du VPM et enregistrez au moins 500 particules de données ici. Une pression de 0,8 kilopascal est appliquée.

En option, une mesure multi-pression peut également être effectuée pour ce faire, augmenter la pression appliquée et enregistrer un deuxième fichier d’étalonnage. Les incréments de pression doivent maintenant être d’au moins 0,2 kilopascal, retirer l’échantillon de la cellule supérieure et laver la cellule trois fois avec 100 microlitres de PBS par lavage. Après les lavages, essuyez la cellule supérieure du liquide avec du papier non pelucheux.

Ajoutez ensuite l’échantillon expérimental. Le courant de référence doit être inférieur à 3 % du courant observé lors de la mesure des particules d’étalonnage. Si ce n’est pas le cas, tapotez ou tournez le capuchon de protection, appliquez le piston ou retirez complètement le nanopore et lavez-le avec de l’eau.

Si le courant observé est bon, appliquez exactement les mêmes pressions que celles appliquées aux particules d’étalonnage. Enregistrez ensuite au moins 500 particules et enregistrez le fichier de données. S’il y a une interruption soudaine de la détection de particules, une baisse du courant de base ou une augmentation soudaine du bruit RMS, mettez l’enregistrement en pause et essayez de déboucher le nanopore.

Comme précédemment, pipetez l’échantillon de haut en bas. Tapotez ou tournez le capuchon de protection, appliquez le piston ou retirez complètement le nanopore et lavez-le avec de l’eau DI. Une autre stratégie consiste à augmenter l’étirement des nanopores jusqu’à 47 millimètres et à maximiser la pression du VPM pendant environ cinq minutes.

Comme cela peut également UNC débrancher le NPO dans le logiciel. Accédez à l’onglet Analyser les données et commencez à traiter les données en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’option Fichiers non traités et en sélectionnant l’option Traiter les fichiers. Ensuite, pour coupler l’échantillon et les fichiers d’étalonnage, cochez la case à côté de l’échantillon.

Dans la colonne calibrée, sélectionnez les fichiers correspondants et OK. Les choix. Le logiciel affichera différentes caractéristiques de l’échantillon telles que la taille, la distribution, les durées de base, la pleine largeur, les demi-maximums et l’analyse de la concentration.

L’approche suivante est utilisée pour des échantillons tels que les fluides biologiques qui entraînent un colmatage excessif en utilisant la méthode standard de préparation, centrifuger au moins 50 microlitres de culture cellulaire. Supernageant contenant les vésicules extracellulaires pendant sept minutes à 300 G.Préparez également un milieu de contrôle seul de la même manière pour l’échantillon et le contrôle. Transférez 20 microlitres de surnageant dans de nouveaux tubes et ajoutez 20 microlitres de PBS et 10 microlitres de billes de polystyrène diluées de 335 nanomètres à raison de 10 millions de billes par millilitre.

Installez maintenant l’instrument comme précédemment, à l’aide d’un NP 200 Nanopore et mesurez l’échantillon de contrôle de billes uniquement dans un support. Tout d’abord, pour plus de précision, la détection de fond des petites particules non billes doit être réduite à moins de 10 % des détections de billes. Maintenant, mesurez chaque échantillon une fois avant d’enregistrer les répétitions.

Cela répartira les conditions fluctuantes des nanopores sur les échantillons. Chaque échantillon doit être mesuré trois fois dans toute la finition en mesurant à nouveau l’échantillon de cordon d’étalonnage uniquement. Plus tard. Pendant l’analyse des données, utilisez un tableur pour effectuer des calculs de concentration.

Un exemple de calcul est inclus dans le protocole écrit. Les vésicules extracellulaires ont été purifiées à partir d’une culture cellulaire à trois cellules U 87 M-G-E-G-F-R-V, surnageante par ultracentrifugation, puis mesurées à l’aide du protocole décrit à l’aide de billes d’étalonnage de 115 nanomètres. Une distribution granulométrique pour les vésicules extracellulaires a été obtenue.

Les vésicules extracellulaires ont également été quantifiées directement à partir du surnageant de culture cellulaire de glioblastome, en utilisant l’approche alternative qui enrichit l’échantillon avec un étalon. Deux populations de nanoparticules ont été observées. Les vésicules extracellulaires plus petites et l’étalon connu plus grand, l’estimation de la taille des deux populations basée sur l’étalon connu, ont identifié la population de vésicules comme supérieure à 140 nanomètres.

Des vésicules extracellulaires plus petites ont peut-être été détectées à l’aide d’une ouverture nanoporeuse plus petite, mais il y aurait eu plus de colmatage une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en une à quatre heures selon le nombre d’échantillons analysés. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons peuvent nécessiter des ajustements septaux au protocole.

Par exemple, les échantillons constitués de vésicules plus grandes peuvent nécessiter l’utilisation de nanopores plus grands à un étirement relativement important, et les mesures peuvent également être facilitées en filtrant notre centrifugation des échantillons pour éliminer les débris cellulaires, ce qui peut chronométrer le nanopore. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser les vésicules extracellulaires à l’aide du TRPS. En fonction de votre échantillon de vésicule extracellulaire, vous pouvez appliquer le protocole standard ou utiliser la méthode ajustée du pic d’épilation.