Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l'analyse des migrations In Vitro

La migration des lymphocytes T a lieu lors de l'homing vers les organes lymphoïdes, de la sortie du système vasculaire et de l'entrée dans les tissus périphériques. Ce processus implique une interaction adhésive entre la surface du lymphocyte T et d'autres cellules. Pour examiner ce phénomène in vitro, des lymphocytes T humains sont isolés, cultivés puis placés sur des plaques de culture recouvertes d'une protéine adhésive.

ICAM-1 et chimioattractant SDF-1. Des images de la migration des lymphocytes T peuvent ensuite être acquises et analysées. Bonjour, je suis Craig LeFort, du laboratoire de Minsu Kim au Centre de biologie vaccinale et d'immunologie de l'Université de Rochester.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement et de culture de lymphocytes humains de jeunes, ainsi qu'une analyse de leur migration in vitro. Nous utilisons cet essai dans notre laboratoire pour étudier le rôle des intégrines et de la migration des lymphocytes T. L'intégrine majeure dans les lymphocytes T est l'antigène associé à la fonction lymphocytaire un, ou LFA-1.

Les ligands spécifiques de LFA-1 sont les ICAM, comme ICAM-1. En outre, un signal cinétique est nécessaire pour la migration des lymphocytes T afin de fournir à la fois un signal de directionnalité et d'activer les intégrines. Dans notre test, nous utilisons l'ICAM-1 humain et le CXCL12 ou SDF-1 comme substrats pour la migration des lymphocytes T.

Commençons. Après avoir obtenu du sang humain auprès d'un donneur sain, laissez le sang refroidir à température ambiante. Cette étape prend environ 30 minutes.

Une fois le sang refroidi, pipetez délicatement trois millilitres de milieu de gradient de densité pour polynucléaires à température ambiante dans un tube en polystyrène de huit millilitres à fond rond. Ajoutez ensuite délicatement trois millilitres de sang total par-dessus. Il est important d'éviter tout mélange.

Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 500 G pendant 45 minutes. À température ambiante, après la centrifugation, les cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMC ont été séparées des autres composants sanguins. La couche de PBMC apparaît comme la première bande trouble en partant du haut.

Dans des conditions stériles, retirez et jetez soigneusement la phase supérieure de couleur jaune clair. Ensuite, utilisez une micropipette P 1000 pour transférer la couche de PBMC dans un nouveau tube conique. Lavez les PBMC deux fois avec du PBS en centrifugeant les cellules à 500 G pendant cinq minutes.

À chaque fois, le surnageant sera légèrement trouble après chaque lavage. Ressuspendre les cellules dans 20 millilitres de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et un microgramme par millilitre de phytohémagglutinine ou PHA. L'incubation en présence de PHA induit l'activation et l'expansion des lymphocytes T.

À l’aide d’une pipette, transférez les PBMC dans un flacon de culture T 75. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une à 24 heures. Cette étape permet de séparer les monocytes, qui adhèrent à la surface du flacon, des lymphocytes qui restent en suspension.

Après l'incubation, retirez soigneusement tout le milieu contenant principalement des lymphocytes et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez à 500 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez le culot cellulaire dans du RPMI 1640 et transférez les cellules dans un nouveau flacon T75 contenant 25 millilitres de RPMI 1640 supplémenté de FBS, de pénicilline, de streptomycine et de PHA, puis incubez à 37 °C.

Après 24 heures de croissance, il peut être nécessaire d'ajouter de 15 à 20 millilitres de milieu frais et de transférer la culture dans un flacon T 1 75 plus grand. Poursuivre l'incubation pendant trois jours ou deux jours. Si l'incubation initiale des PBMC a duré toute une nuit après trois jours, utiliser une pipette pour retirer le milieu, qui contiendra les lymphocytes en suspension, puis le transférer dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger à 500 G pendant cinq minutes.

Reese a été le culot cellulaire et a transféré les cellules dans un nouveau flacon T 75 contenant 25 millilitres de RPMI 1640. Avec du FBS, de la pénicilline, de la streptomycine et de l'IL humaine deux ou de l'IL 15, placer les cellules dans l'incubateur. Si l'on démarre un flacon T 75, la culture devra être agrandie et transférée dans un flacon T 175.

Après un à deux jours, faire pousser les lymphocytes pendant un total de quatre à sept jours. Un jour avant le test de migration, recouvrir le fond en verre d'une boîte de 0,17 millimètre avec 20 microgrammes par millilitre de protéine A ou G dans du PBS, puis incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Laver abondamment la boîte avec du PBS, puis ajouter dans la boîte la solution de ICAM un FC et de SD F1 humain dans du PBS.

Incuber pendant quatre heures à température ambiante pour immobiliser les molécules. Déterminer la densité des cellules cultivées à l’aide d’un cytomètre hématique. Puis laver les lymphocytes deux fois avec du PBS et les resuspendre dans un millilitre de milieu L 15 contenant du D-glucose. Après l’incubation, laver soigneusement la boîte revêtue avec ICAM un FC et SDF un à l’aide de PBS. Transférer les lymphocytes T dans un millilitre de milieu vers la boîte ; environ deux à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules doivent être utilisées par boîte afin d’obtenir une densité cellulaire appropriée pour l’analyse de la migration.

Pour obtenir des images de migration cellulaire, placez la boîte sur la platine du microscope dans un environnement contrôlé en température, comme une chambre chauffée à 37 degrés Celsius. Ouvrez le logiciel NIS Elements dans le menu des paramètres d'image. Choisissez un binning 2 par 2 comme mode pour l'acquisition d'images en direct et la capture d'images.

Allez dans le menu des applications et choisissez définir, exécuter, expérimenter. Sélectionnez la durée entre les images et la durée totale. Pour la séquence de capture d'images, appuyez sur le bouton exécuter pour démarrer l'acquisition d'images après la configuration.

Les paramètres de migration, tels que la vitesse, la longueur du trajet et le déplacement, peuvent être quantifiés à l'aide d'un logiciel comme Image J Auto Quant ou veloc. Pour générer un graphique en toile d'araignée, recueillez les coordonnées XY de chaque cellule et de chaque point temporel, puis projetez-les sur un graphique en prenant comme point de départ commun pour chaque cellule l'origine. Les lymphocytes T présentés ici ont été cultivés sur ICAM et SDF-1 et observés toutes les 10 secondes pendant 30 minutes.

Ce film montre la migration aléatoire de lymphocytes T à une vitesse d'environ 15 micromètres par minute, en utilisant les coordonnées XYT pour chaque cellule. Quinze cellules ont été choisies au hasard et tracées à partir d'un point de départ commun à l'origine. La comparaison de graphiques en toile d'araignée permet une représentation visuelle rapide des différences de migration entre différentes conditions expérimentales.

Les graphiques représentant la migration des lymphocytes T dans des conditions de contrôle sont présentés à gauche, tandis que les graphiques représentant la migration des lymphocytes T en présence d'un anticorps bloquant le ligand de LFA un sont présentés à droite. Ces données démontrent que les lymphocytes T utilisent l'intégrine LFA un pour migrer sur un substrat d'ICAM un. Nous venons de vous montrer comment réaliser un test de migration en utilisant des lymphocytes T humains cultivés au cours de la procédure.

Il est important de se souvenir d'ajouter un nombre approprié de cellules dans la boîte revêtue de ICAM-1 afin de simplifier le suivi cellulaire et l'analyse de la migration. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.