Name: Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules dadhésion cellulaire putatif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez une méthode rapide pour caractériser les propriétés adhésives des molécules d'adhésion cellulaire en utilisant des essais d'agrégation de billes. Cette technique capture les ectodomaines sur des billes magnétiques pour évaluer l'adhésion homophile.

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Ce travail a été soutenu par une bourse NSF/ARRA (IOS 0920357) et une bourse du NIH (5R21MH098463).

1 Préparation des cellules (J-2 à 0) <ol><li> Fractionner les cellules HEK293 1: 5 en utilisant 0,05% de solution de trypsine-EDTA et incuber à la croissance des médias à 37 ° C avec 5% de CO 2 jusqu&#39;à 60 ans - 80% de confluence (2 - 3 jours). Pour chaque condition, les cellules en culture dans 2 x boîtes de 100 mm. </li></ol> 2. transfection des cellules (Jour 1) <ol><li> Transfecter des cellules HEK293 avec le plasmide codant pour la Fc-fusion en utilisant un réactif de transfection, tels que la lipofectamine. D&#39;autres méthodes qui conduisent à des efficacités de transfection comparables peuvent également être utilisés. </li><li> Retour cellules transfectées à l&#39;incubateur pendant 24 heures. </li></ol> 3. cellulaire propagation (Jour 2) <ol><li> Préchauffer milieux de croissance sans sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C. </li><li> Rincer la vaisselle 2x avec 10 ml de croissance médias FBS, et renvoient les plats à la 37 ° C incubateur pendant 1 heure. </li><li> Rincer la cultures des plats une fois de plus avec 10 ml de croissance médias FBS, pour un total de 3 lavages. </li><li> Incubate les cellules HEK 293 transfectées à 37 ° C pendant 48 heures sans autre FBS avant de recueillir médias. </li></ol> 4 perles d&#39;agrégation (Jour 4) <ol><li> Pour recueillir des médias de boîtes de culture, de transférer les médias de chaque paire de plats à 50 ml tubes coniques et rotation à 500 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires. </li><li> Les milieux filtrants de 50 ml tube conique dans un filtre centrifuge utilisant une seringue de 30 ml et de 0,45 um filtre de la seringue. </li><li> Spin filtres centrifuges à 4000 x g et 4 ° C jusqu&#39;à ce que le volume de milieu de culture concentré est d&#39;environ 500 pl (environ 15 min). Répétez jusqu&#39;à ce que tous les supports de culture a été ajouté et concentré. </li><li> Ajouter 1,5 ul de billes magnétiques protéines G à 1 ml de glace froide Binding Buffer dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon, les placer sur un aimant et éliminer le tampon. Immédiatement ajouter au milieu de culture concentré de la protéine G des billes magnétiques. </li><li> Faire tourner les tubes à 4 ° C pendant 2 heures. </li><li> Pltubes ace sur un aimant et supprimer médias. Laver rapidement perles deux fois avec le froid de la glace 1 ml Binding Buffer, puis remettre en suspension des billes dans 300 pi Binding Buffer. </li><li> De Split remis en suspension dans 2 perles tubes, 150 pi dans chaque tube, puis ajouter 1,5 pi de mM CaCl 2 ou 200 200 mM EDTA pour le &quot;calcium&quot; et les conditions &quot;pas de calcium&quot;, respectivement. </li><li> Transfert 100 pi de chaque condition à une dépression bien glisser et de recueillir des micrographies au microscope lumière transmise (figure 2). Recueillir des images à partir de 5 champs de vision pour chaque expérience à chaque point de temps souhaité. </li></ol> Analyse 5. données <ol><li> ImageJ, ou logiciel d&#39;analyse d&#39;image comparable, ouvrez l&#39;un des cinq ensembles de données d&#39;image en utilisant le / séquence d&#39;images Importer ... dans le menu déroulant Fichier. Ceux-ci seront ouverts comme une pile d&#39;images. </li><li> Dans la boîte de dialogue ... image / Propriétés, modifiez la iunités de mage à pixels et mis Largeur Pixel et Hauteur de pixel à 1,0. </li><li> Convertir les images en binaire utilisant le / Seuil Ajustez ... de commande dans le menu déroulant Image. Régler le seuil pour inclure pixels qui contribuent à des billes ou des agrégats de perles, mais qui excluent fond et de petites particules. Appliquer à toutes les images de la pile. </li><li> Dans la boîte de dialogue de mesures Set, cochez les cases de la région et la pile de position. </li><li> Exécutez analyser des particules ... dans le menu déroulant Analyser. Cela va générer une liste de particules identifiées, notamment leur taille (région) et l&#39;image dans laquelle ils ont été identifiés. </li><li> Répétez ce processus pour que l&#39;expérience et l&#39;état expérimental. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;adhésion cellulaire est un élément essentiel de la vie multicellulaire et est médiée par une large gamme de protéines de la surface cellulaire. Parmi ceux-ci, les propriétés adhésives détaillées sont comprises que pour une part relativement faible. Ici, nous avons décrit un protocole simple et rapide pour enquêter sur la capacité adhésive homophile de ectodomaines sécrétées fusionnées à une étiquette d&#39;épitope pratique. Cette approche a un certain nombre d&#39;avantages importants. Premièrement, des lignées ce...

L&#39;adhérence cellule-cellule est essentielle pour le développement et l&#39;intégrité des organismes multicellulaires et est médiée par une grande diversité de molécules de la surface cellulaire. Beaucoup de ces molécules d&#39;adhésion ont été identifiés et caractérisés, mais beaucoup restent à découvrir. Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier les propriétés des molécules d&#39;adhésion cellulaire (CAM), y compris le tri cellulaires essais, des tests d&#39;agrégation de cellules 1-8 et méthodes biophysiques, comme la microscopie à force atomique et la surface spectroscopie de force 9-12. La complexité de la même simplifié dans des systèmes in vitro utilisant des lignées cellulaires, il est difficile de déterminer les propriétés adhésives d&#39;une CAM putatif. Typiquement, une molécule est considérée comme une CAM si elle induit une agrégation cellulaire lorsqu&#39;il est transfecté dans une lignée cellulaire non-adhésif. Toutefois, il est clair qu&#39;il ne s&#39;agit pas de preuve directe de l&#39;activité de l&#39;adhésif. Par exemple, faciliter la distribution de surface de la cellule ou de la stabilité d&#39;unCAM se traduirait également par l&#39;agrégation cellulaire accrue 1,13. De plus, un vrai CAM peut échouer la médiation agrégation cellulaire si la lignée cellulaire n&#39;a pas d&#39;autres co-facteurs nécessaires pour la livraison de la surface cellulaire ou de stabilisation. Pour éviter ces facteurs de risque, des tests plus directs peuvent être employées qui sont fondées sur l&#39;idée que les interactions adhésives doivent être une propriété intrinsèque biochimique du domaine extracellulaire. Alors que les perles étaient initialement utilisés pour caractériser Ng-CAM 2, ces essais ont été étendus afin d&#39;enquêter sur la cadhérine-médiation adhérence 12,14,15. Utilisation de fusion des fusions C-cadhérine ectodomaine-Fc, le laboratoire a montré que Gumbiner multiples répétitions de cadhérine contribuent à des interactions homophiles 14. En utilisant des tests d&#39;agrégation de perles comparables, la E-cadhérine et la N-cadhérine adhésion ont également été caractérisé 12,15, comme l&#39;ont fait un certain nombre de PROTOCADHERINES 1,15-18 et isoformes DSCAM de Drosophila <em&gt; 19. Nous décrivons ici un test relativement simple et rapide pour la caractérisation de l&#39;activité adhésive de sécrétées, ectodomaines de marquage épitopique de cames de homophiles putatifs (figure 1). Nous avons utilisé ce test essentiellement de caractériser les membres de la superfamille des cadhérines.

<table><tbody><tr><td>plasmide pFc-N1</td><td>Addgene</td><td>À soumettre</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash ; Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Lames de dépression</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 avec membrane Ultracel-10</td> Filtre à seringue <td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Logiciel d’analyse</td> <td>d’images<a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table des tampons/solutions</td></tr><tr><td>Médias de croissance</td><td>DMEM + 10 % FBS + Pen-Strep</td><td>Filtre stériliser et stocker à 4 &deg ;C.</td><td></td></tr><tr><td>Médias de croissance &ndash ; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filter stérilisent et stockent à 4 &deg ;C.</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de liaison</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2 % BSA</td><td>Vortex jusqu’à dissolution, conserver sur de la glace.</td><td></td></tr></tbody></table>

perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

L&#39;adhérence cellule-cellule est essentielle à la vie multicellulaire et est médiée par une grande diversité de protéines de la surface cellulaire. Cependant, les interactions adhésives pour un grand nombre de ces protéines sont mal compris. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives des homophiles des molécules d&#39;adhésion cellulaire putatifs. De culture des cellules HEK293 sont transfectées avec l&#39;ADN plasmidique codant pour une sécrétion, un ectodomaine d&#39;une étiquette d&#39;épitope d&#39;une protéine de surface cellulaire. Utilisation de billes fonctionnalisées spécifiques pour le marqueur d&#39;epitope, le soluble, la protéine de fusion sécrétée est capturé à partir du milieu de culture. Les billes enrobées peuvent alors être utilisés directement dans des tests d&#39;agrégation billes ou à bille fluorescente tri dosages pour tester l&#39;adhérence homophile. Si on le souhaite, la mutagenèse peut être utilisée pour élucider les acides aminés ou domaines spécifiques nécessaires pour l&#39;adhérence. Ce dosage ne nécessite que de petites quantités de protéine exprimée, ne nécessite pas la production de lignées cellulaires stables, et peut être accomplished à 4 jours.

Une expérience d'exemple est présenté sur la figure 2, qui représente l'agrégation des billes de calcium-dépendante par l'ectodomaine de la N-cadhérine fusionné à Fc (NcadEC-Fc). En l'absence de calcium, les perles présentent peu ou pas de tendance à l'agrégation et il n'y a pas d'augmentation de la taille des agrégats avec le temps (Figure 1A, C). En présence de calcium, des perles revêtues d'NcadEC-Fc montrent une agrégation solide, avec la taille des agrégats de plus en plus au cours...

Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives intrinsèques des molécules d’adhésion cellulaire présumées. L’ectodomaine sécrété, marqué par un épitope, d’une molécule d’adhésion cellulaire est capturé à partir du milieu de culture sur de petites billes fonctionnalisées uniformes. Ces billes peuvent ensuite être utilisées immédiatement dans des tests simples d’agrégation de billes.

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

L’objectif global de cette procédure est de tester la capacité des domaines ecto protéiques à médier l’adhésion homophile pour réaliser que les plasmides codant pour la fusion d’un fragment de domaine ecto à la région FC des IgG humaines sont transfectés dans les cellules HEC 2 93. Les protéines de fusion Odin FC sécrétées sont capturées sur des billes magnétiques conjuguées à la protéine G, et après un lavage, les billes enrobées sont autorisées à interagir en solution. Les billes enrobées sont ensuite imagées pour évaluer l’étendue de l’agrégation et enfin, quantifiées À l’aide d’une simple analyse d’image, les données résultantes révèlent si la protéine sous-étudiée est capable de médier l’adhésion homophile.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests d’agrégation cellulaire est qu’elle est rapide, simple et teste directement l’activité adhésive de la protéine choisie. La démonstration de cette technique sera assurée par le Dr Michelle Eman, scientifique principale du laboratoire. Commencez cette procédure en préparant les cellules cultivées pour l’ACN ici ECFC, deux à trois jours avant la transfection.Utilisez 0,05 % de déclenchements dans l’EDTA pour détacher les cellules HEC 2 93 des boîtes de culture. Préparez deux plats de 100 millimètres pour chaque condition. Divisez les cellules de une à cinq, puis cultivez-les.Milieu de croissance supplémenté. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 60 à 80 %. Le jour de la transfection, utilisez un réactif tel que lipo pour introduire un plasmide codant pour la fusion FC.Après la transfection, retournez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures le lendemain de la transfection Préchaud, DMEM avec streptocoque refoulé et sans sérum fœtal bovin à 37 degrés Celsius. Rincez chaque plat deux fois avec 10 millilitres de milieu réchauffé, puis remettez les plats dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure après l’incubation, rincez les plats de culture une fois de plus avec 10 millilitres de DMEM sans sérum de veau fœtal pour un total de trois lavages, puis incubez les cellules transectées à 37 degrés Celsius pendant encore 48 heures avant de recueillir le milieu. Quatre jours après la transfection, à l’aide d’une pipette sérologique, prélever le milieu de chaque paire de boîtes de culture et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, centrifugez le milieu à 500 G par cinq minutes pour granuler les débris cellulaires après l’essorage, versez le milieu de chaque tube conique de 50 millilitres dans une seringue de 30 millilitres et filtrez-le à travers une seringue de 0,45 micron. Filtrer dans un concentrateur centrifuge. Faites tourner les filtres centrifuges jusqu’à ce que le volume de milieu de culture concentré soit réduit à environ 500 microlitres.Cela prend environ 15 minutes. Répétez ce processus jusqu’à ce que tout le milieu de culture ait été ajouté et concentré. Ensuite, dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre pour chaque échantillon, à 1,5 microlitre de billes magnétiques de protéine G pour un millilitre de tampon de liaison glacé.L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’agrégation des billes. Pour garantir le succès, assurez-vous de suivre exactement la procédure. Surveillez les perles rapidement, mais pas trop durement.Il ne faut jamais les laisser sécher sur le côté du tube ou rester trop longtemps sur l’aimant. Placez le tube sur un aimant et à l’aide d’une pipette, aspirez le tampon. Ajoutez ensuite immédiatement le milieu de culture concentré aux billes magnétiques de la protéine G.Faites pivoter les tubes à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Placez les tubes sur un aimant et retirez rapidement le fluide. Lavez les billes deux fois avec un millilitre de tampon de liaison glacé, puis remettez les billes en suspension dans 300 microlitres de tampon de liaison.Divisez les billes remises en suspension en deux tubes de 150 microlitres dans chaque tube. Ajoutez ensuite 1,5 microlitre de chlorure de calcium ou EDTA pour les conditions de calcium et d’absence de calcium respectivement. Transférez 100 microlitres de chaque condition à une dépression.Lame de puits à l’aide d’un microscope à lumière transmise. Collectez des images à partir de cinq champs de vision pour chaque expérience à chaque point temporel souhaité. À l’aide de l’image J ou d’un logiciel d’analyse d’images comparable.Ouvrez l’un des cinq ensembles de données d’image de l’image J dans le menu déroulant. En haut de l’écran, sélectionnez fichier. Sélectionnez ensuite importer, puis séquence d’images.Recherchez le dossier contenant les fichiers image, puis ouvrez-les sous forme de pile d’images. Ensuite, dans la barre de menu déroulante, cliquez sur image, puis sélectionnez propriétés. Pour y ouvrir la fenêtre des propriétés.Remplacez les unités d’image par des pixels et définissez la largeur et la hauteur des pixels sur 1,0. Cliquez à nouveau sur l’image, sélectionnez ajuster puis seuil pour ouvrir la fenêtre de seuil et utilisez le curseur pour ajuster le seuil de l’image. Inclure les pixels qui contribuent aux billes et exclure les petites particules.Appliquez le seuil à toutes les images de la pile d’images. Ensuite, dans la barre de menu déroulante en haut de l’écran. Cliquez sur analyser.Sélectionnez ensuite définir les mesures pour ouvrir la boîte de dialogue de mesure à l’aide des cases à cocher Sélectionner la zone et Position de la pile en haut de l’écran. Cliquez sur analyser, puis sélectionnez analyser les particules. Cela générera une liste de particules identifiées, y compris leur taille et l’image dans laquelle elles ont été identifiées.Répétez ce processus pour chaque expérience et chaque condition expérimentale afin de déterminer la capacité adhésive dépendante du calcium du poisson zèbre et de la cadhérine. Les cellules HEC 2, 9 et 3 ont été transfectées avec le domaine OD de herrin NCAT fusionné deux fc et les cellules d’agrégation de billes dépendantes du calcium ont été imagées et analysées comme décrit dans cette vidéo, comme on peut le voir sur ces images. En l’absence de calcium, les billes ont peu ou pas tendance à s’agréger, et il n’y a pas d’augmentation de la taille des agrégats avec le temps en présence de calcium.Cependant, les battements recouverts de NCAT ici et d’ECFC montrent une agrégation robuste, la taille des agrégats augmentant au fil du temps comme mesure semi-quantitative de l’adhésion. Les images en lumière transmise de trois expériences ont été analysées pour déterminer la taille moyenne des agrégats. Comme on peut le voir sur ce graphique, l’agrégation des billes enrobées d’ECFC en présence de calcium et en l’absence de calcium a été déterminée à des intervalles de 15 minutes.Pendant une heure, ces données révèlent que le domaine ecto du poisson zèbre et de la cadhérine médie l’adhésion homophile dépendante du calcium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester si l’adhésion est une propriété biochimique intrinsèque de votre protéine d’intérêt.

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adhérences de surface cellulaire sont au cœur de la mécanotransduction, car ils transmettent une tension mécanique et d'initier les voies de signalisation impliquées dans l'homéostasie et le développement des tissus. Ici, nous présentons un protocole pour disséquer les voies biochimiques qui sont activés en réponse à une tension, en utilisant des microbilles magnétiques revêtues de ligand et l'application de la force sur les récepteurs d'adhérence.

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Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d'adhésion cellulaire putatif

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