Quantification et Taille-profilage des vésicules extracellulaires Utilisation accordable résistive Pulse Sensing

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier et de déterminer le profil de taille des vésicules extracellulaires à l'aide de la détection résistive ajustable par impulsions. L'approche classique consiste à comparer les mesures de blocage du courant obtenues à partir de vésicules extracellulaires purifiées à celles obtenues à partir d'étalons de billes de polystyrène. Une seconde approche pour caractériser les vésicules extracellulaires consiste à ajouter des billes de polystyrène au prélèvement, méthode utilisée lorsqu'on travaille avec des échantillons complexes tels que des vésicules extracellulaires non purifiées.

Dans le milieu de culture cellulaire, les données obtenues caractérisent la taille et le nombre des vésicules extracellulaires, qu'elles soient purifiées ou non. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le western blot ou la cytométrie en flux de vésicules extracellulaires liées à des billes de latex réside dans sa capacité à caractériser directement les particules dans des fluides biologiques, sans nécessiter d'isolement physique ni d'étiquetage. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car les vésicules extracellulaires sont hétérogènes en taille.

Lorsqu'on tente de détecter les vésicules plus petites, les vésicules plus grandes peuvent obstruer le nanopore. Nous avons ajouté au protocole quelques conseils et astuces pratiques pour revenir rapidement à des conditions exploitables. Nous avons cherché à réduire la production de vésicules extracellulaires et avions besoin d'une méthode pour quantifier la concentration de vésicules dans le milieu de culture Snet.

À la recherche de méthodes permettant de caractériser les nanoparticules, nous avons découvert la TRPS et modifié ses protocoles afin de les rendre plus adaptés à la caractérisation des sles et des cultures cellulaires, ainsi que des surnageants et autres fluides biologiques. Commencez par connecter l'instrument TRPS à un ordinateur sur lequel le logiciel Eyes on Control Suite est installé. Veillez à minimiser les interférences électriques, comme indiqué dans le protocole écrit.

Choisissez maintenant la taille du nanopore. Un NP 100 est le meilleur choix pour les vésicules de 70 à 200 nanomètres, tandis qu'un NP 150 peut être utilisé pour des vésicules de 85 à 300 nanomètres. Un NP 200 est plus adapté à la mesure de vésicules de 100 à 400 nanomètres.

Ensuite, sélectionnez les particules de calibration en polystyrène complémentaires pour le NP 100 et le NP 150, sélectionnez les particules de calibration CPC 100 pour le NP 200. Utilisez les particules de calibration CPC 200. Vortexez les particules de calibration pendant 30 secondes.

S'ils sont encore agrégés, utiliser la sonication, puis diluer les particules d'étalonnage dans du PBS jusqu'à la concentration cible. En fonction de la taille des nanopores, le volume final doit être d'au moins 40 microlitres. Humidifier maintenant la cellule inférieure de l'appareil en appliquant 78 microlitres de PBS, puis retirer immédiatement le liquide.

Cela réduit le risque de formation de bulles sous le nanopore. Ensuite, placer le nanopore dans les deux bras opposés de l'appareil. Mesurer la distance entre les deux bras opposés à l'aide d'un pied à coulisse numérique.

Saisissez cette valeur dans le logiciel dans le champ appelé stretch et, une fois entrée, cliquez sur calibrate stretch à l’aide de la molette latérale qui contrôle la distance entre les bras opposés. Étirez le nanopore jusqu’à 47 millimètres. Une fois la taille atteinte, remettez 78 microlitres de PBS dans la cellule liquide inférieure.

Commencez le processus d'étalonnage en plaçant la cellule fluide supérieure sur le nanopore et en fixant la cage de blindage. Ajoutez ensuite 40 microlitres de particules d'étalonnage diluées dans la cellule fluide supérieure. Appliquez maintenant une pression positive d'au moins 0,8 kilopascal.

À l'aide du module de pression variable (VPM), sélectionnez une tension positive et cliquez sur « allumer ». Ensuite, réduisez lentement l'étirement tout en analysant le blocage. Événements provoqués par les particules d'étalonnage.

À mesure que l'étirement diminue, la hauteur du blocage augmentera progressivement et le rapport signal sur bruit s'améliorera donc. L'augmentation de la tension peut également accroître la hauteur du blocage, mais peut aussi générer davantage de bruit RMS. Cessez de réduire l'étirement lorsque les blocages observés dépassent nettement les niveaux de fond, comme indiqué sur le panneau de tracé du signal.

Deuxièmement, observez le taux de particules. Toutefois, cette limite est moins stricte. Le taux de particules devrait idéalement être d'au moins 100 par minute.

Cependant, si le taux de particules est supérieur à 2000 par minute, diluez l'échantillon et recalculez l'étalonnage de l'appareil. Un taux aussi élevé peut entraîner des mesures inexactes pour cette démonstration. Des vésicules extracellulaires précédemment purifiées provenant d'une lignée cellulaire de tumeur cérébrale sont caractérisées.

Commencez par charger les particules d'étalonnage dans la chambre supérieure de la cellule de fluide. Allumez ensuite l'appareil et appliquez une pression à l'aide du VPM, puis enregistrez au moins 500 particules de données ici. Une pression de 0,8 kilopascal est appliquée.

Éventuellement, une mesure à pression multiple peut également être effectuée pour cela : augmentez la pression appliquée et enregistrez un deuxième fichier d'étalonnage. Les incréments de pression doivent désormais être d'au moins 0,2 kilopascal. Retirez l'échantillon de la cellule supérieure et rincez la cellule trois fois avec 100 microlitres de PBS par rinçage. Après les rinçages, essuyez la cellule fluide supérieure avec du papier sans peluches.

Ajoutez ensuite l'échantillon expérimental. Le courant de base doit se situer à moins de 3 % du courant observé lors de la mesure des particules d'étalonnage. Dans le cas contraire, tapez légèrement ou tournez le capot de blindage, appliquez le piston ou retirez complètement le nanopore et rincez-le avec de l'eau désionisée.

Si le courant observé est satisfaisant, appliquez exactement les mêmes pressions qu'appliquées aux particules d'étalonnage. Ensuite, enregistrez au moins 500 particules et sauvegardez le fichier de données. En cas d'interruption soudaine de la détection des particules, de chute du courant de base ou d'augmentation soudaine du bruit RMS, interrompez l'enregistrement et essayez de déboucher le nanopore.

Comme précédemment, aspirez et expulsez l'échantillon à l'aide de la pipette. Tapez ou tournez le capuchon de protection, appliquez le piston ou retirez complètement le nanopore, puis rincez-le avec de l'eau DI. Une autre stratégie consiste à augmenter l'étirement du nanopore jusqu'à 47 millimètres et à maximiser la pression en provenance du VPM pendant environ cinq minutes.

Cela peut également débrancher le NPO dans le logiciel. Accédez à l'onglet analyser les données et commencez le traitement des données en cliquant avec le bouton droit sur l'option fichiers non traités, puis sélectionnez l'option traiter les fichiers. Ensuite, pour coupler les fichiers d'échantillon et d'étalonnage, cochez la case située à côté de l'échantillon.

Dans la colonne étalonnée, sélectionnez les fichiers correspondants et confirmez. Les choix. Le logiciel affichera différentes caractéristiques de l'échantillon telles que la taille, la distribution, les durées de la ligne de base, la largeur totale, les demi-largeurs à mi-hauteur et les analyses de concentration.

La méthode suivante est utilisée pour des échantillons tels que les fluides biologiques qui entraînent un colmatage excessif avec la méthode standard lors de la préparation : centrifuger au moins 50 microlitres de culture cellulaire. Conserver le surnageant contenant les vésicules extracellulaires pendant sept minutes à 300 G. Préparer également un témoin composé uniquement de milieu, de la même manière, pour l'échantillon et le témoin. Transférer 20 microlitres du surnageant dans de nouveaux tubes et ajouter 20 microlitres de PBS ainsi que 10 microlitres de billes de polystyrène diluées de 335 nanomètres, à une concentration de 10 millions de billes par millilitre.

Maintenant, configurez l'appareil comme précédemment, en utilisant un nanopore NP 200, et mesurez l'échantillon témoin composé uniquement de billes en milieu. Premièrement, pour garantir une bonne précision, la détection du fond diffus d'éléments non sphériques de petite taille doit être réduite à moins de 10 % des détections de billes. Mesurez ensuite chaque échantillon une fois avant d'enregistrer les réplicats.

Cela répartira les conditions variables des nanopores entre les échantillons. Chaque échantillon doit être mesuré trois fois, en terminant par la relecture de l'échantillon contenant uniquement les billes de calibration. Par la suite, lors de l'analyse des données, utilisez un logiciel de tableur pour effectuer les calculs de concentration.

Un exemple de calcul est inclus dans le protocole écrit. Des vésicules extracellulaires ont été purifiées à partir du surnageant de culture cellulaire de U 87 M-G-E-G-F-R-V trois, par ultracentrifugation, puis mesurées à l’aide du protocole décrit en utilisant des billes d’étalonnage de 115 nanomètres. Une distribution de taille des vésicules extracellulaires a été obtenue.

Les vésicules extracellulaires ont également été quantifiées directement à partir du surnageant de culture de cellules de glioblastome, en utilisant l'approche alternative consistant à ajouter un étalon au prélèvement. Deux populations de nanoparticules ont été observées. Les vésicules extracellulaires plus petites et l'étalon connu plus grand ont permis, grâce à l'estimation de la taille des deux populations basée sur l'étalon connu, d'identifier la population de vésicules comme étant supérieure à 140 nanomètres.

De plus petites vésicules extracellulaires auraient pu être détectées à l’aide d’un nanopore à ouverture plus petite, mais cela aurait entraîné davantage d’obstructions. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à quatre heures selon le nombre d’échantillons analysés. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons peuvent nécessiter des ajustements septaux du protocole.

Par exemple, des échantillons composés de vésicules plus grandes peuvent nécessiter l'utilisation de nanopores plus larges à un étirement relativement important, et les mesures peuvent être facilitées par filtration ou centrifugation des échantillons afin d'éliminer les débris cellulaires, qui peuvent obstruer le nanopore. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment caractériser les vésicules extracellulaires à l'aide de la TRPS. Selon votre échantillon de vésicules extracellulaires, vous pouvez appliquer le protocole standard ou utiliser la méthode de dosage ajustée par ajout d'étalon.