Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épissage alternatif des pré-ARNm. Plus précisément, il fournit un système de dosage robuste et sensible pour examiner des modèles d’épissage alternatifs in situ dans des coupes de tissus. Avec cette méthode, l’épissage alternatif peut être analysé simultanément dans de nombreux sous-types contenus dans des structures biologiques complexes telles qu’un cerveau de souris.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des sondes de jonction d’exon antistatiques de choc dans l’hybridation in situ de l’ARNm pour produire des signaux d’hybridation spécifiques aux isoformes. La technologie d’amplification du signal du bâtiment augmente la sensibilité de la détection pour fournir des signaux d’hybridation robustes. Les signaux détectés étaient des inclusions d’exon échappant à des sondes spécifiques qui sont utilisées pour calculer le pourcentage d’épissage dans les signes vitaux à différentes zones anatomiques du cerveau d’une souris.

Dans cette étude, l’exon NF1 23a est utilisé comme exemple pour illustrer l’utilisation du système de dosage. Cependant, le système peut être adapté à l’analyse des modèles d’expression de nombreux exons alternatifs. Pour démarrer la paraffination de la section D du cerveau de souris, remplissez deux plats de lavage avec 250 millilitres de xylène.

Et deux autres avec 250 millilitres d’éthanol à 100 % à l’intérieur d’une hotte. Insérez les lames de mouchoir dans un support de lavage. Ensuite, placez la grille de lavage dans un plat contenant du xylène et incubez pendant cinq minutes tout en déplaçant la grille de haut en bas au moins trois fois et répétez l’opération avec le deuxième plat contenant du xylène.

Placez ensuite la grille dans un plat contenant de l’éthanol et incubez pendant deux minutes avec les mêmes mouvements de haut en bas, puis répétez avec le deuxième plat à l’éthanol. Pour sécher les lames, déplacez la grille du deuxième plat d’éthanol et placez-la dans un incubateur à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, dessinez une barrière de 0,75 pouce sur 0,75 pouce autour de la section du tissu et séchez-le à l’air libre pendant trois minutes à température ambiante.

Allumez le four d’hybridation et réglez la température à 40 degrés Celsius. Après avoir complètement mouillé le papier humidificateur avec de l’eau distillée, placez-le dans un bac de contrôle de l’humidité. Insérez ensuite le plateau de contrôle de l’humidité dans le four d’hybridation.

Après avoir placé les lames séchées sur un banc, couvrez complètement les sections de tissu de chaque lame avec cinq à huit gouttes de solution de peroxyde d’hydrogène. Incuber 10 minutes à température ambiante. Tapotez les lames sur un papier absorbant, une à la fois pour retirer la solution de peroxyde d’hydrogène et insérez-les dans un support de lavage.

Plongez la grille dans un plat contenant de l’eau tout en la déplaçant de haut en bas trois à cinq fois pour laver les lames. Remplissez un bécher en verre d’un litre placé sur une plaque chauffante avec 700 millilitres de traitement d’élimination de la cible 1X et couvrez-le d’une feuille d’aluminium. Insérez un thermomètre à travers le couvercle en aluminium et allumez la plaque chauffante, réglée à haute température pendant 10 à 15 minutes.

Une fois que la température du réactif de récupération atteint 98 degrés Celsius, réglez la plaque chauffante à basse température pour maintenir une condition d’ébullition douce. Ensuite, retirez délicatement le papier d’aluminium et placez la grille à l’intérieur du bécher. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et incuber pendant 15 minutes.

À l’aide d’une pince, transférez la grille du bécher dans un plat contenant 200 millilitres d’eau distillée et incubez pendant 15 secondes. Après 15 secondes, placez la grille dans un plat contenant 100 % d’éthanol et incubez pendant trois minutes. Retirez la grille du plat et séchez-la à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir placé les lames sur un support de coloration, couvrez les sections de tissu avec cinq gouttes de protéase 3 par lame. Placez délicatement la grille dans le plateau de contrôle de l’humidité et insérez la plaque dans le four d’hybridation et incubez à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir retiré le support du plateau, tapotez les lames pour éliminer l’excès de liquide et insérez-les dans un support de lavage.

Placez la grille dans un plat de lavage contenant de l’eau distillée et déplacez la grille de haut en bas trois à cinq fois pour laver les lames. Pour préparer l’hybridation in situ, incubez les sondes et les réactifs AMP à température ambiante pendant 30 minutes. Insérez le plateau de contrôle de l’humidité dans le four d’hybridation et réglez à 40 degrés Celsius.

Pour l’hybridation de la sonde, retirez les lames du support de lavage et tapotez-les pour éliminer l’excès de liquide. Placez les lames sur un support de teinture. Utilisez un crayon pour étiqueter les lames avec le nom de la sonde.

Placez trois lames de tissu cérébral coupées de manière adjacente à hybrider avec trois sondes différentes de type mitose de fibre neurale un. Comme il existe des sondes spécifiques aux isoformes très différentes, j’utilise des coupes de tissus coupées de manière adjacente. Il est essentiel que ces sections soient traitées exactement de la même manière dans les étapes d’hybridation, d’amplification et de détection du signal afin de garantir la précision du pourcentage d’épissage dans le calcul.

Couvrez les sections de tissus avec quatre gouttes de sonde par section, une lame à la fois pour éviter le dessèchement des sections. Placez ensuite la grille de teinture dans le bac de contrôle de l’humidité et insérez-la dans le four à 40 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, placez une grille de lavage dans un plat rempli de 200 millilitres de tampon de lavage 1X.

Tapotez ensuite chaque lame, une à la fois sur une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Et insérez immédiatement chaque glissière dans le support de lavage. Incuber à température ambiante pendant deux minutes dans un plat rempli d’un tampon de lavage frais tout en déplaçant la grille de haut en bas trois à cinq fois, puis répétez le lavage dans un nouveau plat.

Pour amplifier le signal, tapotez chaque diapositive pour retirer l’excès de tampon de lavage et placez-les sur un support à taches. Couvrez la section de tissu de chaque lame avec quatre gouttes de réactif AMP zero. Ensuite, placez la grille dans le plateau de contrôle de l’humidité, insérez la plaque dans le four et incubez à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Lavez la lame deux fois avec un tampon de lavage comme cela a été fait précédemment dans cette expérience. Répétez l’étape d’amplification du signal avec les réactifs AMP un à six comme décrit dans le protocole texte et lavez les lames après chaque étape. Pour la détection des signaux, retirez l’excès de tampon de lavage des diapositives en tapotant et placez-les sur un support à taches.

Ensuite, mélangez deux microlitres de rouge rapide B avec 120 microlitres de rouge rapide A dans un micro-tube à centrifuger. Ajoutez la solution aux sections de tissu sur chaque lame pour les couvrir complètement. Placez le support de teinture dans le bac de contrôle de l’humidité, couvrez le plateau et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.

Retirez ensuite la solution et insérez les lames dans un support de lavage. Placez la grille dans un plat de lavage contenant de l’eau du robinet pour laver les lames et répétez le lavage. Après le deuxième lavage, tapotez sur un papier absorbant pour enlever l’excès d’eau.

Ensuite, placez la grille dans un plat contenant une solution de coloration à 50 % d’hématoxyline. Déplacez le support de haut en bas plusieurs fois. Et incubez pendant deux minutes à température ambiante.

Transférez la grille dans un plat à laver contenant de l’eau du robinet. Déplacez le support de haut en bas cinq fois et répétez le lavage jusqu’à ce que les lames deviennent claires, tandis que les sections de mouchoirs restent violettes. Transférez ensuite la grille dans un plat contenant 0,02 % d’eau ammoniacale.

Déplacez le support de haut en bas deux à quatre fois jusqu’à ce que les sections deviennent bleues. Lavez les lames à l’eau du robinet trois à cinq fois dans le plat de coloration. Ensuite, placez le support à l’intérieur d’un incubateur et incubez pendant 15 minutes à 60 degrés Celsius pour sécher les lames.

Une fois complètement sec, ajoutez une goutte de support de montage sur chaque lame pour couvrir la tranche. Ensuite, placez soigneusement une lamelle de 24 x 50 millimètres sur les sections de tissu de chaque lame. Après avoir séché les lames à l’air libre pendant 30 minutes à température ambiante, procédez à la collecte des données.

Pour calculer le pourcentage d’épissage ou la valeur PSI de l’exon 23a, le nombre de cellules et de points dans trois sous-régions du cortex et de l’hippocampe CA3 est compté. Le test d’hybridation in situ de l’ARN est réalisé dans des coupes cérébrales de souris de type sauvage CD1 à l’aide de trois sondes spécifiques différentes de NF1. Les points ponctués rouges observés dans les sections du cortex et de l’hippocampe indiquent des signaux positifs par NF1 total, spécifique à l’inclusion et sautant des sondes spécifiques.

Les signaux ISH des trois sondes sont ensuite comptés et utilisés pour calculer le PSI. L’essai d’hybridation in situ de l’ARN est effectué dans le cortex de souris noires de type sauvage C57 6J et de souris mutantes noires C57 6J dans lesquelles l’exon 23a est inclus dans tous les types de cellules. Des points ponctués rouges observés dans le cortex de souris de type sauvage C57 noires 6J indiquent des signaux positifs par des sondes spécifiques NF1 totales, spécifiques à l’inclusion et sautant spécifiques.

Chez les souris mutantes noires C57 6J, des signaux similaires sont obtenus par des sondes NF1 totales et spécifiques aux inclusions. Cependant, aucun signal n’est détecté lors de l’utilisation d’une sonde spécifique de saut, ce qui indique que deux sondes ciblant l’inclusion ou le saut d’exon sont très spécifiques. Étant donné que l’étiquetage multicolore sur les mêmes lames de tissu n’est pas encore disponible pour cette procédure, différentes sondes sont utilisées sur les différentes lames de tissu.

Pour obtenir les valeurs précises de pourcentage d’épissage, il est important d’utiliser des lames coupées de manière adjacente et de traiter les lames exactement de la même manière tout au long de cette procédure. En complément de cette procédure, des mesures telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la localisation et la fonction des isoformes d’épissage exprimées de manière différentielle.