Détection de l'épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

L’objectif général de l’expérience suivante est de détecter les changements dans l’épissage alternatif pendant l’EMT. Ceci est réalisé en utilisant un modèle EMT inductible dans lequel l’expression de la protéine de fusion twister er. Dans les cellules épithéliales mammaires humaines, les cellules subissent une TEM lors d’un traitement au tamoxifène dans un deuxième temps.

L’expression des isoformes d’épissage est analysée par R-T-P-C-R quantitative à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques aux isoformes, ce qui révèle des changements d’épissage alternatifs au niveau de l’ARN. Ensuite, l’abondance de protéines correspondant à chaque isoforme est déterminée par immuno-blot afin de confirmer l’expression des isoformes d’épissage au niveau de la protéine, des résultats sont obtenus qui montrent des changements dans l’épissage alternatif dans les gènes d’intérêt pendant l’EMT, sur la base d’analyses quantitatives R-T-P-C-R et d’immuno-blotting, Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épissage alternatif RN et de l’EMT, comme la façon dont l’épissage alternatif est régulé pendant l’EMT et comment cette régulation affecte l’EMT et les processus pathologiques liés à l’EMT. Les implications de cette technique sont pour le traitement du cancer, car l’EMT joue un rôle important dans la promotion de l’invasion tumorale et des métastases.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’épissage alternatif pendant l’EMT. La méthode de détection de l’ARM spécifique aux isoformes peut également être appliquée dans d’autres systèmes, tels que l’étude de l’épissage alternatif dans la différenciation des neurones et le programme des morts cellulaires. La première étape consiste à mettre en plaque les cellules exprimant la protéine de fusion ER twist, à ensemencer les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres en double, puis à préparer et à protéger la lumière de la solution de tamoxifène pour induire la transition mésenchymateuse épithéliale ou à traiter les cellules avec 20 nanomolaires de tamoxifène contenant des milieux pour un groupe témoin non traité au tamoxifène, à ajouter 0,01 % d’éthanol à un ensemble supplémentaire de cellules deux jours après l’incubation.

Prenez des photos au microscope optique à un grossissement de 10 x pour enregistrer tout changement morphologique. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS froid. Grattez les cellules d’une moitié de la plaque dans un tampon de lyse de l’ARN pour l’isolement de l’ARN et l’autre moitié dans 100 microlitres de tampon de ripa glacé pour l’analyse des protéines, passez les cellules des deux groupes, comme indiqué précédemment, et traitez en continu avec 20 nanomolaires de tamoxifène ou de véhicule.

Répétez ces étapes tous les deux jours jusqu’au 14e jour, moment auquel les cellules ER torsadées traitées au tamoxifène devraient présenter une morphologie mésenchymateuse en forme de fuseau. Alors que les commandes traitées par véhicule doivent maintenir la morphologie épithéliale du pavé. Ici, un ANN prem à quatre exons est utilisé comme exemple pour la détection de l’inclusion d’exons.

Concevez une amorce avant à l’intérieur de l’exon trois variable et une amorce inverse à l’intérieur de l’exon quatre constitutif voisin. Permettant l’amplification spécifique de l’isoforme incluse de l’exon variable pour amplifier spécifiquement les événements de saut d’exon. Amorces de conception couvrant la jonction de l’exon deux et de l’exon quatre constitutifs qui seraient autrement détruits lorsque l’exon trois variable est inclus.

Concevez l’autre amorce à l’intérieur de l’exon quatre constitutif pour détecter les transcrits totaux du gène et éviter les produits de PCR amplifiés à partir d’ADN génomique ou d’amorces NA.Design prem dans deux exons constitutifs lorsqu’ils sont prêts. Suit les procédures standard d’extraction de l’ARN pour isoler l’ARN des échantillons de cellules prélevés précédemment. Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN par absorption UV pour synthétiser le premier brin, CD NA et mettre en place des réactions de transcriptase inverse dans un volume final de 20 microlitres.

Effectuez des réactions RT à 42 degrés Celsius pendant une heure, suivies d’une incubation à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver l’enzyme RT en temps réel. La PCR a mis en place des réactions de 20 microlitres qui se composent de 10 microlitres de cyber green master mix, de 0,1 à 1,0 microlitres de modèle CD NA et de cinq amorces picomoles avant et arrière.

Exécutez une PCR en temps réel avec 40 cycles en trois exemplaires. Vérifiez les courbes de dissociation et assurez-vous qu’un seul pic est observé pour chaque jeu d’amorces. Obtenez les valeurs du cycle de quantification en calculant les valeurs de la dérivée seconde des courbes d’amplification.

Calculez la quantité relative d’ARNm cibles dans les échantillons induits par rapport à l’échantillon non induit à l’aide de la méthode delta delta CQ, comme le montre cette formule. Laissez les cellules prélevées pour l’analyse des protéines sur de la glace pendant environ 10 minutes avant de centrifuger et de recueillir le surnageant. Après avoir déterminé la concentration en protéines, diluez les échantillons dans le chargement SDS, tamponnez et chargez 20 à 40 microgrammes de protéines dans des gels à 10 % de SDS.

Exécutez les gels de page SDS à 20 milliampères pendant 1,5 heure. Après ce temps, transférez les protéines sur des membranes PVDF dans un système de transfert humide à quatre degrés Celsius pendant trois heures à 85 volts. Ajustez le temps de transfert en fonction du poids moléculaire des protéines cibles.

Ensuite, bloquez la membrane dans le lait écrémé à 5 % pendant 30 minutes à une heure. À température ambiante, incubez la membrane avec un anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. L’anticorps primaire reconnaît l’épitope dans la région constitutive de l’enrobage de l’exon et détecte simultanément les isoformes sliques en fonction de leurs différentes tailles de protéines.

Dans le même temps, surveillez l’EMT par immuno-blot. Pour les marqueurs EMT. Utilisez eec, ahern, gamma caténine et occludine comme marqueurs épithéliaux et fibronectine n cadhérine et menton comme marqueurs mésenchymateux.

Le lendemain, lavez la membrane trois fois avec du TBST à cinq minutes d’intervalle. Ensuite, incubez la membrane avec un anticorps secondaire conjugué HRP dans une dilution de un à 10 000 pendant une heure à température ambiante. Après ce temps, lavez la membrane trois fois avec du TBST à cinq minutes d’intervalle.

Enfin, visualisez les protéines à l’aide d’un système de détection par chimiluminescence et exposez la membrane à un film d’autoradiographie. L’EMT induite par la torsion a été caractérisée par une transition d’un phénotype épithélial de type pavé à un phénotype fibroblastique allongé, montrant l’absence de marqueurs épithéliaux, de la cadhérine e, de la gammacaténine et de l’occludine, et la régulation à la hausse des marqueurs mésenchymateux, de la fibronectine et de la vimentine. De plus, l’EMT a été évaluée par la perte de localisation de la cadhérine EC aux jonctions cellulaires représentées.

Voici les modèles d’amorces pour la détection des isoformes d’épissage CD 44. Les emplacements des amorces sont indiqués par les différentes flèches colorées. Les résultats des analyses Q-R-T-P-C-R indiquent une diminution significative de l’ARNm CD 44 V et une augmentation de l’ARNm CD 44 s après 14 jours de traitement TAM.

En revanche, le transcrit total du CD 44 est resté inchangé pendant l’EMT conformément aux résultats de Q-R-T-P-C-R, le niveau de protéine CD 44 V a diminué de manière remarquable, tandis que l’expression de la protéine CD 44 a été considérablement régulée à la hausse pendant la participation à cette procédure. Il est important de se rappeler qu’une induction réussie de l’ORL est très cruciale. Ainsi, l’ORL doit être soigneusement confirmée par diverses méthodes telles que la détection des changements dans la morphologie cellulaire, l’expression des marqueurs ORL et la localisation de la RIN à la surface cellulaire.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le rapporteur d’épissage de gestion du test peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que, comment ces éléments agissant et les facteurs de transaction affectent-ils la régulation alternative de l’épissage après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN, de la biologie du développement et de la biologie du cancer pour explorer une régulation alternative de l’épissage dans les processus EMT au cours du développement normal et des métastases cancéreuses.