Name: Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez une méthode d'hybridation in situ pour analyser l'épissage alternatif de l'ARN pré-messager dans les sections de cerveau de souris. Cette technique utilise des oligonucléotides antisens courts et une amplification du signal pour détecter les isoformes spécifiques avec une grande sensibilité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association [subvention 0365274B à H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 à Z.W.], National Institutes of Health [Bureau de recherche Infrastructure partagée Instrumentation Grant S10RR031845 à la microscopie photonique Imaging Facility à Case Western Reserve University] et China Scholarship Council [à X.G.]. Les auteurs remercient Richard Lee dans la lumière microscopie Imaging Core pour son aide avec la numérisation de diapositives.

Tous des expériences décrites ici qui impliquent des souris ont été approuvés par le Comité de l’emploi et de Case Western Reserve University Institutional Animal Care. Le titre du protocole 2016-0068 (PI : Hua Lou) est le « Rôle de l’épissage alternatif pré-ARNm dans le développement des vertébrés ».
NOTE : Information de tous les équipements, les réactifs et les fournitures utilisées dans le présent protocole est incluse dans la Table des matières.
1. préparer le formol fixe paraffine encastré (FFIP) Sections
<ol><li>
Euthanasier 1 souris CD1 et 1 souris C57BL/6J par dislocation cervicale. Découpez soigneusement ouvert le crâne avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps. Enlever le cerveau avec une boule. NOTE : souris mâles de 5 mois CD1 et des souris mâles C57BL/6J 3 mois ont été utilisés et ont montré des résultats similaires.<ol>
<li>Laver le cerveau avec du PBS. Difficulté tout le cerveau avec une solution contenant 10 % de formol à température ambiante (RT) pour 30 h en mettant tout le cerveau dans 50 mL de la solution de formol.</li>
		<li>Changer la solution de fixation pour PBS et incuber le cerveau dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. Déshydrater et incorporer le cerveau avec xylène et de paraffine à l’aide de procédures standard18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utiliser un microtome pour couper le tissu embarqué en 5 sections µm. Mettre le ruban de la paraffine dans un bain d’eau RT tout d’abord, puis dans un bain d’eau de 45 ° C pour répandre le ruban.
	<ol>
<li>Quand les rides et les plis dans le ruban disparaissent, immédiatement monter sections sur lames de verre. L’air secs diapositives nuit à diapositives RT. cuire au four pendant 1 h à 60 ° C avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. prétraitement de l’échantillon
<ol><li>
Déparaffiner des sections de tissu. Effectuer ces étapes sous une hotte.
	<ol>
<li>Remplir deux plats de lavage (Figure 1 a) avec 250 mL de xylène frais et deux avec 250 mL d’éthanol à 100 %. Insérer les lames de tissu dans un panier de lavage (Figure 1 a) et placez le lavage des grilles dans les plats de lavage suivant le temps d’incubation et l’ordre indiqué dans le tableau 1.</li>
		<li>Pendant chaque incubation, soulevez le panier de lavage haut et en bas plus de 3 fois dans le plat de lavage. Après chaque incubation, se déplacer rapidement le panier de lavage dans le prochain plat de lavage afin d’éviter les coupes de tissus ne se dessèchent pas.</li>
		<li>Après avoir terminé les étapes de l’incubation, enlever le panier de lavage avec diapositives le lave vaisselle. Placer la grille dans une étuve à 60 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les lames soient complètement secs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dessiner une barrière 0,75 '' x 0,75 '' entourant la section de tissu avec un stylo de barrière hydrophobe. Sécher à l’air la barrière pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>
Prétraitez les tranches
	<ol>
<li>Préparer des réactifs et équipements<ol>
<li>Allumez le four d’hybridation (Figure 1 b) et régler la température à 40 ° C 30 min avant utilisation.</li>
			<li>Mouiller le papier humidification (Figure 1E) avec de l’eau distillée complètement et le mettre dans le bac de contrôle d’humidité (Figure 1, à gauche). Garder le plateau de contrôle d’humidité dans le four de l’hybridation.</li>
			<li>Préparer 700 mL de réactifs de récupération frais 1 x cible en ajoutant 630 mL de dH2O à 70 mL x 10 cible récupération réactifs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Appliquer l’eau oxygénée.<ol>
<li>Placez les diapositives déparaffinées sur le banc. Ajoutez 5 à 8 gouttes de peroxyde d’hydrogène à une section pour couvrir complètement le tissu. Incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
			<li>Tapez sur diapositives sur un morceau de papier absorbant pour enlever la solution de peroxyde d’hydrogène, une diapositive à la fois. Insérer la diapositive dans un rack de laver immédiatement et de déplacer la grille dans un plat à laver rempli de dH2O.</li>
			<li>Laver les diapositives en déplaçant le panier monte et descend dans l’eau distillée pendant 3 à 5 fois. Déplacer le panier de lavage pour un lavage plat rempli d’eau distillée fraîche et diapositives de lavage une fois de plus.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuer la récupération de la cible<ol>
<li>Placer un bécher de verre de 1 000 mL sur une plaque chauffante. Ajouter 700 mL de frais 1 x objectif récupération réactifs dans le bol et le couvrir avec une feuille. Insérer un thermomètre dans le bécher dans le film protecteur (Figure 1). Tourner sur la plaque chauffante et régler à température élevée pendant 10 à 15 min.</li>
			<li>Lorsque la température des réactifs d’extraction atteint 98 ° C, passer le contrôle de la température de la plaque chauffante de haut en bas pour maintenir une ébullition douce pour. Ne pas faire bouillir plus de 15 min.</li>
			<li>Pendant ce temps, ouvrir la feuille et mettre le panier de lavage avec des tranches à l’intérieur de la régente de récupération. Couvrir le bécher à nouveau et laisser incuber pendant 15 min.</li>
			<li>Utilisation de forceps pour enlever la grille du bécher dans un plat à laver remplie avec 200 mL de dH2O et rincer pendant 15 s.</li>
			<li>Déplacer la grille dans un plat de lavage contenant 100 % d’éthanol frais et laisser reposer 3 min. Retirer les lames et faites-les sécher dans une étuve à 60 ° C pendant 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Appliquer la protéase III<ol>
<li>Placer les lames sur la grille de la tache (Figure 1, droit). Ajouter 5 gouttes de protéase III pour couvrir le tissu. Soigneusement, mettre le panier dans la barre de contrôle de l’humidité (Figure 1, à gauche) et insérez le plateau dans le four de l’hybridation de 40 ° C. Incuber pendant 30 minutes.</li>
			<li>Enlever la grille coulissante et remettre le plateau dans le four. Cliquez sur les diapositives pour enlever l’excès de liquide, une diapositive à la fois. Insérer la diapositive dans un panier de lavage et place la grille dans un plat de lavage remplie de dH2O. passez le panier haut et bas pour laver les diapositives pour les 3 - 5 fois.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH Assay
<ol><li>
Préparer les matériaux
	<ol>
<li>Réchauffez 50 x tampon de lavage dans une étuve à 40 ° C pendant 20 min. Mix 2,94 L de dH2O et 60 mL de 50 x tampon de lavage à faire 1 x tampon de lavage.</li>
		<li>Préparer une solution 50 % coloration hématoxyline en ajoutant 100 mL de l’hématoxyline Gill, j’ai à 100 mL de dH2O. Prepare 0,02 % (p/v) de l’eau ammoniaque en ajoutant 1,43 mL 1 N d’hydroxyde d’ammonium dans 250 mL de dH2O. Mix bien dans un récipient.</li>
		<li>Mettre les sondes et les AMP 0 – 6 réactifs à RT 30 min avant utilisation. Garder le plateau de contrôle d’humidité dans le four de l’hybridation de 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procédure de l’ISH Remarque : Pour examiner l’expression de la Nf1 isoformes d’épissage et calculer le pourcentage épissé en valeur (PSI) pour les exon 23 a, trois différentes sondes de ISH qui ciblent l’exon 23 a-inclus isoforme, exon 23 a-exclu isoforme ou deux isoformes sont utilisés (Figure 2 ). Les sondes sont utilisées sur des sections de tissu côté coupé. Afin d’assurer l’exactitude du calcul, il est essentiel que les sections de trois tissus sont traitées exactement de la même dans les étapes de détection de signaux, amplification et l’hybridation.<ol>
<li>Sonde d’hybridation.<ol>
<li>Retirer le panier de lavage de la glisse et touchez le liquide en excès de la glisse. Déposer les lames dans le panier de la tache.</li>
			<li>Utiliser un crayon pour marquer les lames avec le nom de la sonde. Mettre les trois lames de tissu de cerveau adjacente coupe être hybridée avec trois différentes sondes de Nf1 (Figure 2) ensemble. Réalisez les étapes suivantes dans l’ordre des diapositives.</li>
			<li>Ajouter 4 gouttes de sonde pour couvrir le tissu. Celui-ci glissière à la fois pour éviter que les sections se dessèchent. Placez la grille de tache dans la barre de contrôle d’humidité et insérez-le dans le four à 40 ° C pendant 2 h.</li>
			<li>Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage. Pour chaque lavage, remplir le plat de coloration avec 200 mL de 1 x tampon de lavage et placez un panier de lavage en elle. Tapez sur le liquide en excès sur une une diapositive serviette de papier à la fois et insérer rapidement dans le panier de lavage. La grille coulissante Monter et descendre dans le plat pour 3 à 5 fois pendant 2 min à température ambiante.</li>
			<li>Pour le deuxième lavage, utilisez le tampon de lavage douce.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplification du signal.<ol>
<li>Appuyez sur le tampon de lavage excessif de la glisse et placez-les dans le panier de la tache. Ajouter 4 gouttes de AMP 0 pour couvrir le tissu. Placez la grille de tache dans la barre de contrôle d’humidité et placez-le dans le four pendant 30 min à 40 ° C.</li>
			<li>Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage tel que décrit ci-dessus.</li>
			<li>Répétez cette étape avec AMP 1 à 6 suivant l’ordre et la condition du tableau 2. Laver les lames deux fois après chaque étape de l’hybridation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Détection de signal<ol>
<li>Appuyez sur le tampon de lavage excessif de la glisse et placez-les dans tache rack. Ajouter 2 µL de Fast Red B à 120 µL de Fast Red (un ratio de 1/60) dans un tube de microcentrifuge. Bien mélanger et ajouter pour couvrir entièrement la section de tissu. Remarque : Le volume total de rouge A / B mix est basé sur le nombre et la taille des sections de tissu. Une zone de 0,75 '' x 0,75 '', 120 µL est suffisante pour une section. Utiliser le mélange de moins de 5 min et éviter l’exposition du mélange aux rayons directs du soleil ou lumière UV.</li>
			<li>Fermer le tiroir et incuber pendant 10 min à RT. supprimer la solution d’un conteneur à déchets et immédiatement insérer les diapositives dans un rack de lavage et placez la grille dans un plat de lavage rempli avec l’eau du robinet. Rincer à nouveau à l’eau fraîche.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contre-coloration des diapositives
	<ol>
<li>Enlever le panier de lavage l’eau du robinet puis appuyez rapidement sur du papier absorbant pour enlever l’eau d’appoint. Placer la grille dans un hématoxyline 50 % solution de coloration et immédiatement déplacer le panier et descendre plusieurs fois. Incuber pendant 2 min à température ambiante.</li>
		<li>Transfert de la grille coulissante dans le plat de l’eau du robinet. Lavez 3 à 5 fois en déplaçant le support haut et en bas et changer l’eau fraîche du robinet jusqu'à ce que les lames deviennent claires, tandis que les tissus cérébraux restent pourpres.</li>
		<li>Déplacer la grille d’un plat contenant de l’eau ammoniaque 0,02 %. Le rack monter et descendre 2 à 3 fois jusqu'à ce que les tissus deviennent bleus. Laver les diapositives 3 à 5 fois avec l’eau douce dans un plat de coloration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage des échantillons
	<ol>
<li>Passer la grille coulissante de la coloration plat à une étuve à 60 ° C et incuber pendant au moins 15 minutes, jusqu'à ce que les lames soient complètement secs.</li>
		<li>Déposer 40 µL de milieu de montage sur la lame et placer soigneusement un lamelle couvre-objet 24 x 50 mm sur la mèche de tissu. Air secs diapositives pendant 30 min à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. collecte des données et l’analyse
Remarque : Utiliser un scanner de diapositives à numériser les images à un grossissement de 40 X.
<ol><li>
Témoins positifs et négatifs
	<ol>
<li>Pour chaque expérience, incluent des contrôles positifs et négatifs (Figure 3). Comme un bon témoin positif, signal devrait être visible sous forme de points ponctuées au grossissement X 20-40.</li>
		<li>Utilisation de la souris (Mm) - CRTAP - 1ZZ comme témoin positif. Cette sonde cible un gène de ménage commun CRTAP. Contrôle négatif, un point pour chaque 20 cellules affichant le fond de coloration par champ de microscope 20 X est acceptable.</li>
		<li>Utiliser la sonde DapB-1ZZ comme témoin négatif. Cette sonde s’adresse la dapB gène bactérien. Ces sondes de contrôle ont été utilisés dans beaucoup de tests ISH19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Détection du signal et analyse de comme modèles d’expression de Nf1 exon 23 a
	<ol>
<li>Comme les signaux d’hybridation sont indiqués comme points ponctuées, compter les points manuellement. Le nombre de points est corrélé avec le niveau de la transcription qui est détecté par une sonde spécifique. Notez que le nombre de points peut également être analysé par les logiciels ImageJ ou SpotStudio.</li>
		<li>Utilisez trois sondes d’hybridation exon contenant 23 a, exon 23 a-manque isoformes ou transcriptions de Nf1 totales (Figure 2). Comme les trois sondes ne peuvent pas être utilisés simultanément, utilisez trois sections de tissu de cerveau adjacent se pour hybrider à chaque sonde.<ol>
<li>Pour calculer le pourcentage (PSI) de combiner ainsi pour exon 23 a, compter le nombre de cellules et de points dans plusieurs régions du cerveau. Pour chacune des régions d’intérêt compte plus de 400 cellules de plusieurs sous-régions comme il est indiqué dans la Figure 4.</li>
			<li>Collecter les données des mêmes sous-régions pour chacune des trois sondes. Calculer PSI en nombre de points par la cellule avec la sonde d’inclusion exon 23 a / (nombre de points par la cellule avec la sonde d’inclusion exon 23 a + le nombre de point par la cellule avec l’exon23a sonde à sauter) x 100 %.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette communication rend l’utilisation de BaseScope ARN ISH pour examiner comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Il est démontré que la jonction anti-sens exon-exon sondes plus courte que 50 nucléotides peuvent cibler inclusion exon et sauter les isoformes solidement et plus précisément. En outre, les signaux qui en résulte peuvent être utilisés pour calculer les PSI d’un exon alternatif.
Quelques variantes ont été testées dans la procédure. Par exemple, des coupes ...

Épissage alternatif (AS) est un processus commun qui se produit au cours de la maturation de l’ARN pré-messager. Dans ce processus, un exon peut figurer différemment dans l’ARNm mature. Ainsi, par le biais de AS, un gène peut générer plusieurs ARNm ce code pour produits protéiques différents. Il est estimé que 92 à 94 % des gènes humains subissent une variante épissage1,2. Épissage des patrons d’anormale alternatif résulte de mutations génétiques ont été liées à un grand nombre de maladies, y compris la sclérose latérale amyotrophique, la dystrophie myotonique et cancer3,4. Il est donc crucial d’enquêter et de mieux comprendre les mécanismes de régulation épissage alternatifs pour tenter de trouver de nouveaux traitements des maladies humaines.
COMME est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. Il est important de déterminer le modèle AS d’expression d’un gène spécifique dans un système biologique donné. Toutefois, cela se complique quand un organe complexe qui contient de nombreux types de cellules, comme le cerveau ou le cœur, est étudié. Dans ce cas, un choix idéal de système de dosage est RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de tissus des sections pour le modèle AS d’expression d’un gène spécifique peut être détecté dans de nombreux types de cellules en même temps. En effet, des sondes exon-spécifiques ont été utilisés pour évaluer le niveau d’expression d’un autre exon5,6,7. Toutefois, cette approche n’est pas bien adaptée pour que l’analyse des habitudes pour les raisons suivantes. Tout d’abord, les classiques méthodes ISH utilisent généralement des sondes de plus de 300 bp, alors que la taille moyenne des vertébrés exons internes (pas premier ou le dernier exon) est 170 nucléotides8,9. Deuxièmement, lorsqu’une sonde exon spécifique est utilisée pour examiner le modèle d’épissage d’un exon alternatif interne, l’isoforme d’ARNm uniquement détecté par la sonde est celle qui contient l’exon, tandis que l’isoforme ARNm sans l’exon ne peuvent pas être détecté. Ainsi, le calcul du pourcentage épissé en valeur (lb/po2) pour l’autre exon est compliqué. En outre, ISH fluorescent conventionnel combine souvent ISH immunomarquage, ce qui réduit l’efficacité de la détection et la robustesse. Par exemple, dans une étude qui a enquêté sur le stress induit par l’épissage isoforme de commutation de l’acétylcholinestérase (AChE) mRNA, digoxigénine fut incorporée à la sonde de l’ISH et détectés en utilisant des anticorps anti-digoxigénine. Par ailleurs, sonde marquée à la biotine a été détectée par un conjugué à la phosphatase alcaline/streptavidine et un substrat de la phosphatase alcaline10. Aucune méthode utilise toute stratégie d’amplification pour augmenter la sensibilité de détection. En conséquence, il est difficile de détecter des transcriptions d’ARNm qui sont expriment à de faibles niveaux. Ainsi, un système de dosage ISH plus simple et plus robuste est nécessaire pour analyser comme expression patterns in situ.
BaseScope a été récemment développé basé sur la plate-forme de RNAscope, un bien établi et largement utilisé le système d’essai ISH. Les deux systèmes de dosage emploient une technologie d’amplification spécifique à la cible qui augmente la sensibilité de détection11,12. Ce qui distingue une de l’autre est la longueur de la séquence cible, qui est aussi courte que 50 nucléotides pour BaseScope et 300 – 1 000 nucléotides pour RNAscope. Ainsi, il est possible aux sondes de conception qui ciblent les jonctions exon-exon pour détecter des isoformes de mRNA alternatives spécifiques. Dans cette étude, une procédure a été créée pour examiner comme modèles d’expression de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) exon 23 a, un autre exon largement étudié dans le même laboratoire13,14,15 , 16 , 17, dans les sections de cerveau de souris. Les résultats démontrent que le BaseScope est un système idéal pour étudier les profils d’expression de Nf1 exon 23 bis in situ. Comme ce système de dosage peut être adapté à analyser comme modèles d’expression de nombreuses alternatives exons, il représente un nouvel outil puissant dans les études d’As.

<table><tbody><tr><td>EquipmentFour d’hybridation</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td> Plateau de contrôle de <td></td></tr><tr><td>l’humidité (avec couvercle)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III Incubateur à usage général</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de lames</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reagents</td><<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> strong>Kit de prétraitement</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protéase III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reactive Kit</td> de <td>réactifs Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de contrôle négatif - Souris DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de contrôle positif - Souris (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle Souris Miniature 3T3 Cell Diagnostics</td><td>avancés</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Autres fournitures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier</td><td>Pen Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>solution formalde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Montage Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-arnm dans les sections de cerveau de souris à l’aide de rna essai in situ hybridation avec

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Épissage alternatif (AS) se produit dans plus de 90 % des gènes humains. Le modèle d’expression d’un exon épissé alternativement est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. COMME expression patterns sont généralement analysés par RT-PCR et RNA-seq en utilisant des échantillons d’ARN isolé d’une population de cellules. In situ examen de comme modèles d’expression d’une structure biologique particulière peut être effectué par RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de sondes spécifiques exon. Toutefois, cet usage particulier de l’ISH a été limité, car l’alternatives exons sont généralement trop courtes pour la conception des sondes spécifiques exon. Dans ce rapport, l’utilisation de BaseScope, une technologie récemment développée qui emploie courts oligonucléotides antisens dans RNA ISH, est décrite pour analyser comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Exon 23 a de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) est utilisé comme un exemple pour illustrer que sondes jonction exon-exon courte pièce signaux d’hybridation robuste avec une spécificité élevée dans l’analyse des ARN ISH sur des coupes de cerveau de souris. Plus important encore, signaux détectés avec des sondes spécifiques inclusion et sautant exon peuvent servir à calculer fiablement le pourcentage épissé dans les valeurs de Nf1 exon 23 a expression dans différentes zones anatomiques d’un cerveau de souris. Le protocole expérimental et la méthode de calcul pour analyse sont présentés. Les résultats indiquent que BaseScope fournit un nouvel outil puissant pour évaluer en tant qu’expression patterns in situ.

BaseScope ISH a été réalisée à l’aide de trois souches de souris : souris de type sauvage CD1, souris de type sauvage C57BL/6J et souris mutantes Nf123aIN/23aIN dans le fond de C57BL/6J, dans quel exon 23 bis est inclus dans tous les types de cellules à la suite de site d’épissage d’ingénierie les mutations14,15.
Dans un premier temps, le système de ...

Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épissage alternatif des pré-ARNm. Plus précisément, il fournit un système de dosage robuste et sensible pour examiner des modèles d’épissage alternatifs in situ dans des coupes de tissus. Avec cette méthode, l’épissage alternatif peut être analysé simultanément dans de nombreux sous-types contenus dans des structures biologiques complexes telles qu’un cerveau de souris.Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des sondes de jonction d’exon antistatiques de choc dans l’hybridation in situ de l’ARNm pour produire des signaux d’hybridation spécifiques aux isoformes. La technologie d’amplification du signal du bâtiment augmente la sensibilité de la détection pour fournir des signaux d’hybridation robustes. Les signaux détectés étaient des inclusions d’exon échappant à des sondes spécifiques qui sont utilisées pour calculer le pourcentage d’épissage dans les signes vitaux à différentes zones anatomiques du cerveau d’une souris.Dans cette étude, l’exon NF1 23a est utilisé comme exemple pour illustrer l’utilisation du système de dosage. Cependant, le système peut être adapté à l’analyse des modèles d’expression de nombreux exons alternatifs. Pour démarrer la paraffination de la section D du cerveau de souris, remplissez deux plats de lavage avec 250 millilitres de xylène.Et deux autres avec 250 millilitres d’éthanol à 100 % à l’intérieur d’une hotte. Insérez les lames de mouchoir dans un support de lavage. Ensuite, placez la grille de lavage dans un plat contenant du xylène et incubez pendant cinq minutes tout en déplaçant la grille de haut en bas au moins trois fois et répétez l’opération avec le deuxième plat contenant du xylène.Placez ensuite la grille dans un plat contenant de l’éthanol et incubez pendant deux minutes avec les mêmes mouvements de haut en bas, puis répétez avec le deuxième plat à l’éthanol. Pour sécher les lames, déplacez la grille du deuxième plat d’éthanol et placez-la dans un incubateur à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, dessinez une barrière de 0,75 pouce sur 0,75 pouce autour de la section du tissu et séchez-le à l’air libre pendant trois minutes à température ambiante.Allumez le four d’hybridation et réglez la température à 40 degrés Celsius. Après avoir complètement mouillé le papier humidificateur avec de l’eau distillée, placez-le dans un bac de contrôle de l’humidité. Insérez ensuite le plateau de contrôle de l’humidité dans le four d’hybridation.Après avoir placé les lames séchées sur un banc, couvrez complètement les sections de tissu de chaque lame avec cinq à huit gouttes de solution de peroxyde d’hydrogène. Incuber 10 minutes à température ambiante. Tapotez les lames sur un papier absorbant, une à la fois pour retirer la solution de peroxyde d’hydrogène et insérez-les dans un support de lavage.Plongez la grille dans un plat contenant de l’eau tout en la déplaçant de haut en bas trois à cinq fois pour laver les lames. Remplissez un bécher en verre d’un litre placé sur une plaque chauffante avec 700 millilitres de traitement d’élimination de la cible 1X et couvrez-le d’une feuille d’aluminium. Insérez un thermomètre à travers le couvercle en aluminium et allumez la plaque chauffante, réglée à haute température pendant 10 à 15 minutes.Une fois que la température du réactif de récupération atteint 98 degrés Celsius, réglez la plaque chauffante à basse température pour maintenir une condition d’ébullition douce. Ensuite, retirez délicatement le papier d’aluminium et placez la grille à l’intérieur du bécher. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et incuber pendant 15 minutes.À l’aide d’une pince, transférez la grille du bécher dans un plat contenant 200 millilitres d’eau distillée et incubez pendant 15 secondes. Après 15 secondes, placez la grille dans un plat contenant 100 % d’éthanol et incubez pendant trois minutes. Retirez la grille du plat et séchez-la à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après avoir placé les lames sur un support de coloration, couvrez les sections de tissu avec cinq gouttes de protéase 3 par lame. Placez délicatement la grille dans le plateau de contrôle de l’humidité et insérez la plaque dans le four d’hybridation et incubez à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir retiré le support du plateau, tapotez les lames pour éliminer l’excès de liquide et insérez-les dans un support de lavage.Placez la grille dans un plat de lavage contenant de l’eau distillée et déplacez la grille de haut en bas trois à cinq fois pour laver les lames. Pour préparer l’hybridation in situ, incubez les sondes et les réactifs AMP à température ambiante pendant 30 minutes. Insérez le plateau de contrôle de l’humidité dans le four d’hybridation et réglez à 40 degrés Celsius.Pour l’hybridation de la sonde, retirez les lames du support de lavage et tapotez-les pour éliminer l’excès de liquide. Placez les lames sur un support de teinture. Utilisez un crayon pour étiqueter les lames avec le nom de la sonde.Placez trois lames de tissu cérébral coupées de manière adjacente à hybrider avec trois sondes différentes de type mitose de fibre neurale un. Comme il existe des sondes spécifiques aux isoformes très différentes, j’utilise des coupes de tissus coupées de manière adjacente. Il est essentiel que ces sections soient traitées exactement de la même manière dans les étapes d’hybridation, d’amplification et de détection du signal afin de garantir la précision du pourcentage d’épissage dans le calcul.Couvrez les sections de tissus avec quatre gouttes de sonde par section, une lame à la fois pour éviter le dessèchement des sections. Placez ensuite la grille de teinture dans le bac de contrôle de l’humidité et insérez-la dans le four à 40 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, placez une grille de lavage dans un plat rempli de 200 millilitres de tampon de lavage 1X.Tapotez ensuite chaque lame, une à la fois sur une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Et insérez immédiatement chaque glissière dans le support de lavage. Incuber à température ambiante pendant deux minutes dans un plat rempli d’un tampon de lavage frais tout en déplaçant la grille de haut en bas trois à cinq fois, puis répétez le lavage dans un nouveau plat.Pour amplifier le signal, tapotez chaque diapositive pour retirer l’excès de tampon de lavage et placez-les sur un support à taches. Couvrez la section de tissu de chaque lame avec quatre gouttes de réactif AMP zero. Ensuite, placez la grille dans le plateau de contrôle de l’humidité, insérez la plaque dans le four et incubez à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.Lavez la lame deux fois avec un tampon de lavage comme cela a été fait précédemment dans cette expérience. Répétez l’étape d’amplification du signal avec les réactifs AMP un à six comme décrit dans le protocole texte et lavez les lames après chaque étape. Pour la détection des signaux, retirez l’excès de tampon de lavage des diapositives en tapotant et placez-les sur un support à taches.Ensuite, mélangez deux microlitres de rouge rapide B avec 120 microlitres de rouge rapide A dans un micro-tube à centrifuger. Ajoutez la solution aux sections de tissu sur chaque lame pour les couvrir complètement. Placez le support de teinture dans le bac de contrôle de l’humidité, couvrez le plateau et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.Retirez ensuite la solution et insérez les lames dans un support de lavage. Placez la grille dans un plat de lavage contenant de l’eau du robinet pour laver les lames et répétez le lavage. Après le deuxième lavage, tapotez sur un papier absorbant pour enlever l’excès d’eau.Ensuite, placez la grille dans un plat contenant une solution de coloration à 50 % d’hématoxyline. Déplacez le support de haut en bas plusieurs fois. Et incubez pendant deux minutes à température ambiante.Transférez la grille dans un plat à laver contenant de l’eau du robinet. Déplacez le support de haut en bas cinq fois et répétez le lavage jusqu’à ce que les lames deviennent claires, tandis que les sections de mouchoirs restent violettes. Transférez ensuite la grille dans un plat contenant 0,02 % d’eau ammoniacale.Déplacez le support de haut en bas deux à quatre fois jusqu’à ce que les sections deviennent bleues. Lavez les lames à l’eau du robinet trois à cinq fois dans le plat de coloration. Ensuite, placez le support à l’intérieur d’un incubateur et incubez pendant 15 minutes à 60 degrés Celsius pour sécher les lames.Une fois complètement sec, ajoutez une goutte de support de montage sur chaque lame pour couvrir la tranche. Ensuite, placez soigneusement une lamelle de 24 x 50 millimètres sur les sections de tissu de chaque lame. Après avoir séché les lames à l’air libre pendant 30 minutes à température ambiante, procédez à la collecte des données.Pour calculer le pourcentage d’épissage ou la valeur PSI de l’exon 23a, le nombre de cellules et de points dans trois sous-régions du cortex et de l’hippocampe CA3 est compté. Le test d’hybridation in situ de l’ARN est réalisé dans des coupes cérébrales de souris de type sauvage CD1 à l’aide de trois sondes spécifiques différentes de NF1. Les points ponctués rouges observés dans les sections du cortex et de l’hippocampe indiquent des signaux positifs par NF1 total, spécifique à l’inclusion et sautant des sondes spécifiques.Les signaux ISH des trois sondes sont ensuite comptés et utilisés pour calculer le PSI. L’essai d’hybridation in situ de l’ARN est effectué dans le cortex de souris noires de type sauvage C57 6J et de souris mutantes noires C57 6J dans lesquelles l’exon 23a est inclus dans tous les types de cellules. Des points ponctués rouges observés dans le cortex de souris de type sauvage C57 noires 6J indiquent des signaux positifs par des sondes spécifiques NF1 totales, spécifiques à l’inclusion et sautant spécifiques.Chez les souris mutantes noires C57 6J, des signaux similaires sont obtenus par des sondes NF1 totales et spécifiques aux inclusions. Cependant, aucun signal n’est détecté lors de l’utilisation d’une sonde spécifique de saut, ce qui indique que deux sondes ciblant l’inclusion ou le saut d’exon sont très spécifiques. Étant donné que l’étiquetage multicolore sur les mêmes lames de tissu n’est pas encore disponible pour cette procédure, différentes sondes sont utilisées sur les différentes lames de tissu.Pour obtenir les valeurs précises de pourcentage d’épissage, il est important d’utiliser des lames coupées de manière adjacente et de traiter les lames exactement de la même manière tout au long de cette procédure. En complément de cette procédure, des mesures telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la localisation et la fonction des isoformes d’épissage exprimées de manière différentielle.

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et...

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Cette vidéo démontre la détection de la synthèse de l’ARN du récepteur de la sérotonine à l’aide de sondes oligonucléotidiques dans le tissu cérébral du rat affecté par le syndrome sérotoninergique. Le protocole comprend le prétraitement tissulaire, l’hybridation de sondes et la détection enzymatique pour visualiser et quantifier l’expression de l’ARN du récepteur de la sérotonine au microscope.

Hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques pour étudier l’expression de l’ARN dans des sections de cerveau de rat

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

Il a été démontré que la régulation de l’épissage alternatif  contribue à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant un modèle EMT inductible pour la détection d’épissages alternatifs pendant l’EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques des modèles parentaux et résistants in vitro par l' ARN-seq et établi une méthode basée qRT-PCR pour valider les gènes candidats.

En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

L’épissage alternatif (AS) et la polyadénylation alternative (APA) élargissent la diversité des isoformes de transcrits et de leurs produits. Ici, nous décrivons des protocoles bioinformatiques pour analyser les tests de séquençage d’ARN en vrac et de séquençage à 3' pour détecter et visualiser l’AS et l’APA variant selon les conditions expérimentales.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

Nous avons mis au point un test d’hybridation in situ Duplex pour cartographier les isoformes IR-A et IR-B des récepteurs de l’insuline dans le plexus choroïde murin, surmontant ainsi les limites des méthodes traditionnelles. Cette approche à haute résolution révèle l’expression spécifique des isoformes, offrant de nouvelles perspectives sur la signalisation de l’insuline cérébrale et les thérapies potentielles ciblées sur les isoformes pour les troubles neurologiques.

Visualisation précise des récepteurs A et B de l’insuline dans le cerveau murin avec un test d’hybridation in situ de l’ARN

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Découvrez une méthode d'hybridation in situ pour analyser l'épissage alternatif de l'ARN pré-messager dans les sections de cerveau de souris. Cette technique utilise des oligonucléotides antisens courts et une amplification du signal pour détecter les isoformes spécifiques avec une grande sensibilité.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Explorer plus de vidéos