Statique Essai d'adhésion pour l'étude de l'intégrine activation dans les lymphocytes T

L’objectif global de cette procédure est de quantifier l’adhésion cellulaire. Pour ce faire, on recouvre d’abord une microplaque de 96 puits de molécules d’adhésion dans la deuxième étape. Les lymphocytes T humains primaires sont isolés du sang et marqués avec CFSE.

Ensuite, les lymphocytes T sont stimulés par des traitements pour affecter leur adhérence. Dans la dernière étape, les cellules traitées sont ajoutées à la microplaque et l’adhésion est autorisée. En fin de compte, la quantité de fluorescence par puits peut être mesurée pour déterminer le pourcentage de cellules adhérentes par condition de traitement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’addition de cellules T au modèle et à l’antérium, est qu’il n’est pas nécessaire de co-cultiver des cellules T et des cellules erl. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : comment des médicaments spécifiques affectent-ils l’adhésion des lymphocytes ? Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie du pied linéaire, elle peut également être appliquée à d’autres cellules de maie telles que les neutrophiles.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes sont difficiles à maîtriser et nécessitent précision et habileté Pour coder une microplaque avec les molécules d’adhésion, commencez par laver 24 puits d’une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de solution de lavage, puis incubez chaque puits à l’exception des puits de contrôle non revêtus avec 50 microlitres de solution de revêtement pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez doucement la solution d’enrobage sans laisser la pointe de la pipette toucher le fond des puits. Ensuite, après avoir lavé les puits avec 50 microlitres supplémentaires de solution de lavage, incubez la microplaque avec 50 microlitres de solution d’adhérence par puits.

Encore une fois, à 37 degrés Celsius. Après une heure, aspirez doucement la solution d’adhésion et lavez à nouveau les puits avec 50 microlitres de solution de lavage Pour isoler les lymphocytes T, mélangez d’abord soigneusement 50 microlitres de cocktail d’enrichissement en lymphocytes T humains pour chaque millilitre de sang total, puis incubez le sang traité pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez six millilitres de sang traité et un volume égal de PBS sans calcium ni magnésium enrichi de glucose à 1 % D dans un tube conique de 50 millilitres à température ambiante et mélangez doucement la solution.

Ajoutez ensuite 15 millilitres de préparation lymphoïque dans un tube conique frais de 50 millilitres et superposez soigneusement leur échantillon de sang dilué sur le milieu d’isolement des lymphocytes. Séparez les couches cellulaires pendant 20 minutes à 400 fois G et 20 degrés Celsius avec la pause. Ensuite, utilisez une pipette à pâte fraîche pour retirer la couche supérieure, en laissant la couche lymphocytaire intacte à l’interface.

Transférez la couche de lymphocytes dans un tube conique frais à l’aide d’une nouvelle pipette pester. Ajoutez neuf millilitres de PBS aux lymphocytes, puis répartissez uniformément les cellules dans toute la suspension en les aspirant doucement vers l’intérieur et l’extérieur. Faites tourner les cellules, puis remettez la pastille en suspension dans le milieu.

Ensuite, versez les cellules dans une fiole de culture T 75. 20 millilitres de milieu de culture pour stimuler les cellules après la période de culture appropriée. Tout d’abord, ajoutez un milieu exempt de sérum à 2,4 fois 10 aux six cellules T, puis affamez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Au bout de deux heures, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension. Dans un millilitre de PBS, étiquetez les cellules avec un marqueur fluorescent dans l’obscurité pendant huit minutes à température ambiante, puis arrêtez la réaction en ajoutant 10 millilitres de PBS à 37 degrés Celsius. Ensuite, après avoir fait tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans 1,2 millilitre de solution d’adhésion préchaude.

Réchauffez la microplaque revêtue à 37 degrés Celsius, puis divisez les cellules en huit aliquotes de 150 microlitres dans 1,5. Les tubes d’un millilitre stimulent un tube avec une PMA à 10 nanogrammes par millilitre pour servir de contrôle positif. Laissez trois tubes non traités pour entretenir le contrôle pour la stimulation, le contrôle de charge non lavé et le contrôle pour ICAM un revêtement et stimulez quatre tubes avec différentes concentrations de trois anticorps anti-CD.

Ensuite, aliquote immédiatement 50 microlitres d’une fois 10 à la cinquième cellules par puits des mélanges de cellules stimulés dans les puits appropriés de la microplaque et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour déterminer d’abord le pourcentage de cellules adhérentes, lavez chaque puits avec 150 microlitres de solution d’adhésion chaude. Agitez doucement la plaque pendant quelques secondes, puis aspirez soigneusement le fluide de chaque puits sans toucher le fond des puits avec les pointes de pipette.

Répétez le lavage trois fois, en changeant l’angle de la pipette à chaque aspiration. Allumez ensuite le lecteur de plaques et ouvrez le logiciel de lecture de plaques dans le menu des tâches. Cliquez sur nouveau pour configurer un nouveau protocole.

Ensuite, dans le menu d’actions, sélectionnez l’option de lecture. Cliquez sur intensité fluorescente et cliquez sur OK. Entrez la longueur d’onde d’excitation comme 485 et la longueur d’onde d’émission comme 528.

Ensuite, dans le menu des options optiques, sélectionnez en bas et cliquez sur OK. Revenez ensuite au menu d’actions et réglez la température sur 37 degrés Celsius et cliquez sur OK. Enfin, chargez la microplaque et cliquez sur Exécuter.

Après avoir exporté les résultats dans une feuille de calcul, utilisez la formule pour calculer le pourcentage de cellules d’adhérence dans ces images. Un exemple de test d’adhésion utilisant des lymphocytes T primaires, stimulés par diverses concentrations d’anticorps anti-CD trois, est présenté. Les cellules non stimulées servent de contrôle négatif.

Les cellules traitées par PMA servent de contrôle positif Pour les anticorps anti CD trois, le tableau affiche les intensités de fluorescence relatives de CFSE. Cellules T primaires marquées stimulées avec différentes doses d’anticorps anti-CD 3 solubles et plaquées sur des puits enrobés IAM un. Pour chaque condition, l’intensité moyenne des puits triples peut être calculée et convertie en pourcentage relatif du total des cellules chargées.

Dans une expérience typique, le pourcentage de cellules adhérentes traitées au PMA est compris entre 40 et 50 %, tandis que le pourcentage de cellules non stimulées est compris entre 5 et 10 %Notez que le pourcentage de cellules d’adhérence augmente à mesure que la concentration d’anticorps anti-CD trois utilisés pour la stimulation augmente. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de mesurer la fluorescence d’un puits non lavé pour déterminer l’entrée de fluorescence.

Une valeur critique dans l’analyse des données. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier l’adhésion cellulaire statique. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sang humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.