Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d'adhésion cellulaire putatif

L’objectif global de cette procédure est de tester la capacité des domaines ecto protéiques à médier l’adhésion homophile pour réaliser que les plasmides codant pour la fusion d’un fragment de domaine ecto à la région FC des IgG humaines sont transfectés dans les cellules HEC 2 93. Les protéines de fusion Odin FC sécrétées sont capturées sur des billes magnétiques conjuguées à la protéine G, et après un lavage, les billes enrobées sont autorisées à interagir en solution. Les billes enrobées sont ensuite imagées pour évaluer l’étendue de l’agrégation et enfin, quantifiées À l’aide d’une simple analyse d’image, les données résultantes révèlent si la protéine sous-étudiée est capable de médier l’adhésion homophile.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests d’agrégation cellulaire est qu’elle est rapide, simple et teste directement l’activité adhésive de la protéine choisie. La démonstration de cette technique sera assurée par le Dr Michelle Eman, scientifique principale du laboratoire. Commencez cette procédure en préparant les cellules cultivées pour l’ACN ici ECFC, deux à trois jours avant la transfection.

Utilisez 0,05 % de déclenchements dans l’EDTA pour détacher les cellules HEC 2 93 des boîtes de culture. Préparez deux plats de 100 millimètres pour chaque condition. Divisez les cellules de une à cinq, puis cultivez-les.

Milieu de croissance supplémenté. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 60 à 80 %. Le jour de la transfection, utilisez un réactif tel que lipo pour introduire un plasmide codant pour la fusion FC.

Après la transfection, retournez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures le lendemain de la transfection Préchaud, DMEM avec streptocoque refoulé et sans sérum fœtal bovin à 37 degrés Celsius. Rincez chaque plat deux fois avec 10 millilitres de milieu réchauffé, puis remettez les plats dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure après l’incubation, rincez les plats de culture une fois de plus avec 10 millilitres de DMEM sans sérum de veau fœtal pour un total de trois lavages, puis incubez les cellules transectées à 37 degrés Celsius pendant encore 48 heures avant de recueillir le milieu. Quatre jours après la transfection, à l’aide d’une pipette sérologique, prélever le milieu de chaque paire de boîtes de culture et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez le milieu à 500 G par cinq minutes pour granuler les débris cellulaires après l’essorage, versez le milieu de chaque tube conique de 50 millilitres dans une seringue de 30 millilitres et filtrez-le à travers une seringue de 0,45 micron. Filtrer dans un concentrateur centrifuge. Faites tourner les filtres centrifuges jusqu’à ce que le volume de milieu de culture concentré soit réduit à environ 500 microlitres.

Cela prend environ 15 minutes. Répétez ce processus jusqu’à ce que tout le milieu de culture ait été ajouté et concentré. Ensuite, dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre pour chaque échantillon, à 1,5 microlitre de billes magnétiques de protéine G pour un millilitre de tampon de liaison glacé.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est l’agrégation des billes. Pour garantir le succès, assurez-vous de suivre exactement la procédure. Surveillez les perles rapidement, mais pas trop durement.

Il ne faut jamais les laisser sécher sur le côté du tube ou rester trop longtemps sur l’aimant. Placez le tube sur un aimant et à l’aide d’une pipette, aspirez le tampon. Ajoutez ensuite immédiatement le milieu de culture concentré aux billes magnétiques de la protéine G.

Faites pivoter les tubes à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Placez les tubes sur un aimant et retirez rapidement le fluide. Lavez les billes deux fois avec un millilitre de tampon de liaison glacé, puis remettez les billes en suspension dans 300 microlitres de tampon de liaison.

Divisez les billes remises en suspension en deux tubes de 150 microlitres dans chaque tube. Ajoutez ensuite 1,5 microlitre de chlorure de calcium ou EDTA pour les conditions de calcium et d’absence de calcium respectivement. Transférez 100 microlitres de chaque condition à une dépression.

Lame de puits à l’aide d’un microscope à lumière transmise. Collectez des images à partir de cinq champs de vision pour chaque expérience à chaque point temporel souhaité. À l’aide de l’image J ou d’un logiciel d’analyse d’images comparable.

Ouvrez l’un des cinq ensembles de données d’image de l’image J dans le menu déroulant. En haut de l’écran, sélectionnez fichier. Sélectionnez ensuite importer, puis séquence d’images.

Recherchez le dossier contenant les fichiers image, puis ouvrez-les sous forme de pile d’images. Ensuite, dans la barre de menu déroulante, cliquez sur image, puis sélectionnez propriétés. Pour y ouvrir la fenêtre des propriétés.

Remplacez les unités d’image par des pixels et définissez la largeur et la hauteur des pixels sur 1,0. Cliquez à nouveau sur l’image, sélectionnez ajuster puis seuil pour ouvrir la fenêtre de seuil et utilisez le curseur pour ajuster le seuil de l’image. Inclure les pixels qui contribuent aux billes et exclure les petites particules.

Appliquez le seuil à toutes les images de la pile d’images. Ensuite, dans la barre de menu déroulante en haut de l’écran. Cliquez sur analyser.

Sélectionnez ensuite définir les mesures pour ouvrir la boîte de dialogue de mesure à l’aide des cases à cocher Sélectionner la zone et Position de la pile en haut de l’écran. Cliquez sur analyser, puis sélectionnez analyser les particules. Cela générera une liste de particules identifiées, y compris leur taille et l’image dans laquelle elles ont été identifiées.

Répétez ce processus pour chaque expérience et chaque condition expérimentale afin de déterminer la capacité adhésive dépendante du calcium du poisson zèbre et de la cadhérine. Les cellules HEC 2, 9 et 3 ont été transfectées avec le domaine OD de herrin NCAT fusionné deux fc et les cellules d’agrégation de billes dépendantes du calcium ont été imagées et analysées comme décrit dans cette vidéo, comme on peut le voir sur ces images. En l’absence de calcium, les billes ont peu ou pas tendance à s’agréger, et il n’y a pas d’augmentation de la taille des agrégats avec le temps en présence de calcium.

Cependant, les battements recouverts de NCAT ici et d’ECFC montrent une agrégation robuste, la taille des agrégats augmentant au fil du temps comme mesure semi-quantitative de l’adhésion. Les images en lumière transmise de trois expériences ont été analysées pour déterminer la taille moyenne des agrégats. Comme on peut le voir sur ce graphique, l’agrégation des billes enrobées d’ECFC en présence de calcium et en l’absence de calcium a été déterminée à des intervalles de 15 minutes.

Pendant une heure, ces données révèlent que le domaine ecto du poisson zèbre et de la cadhérine médie l’adhésion homophile dépendante du calcium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester si l’adhésion est une propriété biochimique intrinsèque de votre protéine d’intérêt.