Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l'analyse des migrations In Vitro

La migration des lymphocytes T se produit lors de la transmission vers les organes lymphoïdes, de la sortie du système vasculaire et de l’entrée dans les tissus périphériques. Ce processus implique l’interaction adhésive de la surface des cellules T avec d’autres cellules. Pour examiner ce phénomène in vitro, les lymphocytes T humains sont isolés, cultivés et placés sur des plaques de culture tissulaire recouvertes de la protéine adhésive.

ICAM un et chimiokine SDF un. Des images de la migration des lymphocytes T peuvent ensuite être acquises et analysées. Bonjour, je m’appelle Craig LeFort et je travaille dans le laboratoire de Minsu Kim au Center for Vaccine Biology and Immunology de l’Université de Rochester.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’isolement et de culture de lymphocytes humains d’adolescents, une analyse de leur migration in vitro. Nous utilisons ce test dans notre laboratoire pour étudier le rôle des intégrines et de la migration des lymphocytes T. L’intégrine majeure dans les lymphocytes T est l’antigène associé à la fonction lymphocytaire un ou LFA un.

Les ligands spécifiques pour LFA one sont les icas, tels que ICAM. De plus, un signal de parenté est nécessaire pour que la migration des lymphocytes T fournisse à la fois un signal de directionnalité et pour activer les intégrines. Dans notre test, nous utilisons ICAM one humain et CX CL 12 ou SDF one comme substrats pour la migration des lymphocytes T.

Alors commençons. Après avoir obtenu du sang humain d’un donneur sain, laissez le sang refroidir à température ambiante. Cela prend environ 30 minutes.

Une fois le sang refroidi, pipetez doucement trois millilitres de milieu à gradient de densité polymorphe à température ambiante dans un tube en polystyrène à fond rond de huit millilitres. Ajoutez ensuite doucement trois millilitres de sang total sur le dessus. Il est important d’éviter tout mélange.

Placez les tubes dans une centrifugeuse et faites-les tourner à 500 G pendant 45 minutes. À température ambiante après la centrifugation, les cellules mononucléées du sang périphérique ou P BMC ont été séparées des autres composants sanguins. La couche PBMC apparaît comme la première bande nuageuse à partir du haut.

Dans des conditions stériles, retirez et jetez soigneusement la phase supérieure de couleur jaune clair. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette P 1000, transférez la couche PBMC dans un nouveau tube conique. Lavez le PBMC deux fois avec des cellules de centrifugation PBS à 500 G pendant cinq minutes.

À chaque fois, le surnageant sera un peu trouble après chaque lavage. Mettez les cellules en suspension dans 20 millilitres de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline streptomycine et un microgramme par millilitre. L’incubation de la phytohémagglutinine ou PHA en présence de PHA induit l’activation et l’expansion des lymphocytes T.

À l’aide d’une pipette, transférez le pbmc dans une fiole de culture T 75. Ensuite, incubé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une à 24 heures. Cette étape permet de séparer les monocytes, qui vont adhérer à la surface du ballon, des lymphocytes qui restent en suspension.

Après l’incubation, retirez soigneusement tout le milieu qui contient principalement des lymphocytes et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger à 500 G pendant cinq minutes. Reese a été la pastille cellulaire dans RPMI 1640 et a transféré les cellules dans un nouveau flaz T 75 contenant 25 millilitres de RPMI 1640 avec FBS, pénicilline, streptomycine et PHA incubés à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures de croissance, il peut être nécessaire d’ajouter 15 à 20 millilitres de milieu frais et de transférer dans une fiole T 1 75 plus grande. Continuez à incuber pendant trois jours ou deux jours. Si l’incubation initiale de PBMC a duré la nuit après trois jours, utilisez une pipette pour retirer le milieu, qui contiendra des lymphocytes en suspension, et transférez-le dans une centrifugeuse à tube conique de 50 millilitres à 500 G pendant cinq minutes.

Reese a été la pastille cellulaire et a transféré les cellules dans un nouveau T 75 contenant 25 millilitres de RPMI 1640. Avec le FBS, la pénicilline, la streptomycine et l’IL 2 ou l’IL 15 humain placent les cellules dans l’incubateur. Si l’on commence dans une fiole T 75, la culture devra être élargie et transférée dans une fiole T 1 75.

Après un à deux jours, les lymphocytes se développent pendant un total de quatre à sept jours. Un jour avant l’essai de migration, enrobez une boîte de 0,17 millimètre à fond de verre avec 20 microgrammes par millilitre de protéine A ou G dans du PBS incubée pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Lavez abondamment le plat avec du PBS, puis ajoutez ICAM one FC et du SD humain F1 dans une solution PBS dans le plat.

Incuber pendant quatre heures à température ambiante pour immobiliser les molécules. Déterminer la densité des cellules cultivées à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, lavez les lymphocytes deux fois avec du PBS et mettez-les en suspension dans un millilitre de milieu L 15 contenant du glucose D après l’incubation, lavez la boîte enrobée avec ICAM un FC et SDF un largement avec du PBS transférez les lymphocytes T dans un millilitre de milieu dans la boîte, environ deux à cinq fois 10 à la cinquième cellule doit être utilisé par boîte pour obtenir une densité cellulaire appropriée pour l’analyse de migration.

Pour obtenir des images de la migration cellulaire, placez la parabole sur la platine du microscope dans un environnement à température contrôlée, tel qu’une chambre chauffée à 37 degrés Celsius. Ouvrez le logiciel NIS elements dans le menu des paramètres d’image. Choisissez le binning deux par deux comme mode pour l’imagerie en direct et la capture d’images.

Allez dans le menu des applications et choisissez, définir, exécuter, expérimenter. Choisissez la durée entre les images et le temps total. Pour la séquence de capture d’image, appuyez sur le bouton d’exécution pour commencer l’acquisition d’image après l’acquisition.

Les paramètres de migration tels que la vitesse, la longueur du trajet et le déplacement peuvent être quantifiés à l’aide d’un progiciel tel que Image J, Auto Quant ou veloc. Pour générer un graphique en toile d’araignée, collectez les coordonnées XY de chaque cellule et point temporel et projetez-les sur un graphique avec un point de départ commun pour chaque cellule à l’origine. Les lymphocytes T montrés ici ont été mis en culture sur ICAM et SDF one et imagés toutes les 10 secondes pendant 30 minutes.

Cette vidéo montre la migration aléatoire des lymphocytes T à une vitesse d’environ 15 microns par minute en utilisant les coordonnées XYT de chaque cellule. 15 cellules ont été choisies au hasard et tracées avec un point de départ commun à l’origine. La comparaison des tracés en toile d’araignée donne une représentation visuelle rapide des différences de migration entre différentes conditions expérimentales.

Les graphiques de migration des lymphocytes T dans des conditions de contrôle sont présentés à gauche, tandis que les graphiques de migration des lymphocytes T en présence d’un anticorps bloquant un ligand anti-LFA sont présentés à droite. Ces données démontrent que les lymphocytes T utilisent l’intégrine LFA one pour migrer sur un substrat ICAM one. Nous venons de vous montrer comment effectuer un test de migration en utilisant des lymphocytes T humains en culture au cours de la procédure.

Il est important de ne pas oublier d’ajouter un nombre approprié de cellules à la parabole ICAM afin de simplifier le suivi des cellules et l’analyse de la migration. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.