Name: Détection de lépissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez la détection de l'épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse en utilisant un modèle inductible et des cellules épithéliales mammaires humaines. Cette méthode permet d'analyser les changements d'épissage à l'aide de RT-qPCR et d'immunoblot.

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Les auteurs tiennent à remercier Wensheng Liu pour son aide inestimable en matière d’imagerie cellulaire. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (R01 CA182467), de l’American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), de la Fondation Lynn Sage et de la Fondation A Sister’s Hope.

1. culture cellulaire de EMT induction Remarque: EMT peut être induite par un traitement de TGFß ou l'expression ectopique de facteurs de transcription Twist, Snail, ou ZEB1 / 2 dans les cellules épithéliales. Décrit dans le présent protocole est un système d'EMT inductible par l'expression de la protéine de fusion Twist-ER dans les cellules épithéliales immortalisées humaines mammaires (HMLE / Twist-ER, un don du Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Dès le 4-hydroxytamoxifène (TAM) de traitement, la protéine de fusion Twist-ER translocation vers le noyau pour diriger la transcription et les résultats dans une transition EMT complet dans 12-14 jours 9,11,29. D'autres systèmes inductibles EMT, comme HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß, et MCF10A / TGFß, peuvent être trouvées dans nos précédentes publications 11,30. <ol><li> Maintenir des cellules HMLE / Twist-ER mammaire dans un milieu de croissance de cellules epitheliales sans sérum (MEGM) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Passage des cellules tous les 2-3 jours quand ils atteignent 80% de confluence. Incuber les cellules avec 0,15% de trypsine à 37 ° C pendant 5-10 min, puis inactiver la trypsine avec du sérum de veau à 5% / DMEM. Isoler les cellules et les remettre en suspension dans MEGM. cellules de plaque dans une nouvelle boîte de culture tissulaire dans un rapport de 1 à 4. </li><li> Dissoudre TAM dans l'éthanol pour obtenir une solution à 200 pM. Protéger TAM de la lumière et conserver à -20 ° C. Avant utilisation, fraîchement ajouter TAM dans MEGM médias à une dilution de 1: 10 000 pour obtenir une concentration finale de 20 nM TAM. </li><li> Pour l'induction de l'EMT, l'assiette des cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans une boîte de 10 cm de culture de tissu en double exemplaire. cellules de culture avec 20 nM médias TAM contenant MEGM. </li><li> Plate cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans un plat de 10 cm en double exemplaire et traiter les cellules avec 0,01% d'éthanol comme un contrôle non-TAM traité. </li><li> Deux jours après l'incubation, prendre des photos sous un microscope optique à un grossissement de 10X pour enregistrer les changements morphologiques des cellules. </li><li> Aspirer le milieu d'un plat de contrôle ou TAM-traitécellules. Laver les cellules avec du PBS froid et les cellules de la récolte par la mise au rebut de la moitié de la plaque dans du tampon de lyse d'ARN pour l'isolement d'ARN et l'autre moitié dans du tampon RIPA pour l'analyse des protéines. </li><li> cellules de passage de la commande ou de la vaisselle TAM-traités par 1,6 x 10 6 cellules re-placage dans un plat de 10 cm en double exemplaire. Traiter en continu les cellules avec 20 nM TAM ou véhicule. </li><li> Répéter les étapes 5 à 7, une fois tous les deux jours jusqu'au jour 14, moment auquel les cellules Twist-ER TAM-traités présentent une mésenchymateuses morphologie fusiforme, tandis que les cellules témoins traités avec le véhicule à maintenir la morphologie epitheliale pavé analogue. </li></ol> 2 Caractérisation des EMT Remarque: A la fin de l'EMT est indiqué par: (1) Téléphones changements morphologiques d'une morphologie épithéliale pavés comme à un aspect fusiforme fibroblastique-comme; (2) La perte de la E-cadhérine localisation au niveau des jonctions cellule-cellule; et (3) L'expression de marqueurs de commutation EMT, définie par la pertede marqueurs et de gain de marqueurs mésenchymateuses épithéliales. Téléphones changements morphologiques sont capturés par microscope optique à un grossissement de 10X au cours du temps des EMT induction, décrit dans la section 1 de détection immuno-fluorescence de la E-cadhérine à cellules jonctions est décrit dans cette section. L'expression des marqueurs de TEM est détectée par immuno-empreinte. Marqueurs épithéliaux courants sont la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine, et des marqueurs mésenchymateuses incluent la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine. Les procédures générales de immunoblot sont décrits à la section 4. <ol><li> Au jour 12 du traitement TAM, graines 1 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre de 12 mm circulaire placés dans un puits d'une plaque de 24 puits. </li><li> 48 heures après l'ensemencement des cellules, moyen d'aspiration et de lavage avec préchauffé PBS. </li><li> Fixer les cellules avec préchauffé paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Incuber les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15minutes à température ambiante. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Incuber les cellules dans 5% de BSA / PBS pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer la liaison non spécifique. </li><li> Incuber les cellules avec l'anticorps primaire E-cadhérine à une dilution 1:50 de BSA à 1% / PBS dans une chambre humidifiée O / N à 4 ° C. REMARQUE: La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1:50 et 1: 200, et la dilution optimale pour chaque anticorps doit être déterminée expérimentalement. </li><li> Décanter l'anticorps primaire et laver les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Incuber les cellules avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence à une dilution de 1: 500 à 1 heure à température ambiante. De cette étape, protéger les cellules de la lumière. </li><li> Décanter l'anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS. </li><li> cellules de taches avec 0,1-1 g / ml DAPI ou Hoechst pendant 10 min. </li><li> Rincer les cellules avec du PBS à trois reprises. </li><li> Mont lamelles de avec une goutte de milieu de montage, et des lamelles d'étanchéité avec du vernis à ongles. </li><li> Respecter les cellules et prendreimages sous un microscope à fluorescence 63X. </li></ol> La coloration avec des anticorps supplémentaires peut être effectuée pour confirmer le phénotype de l'EMT. Par exemple, la N-cadhérine et α-actine de muscle lisse peuvent être colorées pour un phénotype 29,31,32 mésenchymateuses. La réorganisation de la structure du cytosquelette peut être contrôlée par coloration des cellules avec de la phalloïdine pour 11 F-actine. En outre, les dosages de la motilité cellulaire et la résistance à la mort cellulaire peuvent être effectuées pour étudier les propriétés d'EMT 11. 3 Détection de Splice isoformes en utilisant des tests qRT-PCR <ol><li> Conception Primer REMARQUE: paires d'amorces doivent être soigneusement conçues pour amplifier isoformes d'épissage distinctes. Le saut d'exon, le cas de l'épissage alternatif le plus fréquemment observé, est montrée ici comme un exemple pour illustrer la stratégie de conception d'amorce. Figure 1A représente un quatre exon pré-ARNm, avec le troisième exon comme un exon variable. L'inclusion de l'exon 3 résultats dansla production d'une isoforme d'épissage plus, alors saut de l'exon 3 génère une épissure isoforme plus courte. Les amorces doivent être conçues pour distinguer l'isoforme de l'exon 3 et l'exon-inclus-3-isoforme sautée, et à détecter la transcription total de cet ARNm. <ol><li> Pour la détection de l'exon inclusion, de concevoir avec soin une amorce sens à l'intérieur de l'exon 3 de variable, et une amorce anti-sens à l'intérieur de l'exon constitutive proximité 4, permettant l'amplification spécifique de l'isoforme de l'exon-inclus variable. Veillez à ne pas concevoir deux amorces sens et antisens dans le même exon variable afin d'éviter les produits de PCR amplifiés à partir d'ADN génomique ou pré-ARNm. </li><li> Pour amplifier spécifiquement le saut d'exon événements, conception une des amorces couvrant la jonction de l'exon 2 et constitutive exon 4 qui seraient autrement détruits quand l'exon 3 variables est inclus. Concevoir l'autre amorce à l'intérieur du exon constitutive 4 En tant que tel, les produits de PCR sont générés uniquement lorsque l'exon 3 variables est non compris leed et constitutif exon 2 et l'exon 4 sont ensuite réunis. </li><li> Pour détecter des transcrits totaux de la génétique, de concevoir les amorces dans les deux exons 1 et 2 constitutifs Ainsi, les produits PCR sont amplifiés à partir de toutes les isoformes. </li><li> S'assurer que la température de fusion (Tm) des amorces pour l'ensemble est d'environ 55 ° C, la longueur de chaque amorce est d'environ 18 à 22 nucléotides, et la taille des produits de PCR se situe entre 80 et 150 paires de bases. </li></ol></li><li> extraction de l'ARN: l'ARN extrait à l'aide d'un kit totale d'isolement d'ARN (voir le tableau des matériaux). <ol><li> Prélever des cellules dans 350 tampon de lyse ARN ul. </li><li> Ajouter 350 ul de 70% d'éthanol au lysat et bien mélanger. </li><li> Transférer l'échantillon dans la colonne de purification de l'ARN. </li><li> Centrifugeuse à 10.000 g pendant 1 min et le rejet accréditives. </li><li> Laver la colonne une fois avec 500 pi de lavage de l'ARN tampon I et deux fois avec de l'ARN tampon de lavage II. </li><li> Retirer le tampon de lavage d'ARN résiduelII à partir de la colonne par une centrifugation à vitesse maximale pendant deux minutes. </li><li> Transférer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml, ajouter de l'eau sans nucléase 50 ul au centre de la matrice de la colonne et éluer l'ARN par centrifugation à la vitesse maximale. </li></ol></li><li> Synthèse de premier brin d'ADNc <ol><li> Déterminer la concentration et de la qualité de l'ARN par une mesure d'absorption UV. Remarque: Bonne qualité de l'ARN devrait avoir une 260 nm / 280 nm rapport d'absorbance d'environ 2,0. </li><li> Mise en place de la transcriptase inverse (RT) des réactions qui contiennent 250 ARN ng totale, 0,05 ug d'amorces hexamères aléatoires, 50 pmol de MgCl2, 10 pmol de dNTP, un tampon de 2 pi de 5 x GoScript, et 1 pl RT enzyme dans un volume final de 20 ul. </li><li> Réaliser des réactions de RT à 42 ° C pendant 1 h, suivie d'une incubation à 70 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme RT. </li></ol></li><li> PCR en temps réel <ol><li> Mis en place 20 réactions ul qui se composent de 10 ul SYBR maître vert mélange,0,1 à 1,0 pi d'ADNc matrice, et 5 pmoles d'amorces sens et antisens. </li><li> Exécuter la PCR en temps réel avec 40 cycles des étapes suivantes: dénaturation à 95 ° C pendant 10 sec, 58 ° C pour un recuit de 10 secondes, et 60 ° C pendant 30 sec prolongement. Réaliser des réactions de PCR en trois exemplaires. </li><li> Vérifiez courbes de dissociation et assurez-vous qu'un seul pic est observé pour chaque jeu d'amorces. </li><li> Obtenir les valeurs cycle de quantification (Cq) en calculant les secondes valeurs dérivées des courbes d'amplification. </li><li> Calculer la quantité relative (RQ) d'ARNm cibles dans les échantillons induits par rapport à l'échantillon non induit en utilisant le «delta delta Cq (ΔΔCq)« méthode comme représenté par la formule suivante. Utilisez gènes de ménage, comme GAPDH ou PAD, comme une référence. </li></ol></li></ol><img alt="L'équation 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> Pour calculer plus précisément les valeurs relatives des isoformes d'épissage, til utiliser des gènes de référence multiples doit être considéré. Les résultats peuvent être analysés en utilisant une méthode de quantification de la valeur absolue modifié décrit par Pfaffl 33,34 et al. 4. examen de Splice isoformes au niveau des protéines <ol><li> Prélever des cellules dans 100 tampon RIPA glacée ul. </li><li> Réglez lysats sur la glace pendant environ 10 min. </li><li> Centrifuger à 14 000 g pendant 10 min à 4 ° C, et recueillir le surnageant. </li><li> Mesurer la concentration de protéine par des essais de Bradford. </li><li> Diluer les échantillons de protéine dans un tampon de charge SDS charger et de 20 à 40 ug de protéines dans des gels à 10% de SDS-PAGE. </li><li> Exécutez gels SDS-PAGE à 20 mA pendant 1,5 heure. </li><li> Transfert des protéines sur des membranes de PVDF dans un système de transfert humide à 4 ° C pendant 3 heures à 85 V. ajuster le temps de transfert en fonction du poids moléculaire des protéines cibles. </li><li> membrane de bloc dans 5% de lait écrémé pendant 30 min à 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber membrane with un anticorps primaire à 4 ° CO / N. La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1: 200 et 1: 5000, déterminer la dilution optimale pour chaque anticorps expérimentalement. La dilution des anticorps utilisés dans ce protocole peut être trouvé dans le "Tableau de réactifs et d'équipements spécifiques". <ol><li> Pour détecter les isoformes d'épissage, utiliser des anticorps spécifiques qui reconnaissent une isoforme particulière. En variante, en utilisant un anticorps qui reconnaît l'épitope dans la région codante de l'exon constitutive et détecter les isoformes d'épissage en même temps en fonction de leurs différentes dimensions de la protéine. </li><li> Dans le même temps, surveiller EMT par immunoblot des marqueurs de l'EMT. Utiliser la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine comme marqueurs épithéliaux, et la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine comme marqueurs mésenchymateuses. </li></ol></li><li> Membrane Laver trois fois avec du TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) à un intervalle de 5 minutes. </li><li> Incuber la membrane avec une fourmi secondaire conjugué à la HRPibody dans une dilution 1: 10 000 à 1 heure à température ambiante. </li><li> Membrane Laver trois fois avec du TBS-T à un intervalle de 5 minutes. </li><li> Visualiser protéine avec un système de détection de chimioluminescence et exposer la membrane à un film d'autoradiographie. </li></ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La procédure décrite ici permet la détection de l&#39;épissage alternatif dans un modèle d&#39;EMT inductible. Ainsi, les modifications dynamiques de l&#39;isoforme d&#39;épissage expression peuvent être capturées pendant toute la durée de temps de EMT. Cette méthode présente des avantages sur l&#39;utilisation de epithelial- différente ou des lignées de cellules mésenchymateuses-représentant pour la comparaison de l&#39;épissage alternatif d&#39;arrière-plans génétiques distinctes provenant de lignées cellulaires liées...

La transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) est un programme de développement qui anime la morphogenèse d&#39;organes et le remodelage tissulaire cours de l&#39;embryogenèse. Lorsque anormalement activée, EMT favorise la métastase de la tumeur et des organes fibrose 1,2. Études convaincantes ont décrit l&#39;importance de la régulation de la transcription au cours du processus de EMT, définie par plusieurs facteurs de transcription, tels que Twist, Snail, et ZEB, qui répriment l&#39;expression de la adhérentes protéine de jonction E-cadhérine, entraînant la perte d&#39;un cobble- pierre comme la morphologie et le gain d&#39;un phénotype mésenchymateux fusiforme 3-8 épithéliale. Des études récentes à travers l&#39;analyse de l&#39;ensemble du génome d&#39;ARN ont révélé qu&#39;il existe un groupe de gènes dont l&#39;épissage modèles sont associés soit aux phénotypes épithéliales ou mésenchymateuses 9,10. Le travail de notre laboratoire relié fonctionnellement épissage alternatif et EMT. En étudiant la surface de la molécule d&#39;adhésion cellulaire CD44, CD44, nous avons démontré que alternative épissage est étroitement régulée pendant EMT, et plus important encore, que CD44 épissure isoforme de commutation de causalité contribue à EMT 11. L&#39;épissage alternatif est un modèle répandu et conservé de la régulation des gènes, car jusqu&#39;à 95% des gènes multi-exons humains sont épissage alternatif 12-14. En générant de multiples produits de protéines à partir d&#39;un seul gène, épissage alternatif constitue un mécanisme essentiel de la diversité des protéines, en ajoutant une autre couche de complexité au génome humain. En tant que tel, la dérégulation de l&#39;épissage alternatif pourrait conduire à des effets biologiques profonds causent des maladies humaines. En effet, l&#39;épissage alternatif aberrant dans les maladies a été documentée depuis plus d&#39;une décennie 15-25, y compris les conclusions récentes mutations dans les gènes codant pour les machines de splicéosome sont généralement trouvés dans les syndromes myélodysplasiques 26-28. Par conséquent, le développement de méthodes fiables pour la détection de la i alternativement épissésoforms est d&#39;une grande importance dans l&#39;étude de divers processus biologiques, y compris EMT. Ici, nous fournissons un protocole pour détecter des changements dans l&#39;épissage alternatif en utilisant un modèle d&#39;EMT inductible. Les méthodes de conception d&#39;amorces de PCR et la détection des isoformes d&#39;épissage sont adaptés non seulement pour l&#39;étude de l&#39;épissage alternatif pendant EMT, mais également pour l&#39;étude de l&#39;épissage alternatif dans d&#39;autres processus biologiques. Enquête épissage alternatif pendant EMT est impératif afin de mieux comprendre les mécanismes de EMT et les métastases de la tumeur, facilitant ainsi le développement de stratégies efficaces pour traiter les métastases du cancer.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifène</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Préparez une solution mère en dissolvant le 4-hydroxytamoxifène dans de l’éthanol à 200 &#956 ;M. Maintenez la solution à -20 &#176 ; C à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit d’isolement de l’ARN total</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Kit d’isolement de l’ARN total</td></tr><tr><td>Système de transcription inverse GoScript</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Réactif pour test qRT-PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Réactif pour test qRT-PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Système de PCR en temps réel</td><td>Roche</td><td></td><td>Équipement pour test qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticorps CD44</td><td>R& D Systems</td><td>BBA10</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps E-cadhérine</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4065</td><td>Dilution 1:2 500 pour immunotransfert ; dilution 1:50 pour immunofluorescence</td></tr><tr><td>&gamma ;-Catenin Anticorps</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2309</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps occludine</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-fibronectine</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>Anticorps N-cadhérine</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>Dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>Anticorps Vimentin</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps GAPDH</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>Dilution 1:10 000</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blot réactif de détection</td> GE <td>Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Système de chimiluminescence</td></tr></tbody></table>

détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

L’épissage alternatif joue un rôle essentiel dans la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel qui se produit dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une stratégie pour détecter l’épissage alternatif au cours de l’EMT en utilisant un modèle EMT inductible en exprimant le répresseur de transcription Twist. L’EMT est surveillée par des changements dans la morphologie cellulaire, la perte de localisation de l’E-cadhérine aux jonctions cellule-cellule et l’expression commutée des marqueurs EMT, tels que la perte des marqueurs épithéliaux E-cadhérine et γ-caténine et le gain des marqueurs mésenchymateux N-cadhérine et vimentine. À l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques aux isoformes, l’épissage alternatif des ARNm intéressés est analysé par RT-PCR quantitative. La production d’isoformes protéiques correspondantes est validée par des tests d’immunoblottage. La méthode de détection des isoformes d’épissage décrite ici convient également à l’étude de l’épissage alternatif dans d’autres processus biologiques.

Les procédures décrites ci-dessus fournissent une méthode robuste pour détecter l'épissage alternatif pendant EMT. Les résultats représentatifs de commutation de l'isoforme CD44 épissure pendant EMT induite Twist-sont donnés ci-dessous à titre d'exemple. EMT induite Twist-dans les cellules HMLE / Twist-ER a été caractérisée par une transition d'un pavée comme phénotype épithélial à un phénotype fibroblastique allongée (figure 2A), l'absence de marqueurs épithéliaux E-cadhéri...

Il a été démontré que la régulation de l’épissage alternatif contribue à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant un modèle EMT inductible pour la détection d’épissages alternatifs pendant l’EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de détecter les changements dans l’épissage alternatif pendant l’EMT. Ceci est réalisé en utilisant un modèle EMT inductible dans lequel l’expression de la protéine de fusion twister er. Dans les cellules épithéliales mammaires humaines, les cellules subissent une TEM lors d’un traitement au tamoxifène dans un deuxième temps.L’expression des isoformes d’épissage est analysée par R-T-P-C-R quantitative à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques aux isoformes, ce qui révèle des changements d’épissage alternatifs au niveau de l’ARN. Ensuite, l’abondance de protéines correspondant à chaque isoforme est déterminée par immuno-blot afin de confirmer l’expression des isoformes d’épissage au niveau de la protéine, des résultats sont obtenus qui montrent des changements dans l’épissage alternatif dans les gènes d’intérêt pendant l’EMT, sur la base d’analyses quantitatives R-T-P-C-R et d’immuno-blotting, Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épissage alternatif RN et de l’EMT, comme la façon dont l’épissage alternatif est régulé pendant l’EMT et comment cette régulation affecte l’EMT et les processus pathologiques liés à l’EMT. Les implications de cette technique sont pour le traitement du cancer, car l’EMT joue un rôle important dans la promotion de l’invasion tumorale et des métastases.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’épissage alternatif pendant l’EMT. La méthode de détection de l’ARM spécifique aux isoformes peut également être appliquée dans d’autres systèmes, tels que l’étude de l’épissage alternatif dans la différenciation des neurones et le programme des morts cellulaires. La première étape consiste à mettre en plaque les cellules exprimant la protéine de fusion ER twist, à ensemencer les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres en double, puis à préparer et à protéger la lumière de la solution de tamoxifène pour induire la transition mésenchymateuse épithéliale ou à traiter les cellules avec 20 nanomolaires de tamoxifène contenant des milieux pour un groupe témoin non traité au tamoxifène, à ajouter 0,01 % d’éthanol à un ensemble supplémentaire de cellules deux jours après l’incubation.Prenez des photos au microscope optique à un grossissement de 10 x pour enregistrer tout changement morphologique. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS froid. Grattez les cellules d’une moitié de la plaque dans un tampon de lyse de l’ARN pour l’isolement de l’ARN et l’autre moitié dans 100 microlitres de tampon de ripa glacé pour l’analyse des protéines, passez les cellules des deux groupes, comme indiqué précédemment, et traitez en continu avec 20 nanomolaires de tamoxifène ou de véhicule.Répétez ces étapes tous les deux jours jusqu’au 14e jour, moment auquel les cellules ER torsadées traitées au tamoxifène devraient présenter une morphologie mésenchymateuse en forme de fuseau. Alors que les commandes traitées par véhicule doivent maintenir la morphologie épithéliale du pavé. Ici, un ANN prem à quatre exons est utilisé comme exemple pour la détection de l’inclusion d’exons.Concevez une amorce avant à l’intérieur de l’exon trois variable et une amorce inverse à l’intérieur de l’exon quatre constitutif voisin. Permettant l’amplification spécifique de l’isoforme incluse de l’exon variable pour amplifier spécifiquement les événements de saut d’exon. Amorces de conception couvrant la jonction de l’exon deux et de l’exon quatre constitutifs qui seraient autrement détruits lorsque l’exon trois variable est inclus.Concevez l’autre amorce à l’intérieur de l’exon quatre constitutif pour détecter les transcrits totaux du gène et éviter les produits de PCR amplifiés à partir d’ADN génomique ou d’amorces NA.Design prem dans deux exons constitutifs lorsqu’ils sont prêts. Suit les procédures standard d’extraction de l’ARN pour isoler l’ARN des échantillons de cellules prélevés précédemment. Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN par absorption UV pour synthétiser le premier brin, CD NA et mettre en place des réactions de transcriptase inverse dans un volume final de 20 microlitres.Effectuez des réactions RT à 42 degrés Celsius pendant une heure, suivies d’une incubation à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver l’enzyme RT en temps réel. La PCR a mis en place des réactions de 20 microlitres qui se composent de 10 microlitres de cyber green master mix, de 0,1 à 1,0 microlitres de modèle CD NA et de cinq amorces picomoles avant et arrière.Exécutez une PCR en temps réel avec 40 cycles en trois exemplaires. Vérifiez les courbes de dissociation et assurez-vous qu’un seul pic est observé pour chaque jeu d’amorces. Obtenez les valeurs du cycle de quantification en calculant les valeurs de la dérivée seconde des courbes d’amplification.Calculez la quantité relative d’ARNm cibles dans les échantillons induits par rapport à l’échantillon non induit à l’aide de la méthode delta delta CQ, comme le montre cette formule. Laissez les cellules prélevées pour l’analyse des protéines sur de la glace pendant environ 10 minutes avant de centrifuger et de recueillir le surnageant. Après avoir déterminé la concentration en protéines, diluez les échantillons dans le chargement SDS, tamponnez et chargez 20 à 40 microgrammes de protéines dans des gels à 10 % de SDS.Exécutez les gels de page SDS à 20 milliampères pendant 1,5 heure. Après ce temps, transférez les protéines sur des membranes PVDF dans un système de transfert humide à quatre degrés Celsius pendant trois heures à 85 volts. Ajustez le temps de transfert en fonction du poids moléculaire des protéines cibles.Ensuite, bloquez la membrane dans le lait écrémé à 5 % pendant 30 minutes à une heure. À température ambiante, incubez la membrane avec un anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. L’anticorps primaire reconnaît l’épitope dans la région constitutive de l’enrobage de l’exon et détecte simultanément les isoformes sliques en fonction de leurs différentes tailles de protéines.Dans le même temps, surveillez l’EMT par immuno-blot. Pour les marqueurs EMT. Utilisez eec, ahern, gamma caténine et occludine comme marqueurs épithéliaux et fibronectine n cadhérine et menton comme marqueurs mésenchymateux.Le lendemain, lavez la membrane trois fois avec du TBST à cinq minutes d’intervalle. Ensuite, incubez la membrane avec un anticorps secondaire conjugué HRP dans une dilution de un à 10 000 pendant une heure à température ambiante. Après ce temps, lavez la membrane trois fois avec du TBST à cinq minutes d’intervalle.Enfin, visualisez les protéines à l’aide d’un système de détection par chimiluminescence et exposez la membrane à un film d’autoradiographie. L’EMT induite par la torsion a été caractérisée par une transition d’un phénotype épithélial de type pavé à un phénotype fibroblastique allongé, montrant l’absence de marqueurs épithéliaux, de la cadhérine e, de la gammacaténine et de l’occludine, et la régulation à la hausse des marqueurs mésenchymateux, de la fibronectine et de la vimentine. De plus, l’EMT a été évaluée par la perte de localisation de la cadhérine EC aux jonctions cellulaires représentées.Voici les modèles d’amorces pour la détection des isoformes d’épissage CD 44. Les emplacements des amorces sont indiqués par les différentes flèches colorées. Les résultats des analyses Q-R-T-P-C-R indiquent une diminution significative de l’ARNm CD 44 V et une augmentation de l’ARNm CD 44 s après 14 jours de traitement TAM.En revanche, le transcrit total du CD 44 est resté inchangé pendant l’EMT conformément aux résultats de Q-R-T-P-C-R, le niveau de protéine CD 44 V a diminué de manière remarquable, tandis que l’expression de la protéine CD 44 a été considérablement régulée à la hausse pendant la participation à cette procédure. Il est important de se rappeler qu’une induction réussie de l’ORL est très cruciale. Ainsi, l’ORL doit être soigneusement confirmée par diverses méthodes telles que la détection des changements dans la morphologie cellulaire, l’expression des marqueurs ORL et la localisation de la RIN à la surface cellulaire.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le rapporteur d’épissage de gestion du test peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que, comment ces éléments agissant et les facteurs de transaction affectent-ils la régulation alternative de l’épissage après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN, de la biologie du développement et de la biologie du cancer pour explorer une régulation alternative de l’épissage dans les processus EMT au cours du développement normal et des métastases cancéreuses.

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