Name: Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Apprenez à utiliser le minigène E1A2 pour évaluer les changements d'épissage alternatif de l'ARNm après chimiothérapie. Cette méthode simple et économique utilise des cellules HEK 293 stables pour étudier la fonction des protéines.

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Nous remercions la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, par le biais de Grant Temático 2017/03489-1 à JK et de la bourse à FLB 2018/05350-3) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pour le financement de cette recherche. Nous tenons à remercier le Dr Adrian Krainer d’avoir fourni le plasmide pMTE1A et Zerler et ses collègues pour leur travail sur le clonage E1A. Nous remercions également le Prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti et prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller pour nous permettre d’utiliser leur espace de laboratoire et leur équipement.

1. Placage des cellules
REMARQUE: Dans ce protocole décrit, les lignées cellulaires stables HEK293, précédemment générées pour une expression inductible stable de Nek4 ont été utilisées21,cependant, le même protocole convient à de nombreuses autres lignées cellulaires, telles que HEK29322,HeLa23, 24,25, 26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. Le modèle d’expression des isoformes du minigène E1A dans des conditions basiques varie entre ces cellules et devrait être caractérisé pour chaque condition. Ce protocole n’est pas limité aux lignées cellulaires stables. L’approche la plus courante dans l’évaluation de la protéine candidate est par co-transfection transitoire d’augmenter sa quantité avec la quantité fixe du minigène. Le même protocole convient aux cellules knockout.
<ol><li>Cellules de plaque tenant compte des contrôles de véhicule, non transfectés et GFP.</li>
	<li>Culture de cellules HEK293 avec expression stable du gène d’intérêt dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complétées par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 4,5 g/L de glucose, 4 mM de L-glutamine et conservent avec 100 μg/mL d’hygromycine B, sur des plaques traitées par culture tissulaire à 37 °C dans 5 % deCO2 et une atmosphère humidifiée.</li>
	<li>Cellules fractionnées à l’aide de 0,25% de trypsine-EDTA. Plaque 3 x 105 cellules dans des plaques à 6 puits et incuber pendant 24 h à 37 °C dans 5 % deCO2. REMARQUE: Pour la transfection, les cellules doivent être 70-80% confluent pour diminuer la mort cellulaire après la transfection.</li>
</ol>2. Transfection cellulaire
REMARQUE: 1-2 μg de plasmide minigène pMTE1A a été utilisé ici, mais la quantité d’ADN, ainsi que le temps d’expression, doivent être maintenus au minimum pour éviter la toxicité. Par exemple, une toxicité élevée a été observée dans les cellules HeLa après 30 h de transfection avec 1 μg d’ADN pMTE1A. Pour la transfection décrite ici, un réactif de transfection à base de lipides a été utilisé
<ol><li>Vérifiez la confluence des cellules 24 h après le placage et transfectez les cellules stables HEK293 uniquement lorsque 70-80% confluent.</li>
	<li>Retirez soigneusement le milieu de culture cellulaire avec une pipette, au lieu d’utiliser un système de pompe à vide. Ajoutez ensuite soigneusement 2 mL de milieu DMEM complet sans antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur.</li>
	<li>Préparer un tube avec le tampon de transfection (200 μL/puits), ajouter 2 μg d’ADN pMTE1A, vortex, puis ajouter 2 μL de réactif de transfection. Vortex à nouveau et incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez soigneusement le mélange de transfection goutte à goutte.</li>
	<li>Aux cellules stables HEK293, ajouter la tétracycline (0,5 μg/mL) pour l’induction de l’expression nek4 6 h après la transfection. Un changement moyen n’est pas nécessaire. REMARQUE : Les volumes/montants décrits dans cette section sont pour un puits. Préparer le mélange pour tous les puits utilisés dans l’expérience dans le même tube.</li>
	<li>Préparer un puits à transfecter avec EGFP, ou un autre fluorophore exprimant le plasmide pour estimer l’efficacité de la transfection. De meilleurs résultats peuvent être observés avec une efficacité de transfection d’au moins 40%, mais de bonnes performances avec une efficacité de transfection inférieure ont été observées précédemment.</li>
	<li>Lors de l’utilisation de la co-transfection (protéine d’intérêt et minigène), gardez un puits avec des cellules non transfectées pour éviter d’obtenir des résultats à partir d’ARNm endogène. Dans le cas d’E1A, les cellules HEK293 expriment déjà le gène E1A30.</li>
</ol>3. Préparation des médicaments
REMARQUE: Le moment et la concentration du traitement ont été choisis en fonction des résultats de la littérature, qui soulignent des changements dans l’épissage alternatif pour certains gènes.
<ol><li>Effectuer une courbe dose-réponse avant de commencer l’essai pour déterminer la concentration minimale à l’induction d’épissage alternative sans effet sur la viabilité cellulaire.</li>
	<li>Préparer une solution mère de Paclitaxel à une concentration de 5 mM dans de l’éthanol. La concentration finale est de 1 μM. Maintenir à -20 °C. Utilisez de l’éthanol à 0,02 % comme véhicule de contrôle.</li>
	<li>Préparer une solution de cisplatine en diluant dans du NaCl à 0,9 % à environ 0,5 mg/mL (1,66 mM). Protéger de la lumière, du vortex et incuber dans un bain thermal, 37 °C pendant 30 min. La concentration finale est de 30 μM. Préparer frais ou conserver à 2-10 °C jusqu’à un mois. REMARQUE: Tous les médicaments doivent être protégés de la lumière.</li>
</ol>4. Traitement cellulaire et prélèvement
REMARQUE: Les cellules stables HEK293 ont été collectées 48 h après la transfection et pour cela ont été traitées 24 h après la transfection car le niveau d’expression Nek4 le plus élevé est atteint dans les 48 h. Cependant, on a observé des niveaux élevés de l’expression isoforme 13S (jusqu’à 90%) à ce moment-là. Pour diminuer la proportion d’isoforme 13S, essayez de traiter et de recueillir les cellules 30 h après transfection maximum.
<ol><li>Utilisez des embouts et des tubes sans ARN/DNase. Effectuer l’extraction de l’ARN total avec un réactif phénol-chloroforme en suivant la recommandation du fabricant.</li>
	<li>24 h après la transfection, vérifier la morphologie cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope fluorescent.</li>
	<li>Retirez le milieu de culture cellulaire, de préférence à l’aide d’une pipette au lieu d’un système de pompe à vide. Ajoutez ensuite le milieu de culture cellulaire avec les agents chimiothérapeutiques dans la concentration finale décrite précédemment.</li>
	<li>Incuber à 37 °C, 5 % deCO2 pendant 18 à 24 h.</li>
	<li>Recueillir l’ARN en jetant le milieu de culture cellulaire dans un récipient et en ajoutant 0,5 à 1 mL de réactif d’extraction d’ARN directement au puits. Si les puits sont très confluents, utilisez 1 mL de réactif d’extraction d’ARN pour améliorer la qualité de l’ARN.</li>
	<li>Homogénéiser avec la pipette et transférer dans un tube centrifuge de 1,5 mL. À ce stade, le protocole peut être mis en pause en stockant des échantillons à -80 °C ou procéder immédiatement à l’extraction de l’ARN. AVERTISSEMENT: Le réactif d’extraction d’ARN à base de phénol est toxique et toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte chimique et les résidus éliminés correctement.</li>
</ol>5. Extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc
<ol><li>Dans une hotte, décongeler les échantillons et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 0,1 à 0,2 mL de chloroforme et agiter vigoureusement.</li>
	<li>Incuber pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Recueillir la phase aqueuse supérieure et le transférer dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 mL. Collecter environ 60% du volume total; cependant, ne collectez pas l’ADN ou la phase organique (inférieure).</li>
	<li>Ajouter 0,25 à 0,5 mL d’isopropanol et agiter par inversion 4 fois. Incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min, à 4 °C et jeter le surnageant.</li>
	<li>Laver la pastille d’ARN deux fois avec de l’éthanol (75 % dans de l’eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC)). Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min et jeter l’éthanol.</li>
	<li>Retirez l’excès d’éthanol en inversant le tube sur un papier essuie-tout, puis laissez le tube ouvert à l’intérieur d’une hotte pour sécher partiellement le culot pendant 5 à 10 min.</li>
	<li>Ressusciter la pastille d’ARN dans 15 μL d’eau traitée au DEPC.</li>
	<li>Quantifier l’ARN total en utilisant l’absorbance à 230 nm, 260 nm et 280 nm pour vérifier la qualité de l’ARN.</li>
	<li>Pour vérifier la qualité totale de l’ARN, faire fonctionner un gel d’agarose à 1% pré-traité avec 1,2% (v/v) d’une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5% pendant 30 min31.</li>
	<li>Effectuer la synthèse de l’ADNc en utilisant 1-2 μg d’ARN total.<ol>
<li>Arn pipélette, 1 μL d’oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) et composent le volume à 12 μL avec de l’eau sans nucléase. Incuber dans le thermocycleur pendant 5 min à 65 °C.</li>
		<li>Prélever des échantillons du thermocycleur pour refroidir et préparer le mélange réactionnel : 4 μL de tampon de transcriptase inverse, 2 μL de dithiothreitol (TNT) et 1 μL d’inhibiteur de la ribonucléase. Incuber à 37 °C pendant 2 min.</li>
		<li>Ajouter 1 μL de transcriptase inverse thermo-stable. Incuber à 37 °C pendant 50 min et inactiver l’enzyme à 70 °C pendant 15 min. REMARQUE: L’ADNc peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs semaines. Effectuer un contrôle de la transcriptase non inverse (TRN) pour la contamination génomique résultant d’événements putatifs de rétention d’intron.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PCR minigène pMTE1A
<ol><li>Effectuer une PCR avec la composition réactionnelle (1,5 mM deMgCl2,0,3 mM de mélange de dNTP, 0,5 μM de chaque amorce, 2,5 U d’une polymérase Taq à chaud et 150 ng d’ADNc) dans les conditions suivantes : 94 °C pendant 2 min, 29 cycles de : 94 °C pendant 1 min, 50 °C pendant 2 min, 72 °C pendant 2 min, 72 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Chargez 20 à 25 μL du produit PCR dans un gel d’agarose à 3 % contenant une coloration d’acide nucléique et courez à 100 V pendant environ 1 h.</li>
</ol>7. Analyse du gel à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images32
<ol><li>Après la course, photographiez le gel (à l’aide d’un système d’acquisition d’imagerie de gel) en évitant toute saturation de bande et quantifiez les bandes à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.</li>
	<li>Pour la quantification, considérez les bandes à ~631 bp, ~493 bp et ~156 bp pour correspondre aux isoformes 13S, 12S et 9S, respectivement.</li>
	<li>Dans le menu Fichier du logiciel, ouvrez le fichier image obtenu à partir du système d’acquisition d’imagerie. Convertissez en niveaux de gris, ajustez la luminosité et le contraste et supprimez le bruit aberrant si nécessaire.</li>
	<li>Dessinez un rectangle autour de la première voie à l’aide de l’outil Sélection de rectangle et sélectionnez-le via l’outil Analyser (Analyze | Gels | Sélectionnez la commande First Lane ou appuyez sur le raccourci clavier qui s’y trouve.</li>
	<li>Utilisez la souris pour cliquer et maintenir au milieu du rectangle sur la première voie et faites-la glisser vers la voie suivante. Aller à Analyser les | Gels | Sélectionnez Next Lane (Voie suivante)ou appuyez sur le raccourci disponible. Répétez cette étape sur toutes les voies restantes.</li>
	<li>Une fois que toutes les voies sont mises en évidence et numérotées, accédez à Analyser les | Gels | Tracez les voies pour dessiner un tracé de profil de chaque voie.</li>
	<li>Avec l’outil sélection en ligne droite, tracez une ligne sur la base de chaque pic correspondant à chaque bande, en omettant le bruit de fond. Une fois que tous les pics, de chaque voie, ont été fermés, sélectionnez l’outil Baguette et cliquez à l’intérieur de chaque pic. Pour chaque pic mis en surbrillance, les mesures doivent apparaître dans la fenêtre Résultats qui s’affiche.</li>
	<li>Additionnez l’intensité des 3 bandes pour chaque échantillon et calculez le pourcentage pour chaque isoforme par rapport au total.</li>
	<li>Tracer les pourcentages de chaque isoforme ou les différences dans le pourcentage par rapport aux échantillons non traités. Remarque : Assurez-vous que la somme de trois variantes E1A doit être égale à 100 %.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les minigènes sont des outils importants pour déterminer les effets de l’épissage alternatif global in vivo. Le minigène adénoviral E1A est utilisé avec succès depuis des décennies pour évaluer le rôle des protéines en augmentant la quantité de celles-ci dans la cellule13,14. Ici, nous proposons l’utilisation du minigene E1A pour évaluer l’épissage alternatif après exposition chimiothérapeutique. Une variété de cellule stable exprimant l’isoforme 1 de Nek4 a été ...

L’épissage est parmi les étapes les plus importantes dans le traitement eucaryote de l’ARNm qui se produit simultanément au capsulage de l’ARNm 5 et à la polyadénylation de l’ARNm 3', comprenant l’élimination de l’intron suivie d’une jonction d’exon. La reconnaissance des sites d’épissage (SS) par l’spliceosome, un complexe ribonucléoprotéine contenant de petites ribonucléoprotéines (snRNP U1, U2, U4 et U6), de petits ARN (snRNAs) et plusieurs protéines régulatrices1 est nécessaire pour l’épissage.
Outre l’élimination des introns (épissage constitutif), chez les eucaryotes, les introns peuvent être conservés et les exons peuvent être exclus, en configurant le processus appelé épissage alternatif de l’ARNm (AS). L’épissage alternatif pré-ARNm élargit la capacité de codage des génomes eucaryotes permettant la production d’un grand nombre et diversifié de protéines à partir d’un nombre relativement faible de gènes. On estime que 95 à 100 % des ARNm humains qui contiennent plus d’un exon peuvent subir un épissage alternatif2,3. Ceci est fondamental pour les processus biologiques tels que le développement neuronal, l’activation de l’apoptose et la réponse au stress cellulaire4, fournissant à l’organisme des alternatives pour réguler le fonctionnement cellulaire en utilisant le même répertoire de gènes.
La machinerie nécessaire à l’épissage alternatif est la même que celle utilisée pour l’épissage constitutif et l’utilisation de la SS est le principal déterminant pour l’épissage alternatif. L’épissage constitutif est lié à l’utilisation de sites d’épissage forts, qui sont généralement plus similaires aux motifs de consensus pour la reconnaissance des spliceosomes5.
Les exons alternatifs sont typiquement reconnus moins efficacement que les exons constitutifs une fois que ses éléments cis-régulateurs, les séquences dans 5'SS et 3'SS flanquant ces exons, montrent une capacité de liaison inférieure au spliceosome. L’ARNm contient également des régions nommées activateurs ou silencieux situés dans les exons (activateurs d’épissage exonique (EES) et silencieux d’épissage exonique (ESS)) et les introns (exhausteurs d’épissage introniques (ISE) et silencieux d’épissage intronique (ISS)) qui améliorent ou répriment l’utilisation de l’exon, respectivement5. Ces séquences sont reconnues par des éléments trans-régulateurs, ou facteurs d’épissage (SF). Les SFs sont représentés principalement par deux familles de protéines, les facteurs d’épissage riches en sérine/arginine (SRSF) qui se lient aux ES et la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPs) qui se lient aux séquences ESSs5.
L’épissage alternatif peut être modulé par phosphorylation/déphosphorylation de trans- facteurs modifiant les interactions partenaires et la localisation cellulaire des facteurs d’épissage6,7,8. L’identification de nouveaux régulateurs des facteurs d’épissage peut fournir de nouveaux outils pour réguler l’épissage et, par conséquent, certains traitements du cancer.
Anufrieva et coll.9,dans un profil d’expression génique de puces à ADN messagère, ont observé des changements constants dans les niveaux de composants splicosomal dans 101 lignées cellulaires et après différentes conditions de stress (médicaments à base de platine, irradiation gamma, inhibiteurs de la topoisomérase, inhibiteurs de tyrosine kinase et taxanes). La relation entre le modèle d’épissage et l’efficacité de la chimiothérapie a déjà été démontrée dans les cellules cancéreuses du poumon, qui sont résistantes à la chimiothérapie, montrant des changements dans le taux de variantes de la caspase-910. Les cellules HEK293 traitées avec le panneau de chimiothérapie montrent des changements dans l’épissage avec une augmentation des variantes pro-apoptotic. Gabriel et coll.11 ont observé des changements dans au moins 700 événements d’épissage après un traitement au cisplatine dans différentes lignées cellulaires, soulignant que les voies d’épissage sont affectées par le cisplatine. Les modulateurs d’épissage ont déjà démontré une activité antitumorale, montrant que l’épissage est important pour le développement tumoral et, principalement, la réponse chimiothérapeutique12. Par conséquent, caractériser de nouvelles protéines qui régulent l’épissage après les agents de stress cellulaires, comme les agents chimiothérapeutiques, est très important pour découvrir de nouvelles stratégies de traitement.
Les indices de régulation alternative d’épissage des études d’interactome, particulièrement importants pour caractériser des fonctions des protéines nouvelles ou non caractérisées, peuvent exiger une approche plus générale et simple pour vérifier le rôle réel de la protéine dans l’AS. Les minigènes sont des outils importants pour l’analyse du rôle général d’une protéine affectant la régulation de l’épissage. Ils contiennent des segments d’un gène d’intérêt contenant alternativement des régions génomiques épissées et flanquantes13. L’utilisation d’un outil de minigène permet l’analyse de l’épissage in vivo avec plusieurs avantages tels que la longueur du minigène qui est mineure et n’est donc pas une limitation à la réaction d’amplification; le même minigène peut être évalué dans différentes lignées cellulaires; tous les composants cellulaires, principalement leur modification post-traductionnelle régulatrice (phosphorylation et changements dans les compartiments cellulaires) sont présents et peuvent être traités13,14. De plus, des changements dans le modèle d’épissage alternatif peuvent être observés après le stress cellulaire et, l’utilisation d’un système minigène, permettent d’identifier la voie modulée par différents stimuli.
Il existe plusieurs systèmes de minigènes déjà décrits qui sont spécifiques à différents types d’événements d’épissage13,14,cependant, en tant qu’essai préliminaire, le minigène E1A15 est un système de rapporteur d’épissage alternatif très bien établi pour l’étude de la sélection 5'SS in vivo. À partir d’un seul gène, E1A, cinq ARNm sont produits par épissage alternatif basé sur la sélection de trois sites d’épissure 5′ différents et d’un site d’épissure majeur ou mineur de 3′16,17,18. L’expression des variantes E1A change en fonction de la période d’infection adénovirale19,20.
Nous avons montré précédemment que les deux isoformes Nek4 interagissent avec des facteurs d’épissage tels que SRSF1 et hnRNPA1 et tandis que l’isoforme 2 change l’épissage alternatif minigène E1A, l’isoforme 1 n’a aucun effet en ce que21. Puisque l’isoforme 1 est l’isoforme la plus abondante et change la résistance de chimiothérapie et la réponse aux dommages d’ADN, nous évaluons si elle pourrait changer l’épissage alternatif du minigène E1A dans un état de stress.
Le dosage minigène est une méthode simple, peu coûteuse et rapide, car il ne nécessite que l’extraction de l’ARN, la synthèse de l’ADNc, l’amplification et les analyses de gel d’agarose, et peut être un outil utile pour évaluer depuis un effet possible sur l’épissage alternatif par une protéine d’intérêt jusqu’à l’effet de différents traitements sur le modèle d’épissage alternatif cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Échelle à ADN 100 pb</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC eau</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition d’imagerie sur gel - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cellules stables - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Généré par Flp-In&trade ; T-REx&commerce ; 293 - Invitrogen et décrit dans la réf 21</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Utilisé pour la maintenance des cellules Flp-In</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement et d’analyse d’images - Logiciel</td><td></td><td></td> FIJI <td>réf. 32</td></tr><tr><td>Réactif de transfection à base de lipides - jetOPTIMUS Polyplus Réactif</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques/ Absorbance UV</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek/ Take3</td></tr> adaptateur <tr><td>pMTE1A plasmide</td><td></td><td></td><td>Fourni par Dr. Adrian Krainer</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse - Exposant IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la ribunucase ARNASE OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Réactif à base de phénol-chloroforme d’extraction d’ARN - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Coloration au gel d’ADN</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Utilisé pour l’induction de l’expression du drapeau vide ou Nek4-</td></tr><tr><td>Flag Thermocycleur Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de l’outil e1a minigene pour étudier les changements d’épissage de l’arnm

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Le traitement de l’ARNm implique plusieurs étapes simultanées pour préparer l’ARNm à la traduction, telles que le capsulage 5', l’addition de poly-A et l’épissage. Outre l’épissage constitutif, l’épissage alternatif de l’ARNm permet l’expression de protéines multifonctionnelles à partir d’un gène. Comme les études d’interactome sont généralement la première analyse pour des protéines nouvelles ou inconnues, l’association de la protéine appât avec des facteurs d’épissage est une indication qu’elle peut participer au processus d’épissage de l’ARNm, mais déterminer dans quel contexte ou quels gènes sont régulés est un processus empirique. Un bon point de départ pour évaluer cette fonction est l’utilisation de l’outil minigène classique. Ici nous présentons l’utilisation adenoviral de minigene d’E1A pour évaluer les changements alternatifs d’épissage après différents stimulus cellulaires d’effort. Nous avons évalué l’épissage du minigène E1A dans HEK293 surexprimant de manière stable la protéine Nek4 après différents traitements de stress. Le protocole comprend la transfection de minigène e1A, le traitement cellulaire, l’extraction d’ARN et la synthèse d’ADNc, suivis de l’analyse de PCR et de gel et de la quantification des variantes épissées d’E1A. L’utilisation de cette méthode simple et bien établie combinée à des traitements spécifiques est un point de départ fiable pour faire la lumière sur les processus cellulaires ou sur les gènes qui peuvent être régulés par l’épissage de l’ARNm.

Un 5' l’analyse d’emplacements d’épissure utilisant le minigene d’E1A a été exécutée pour évaluer des changements de l’épissage du profil en cellules après exposition de chimiothérapie. Le rôle de Nek4 - isoform 1 dans la régulation AS dans les cellules stables HEK293 après que le traitement de paclitaxel ou de cisplatin ait été évalué.
La région adénovirale E1A est responsable de la production de trois ARNm principaux à partir ...

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

L’objectif global de ce protocole est de fournir des conseils détaillés pour utiliser le minigène E1A2 pour évaluer les changements globaux d’épissage de l’ARNm. Il s’agit d’un outil rapide, peu coûteux et simple pour évaluer la fonction de la protéine cible dans la régulation alternative de l’épissage sans avoir besoin de régimes spéciaux ou de conditions de laboratoire. Commencez par la culture de cellules HEK 293 avec une expression stable du gène d’intérêt.Divisez les cellules à l’aide de 0,25% de trypsine EDTA, puis plaquez 300 000 cellules par puits dans des plaques de six puits et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, vérifiez la confluence et transfectez les cellules stables HEK 293 uniquement lorsque 70 à 80% confluent. Retirez soigneusement le milieu de culture cellulaire avec une pipette, puis ajoutez deux millilitres de milieu DMEM complet sans antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur.Préparez un tube avec le tampon de transfection, puis ajoutez deux microgrammes d’ADN pMTE1A, de vortex et ajoutez deux microlitres de réactif de transfection. Vortex à nouveau et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez soigneusement le mélange de transfection goutte à goutte.Six heures après la transfection, ajouter de la tétracycline aux cellules stables HEK 293 pour l’induction de l’expression Nek4. 24 heures après la transfection, vérifier la morphologie cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope fluorescent. Utilisez une pipette pour enlever le milieu de culture cellulaire, puis ajoutez le milieu de culture cellulaire avec les produits chimiothérapeutiques.Incuber les cellules pendant encore 24 heures. Pour recueillir l’ARN, jetez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 0,5 à 1 millilitre de réactif d’extraction de l’ARN directement au puits. Si les puits sont très confluents, utilisez un millilitre de réactif d’extraction d’ARN pour améliorer la qualité de l’ARN.Homogénéiser les cellules avec une pipette et les transférer dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre. Passez immédiatement à l’extraction de l’ARN ou stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les échantillons dans une hotte et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter 0,1 à 0,2 millilitres de chloroforme et agiter vigoureusement, puis incuber pendant trois minutes à température ambiante. Centrifuger pendant 15 minutes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius, puis recueillir la phase aqueuse supérieure et la transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Recueillir environ 60% du volume total, mais ne pas recueillir l’ADN ou la phase organique.Ajouter 0,25 à 0,5 millilitres d’isopropanol et agiter l’échantillon par inversion quatre fois. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Lavez la pastille d’ARN deux fois avec de l’éthanol et centrifugez à 7 500 fois G pendant cinq minutes, puis jetez l’éthanol.Retirez l’excès d’éthanol en inversant le tube sur une serviette en papier, puis laissez le tube ouvert à l’intérieur d’une hotte pour sécher partiellement le culot pendant cinq à 10 minutes. Re-suspendre la pastille d’ARN dans 15 microlitres d’eau traitée par DEPC. Quantifier l’ARN total et vérifier la qualité de l’ARN en mesurant l’absorbance à 230, 260 et 280 nanomètres.Pour vérifier la qualité totale de l’ARN, faire fonctionner un gel d’agarose à 1% prétraité avec 1,2% d’une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5% pendant 30 minutes. Effectuer la synthèse de l’ADNc en utilisant un à deux microgrammes d’ARN total. Combiner l’ARN, une microlitres d’oligo d-T, une microlitres de DNTP et de l’eau sans nucléase en 12 microlitres.Incuber la réaction dans le Thermo Cycler pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius. Prélever des échantillons du Thermo Cycler et ajouter quatre microlitres de tampon de transcriptase inverse, deux microlitres de TNT et un microlitres d’inhibiteur de la ribonucléase. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.Ajouter une microlitres de transcriptase inverse thermo-stable et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Inactiver l’enzyme à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Effectuez la PCR comme décrit dans le manuscrit de texte, puis chargez 20 à 25 microlitres du produit PCR sur un gel d’agarose à 3% contenant une coloration d’acide nucléique, et exécutez à 100 volts pendant environ une heure.Photographiez le gel, en évitant toute saturation de bande, et quantifiez les bandes à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Les bandes à 631, 493, et 156 paires de bases correspondent aux isoformes 13S, 12S, et 9S respectivement. Dans le menu Fichier du logiciel, ouvrez le fichier image et convertissez-le en échelle de gris.Réglez la luminosité et le contraste, puis supprimez le bruit aberrant si nécessaire. Dessinez un rectangle autour de la première voie à l’aide de l’outil de sélection de rectangle et sélectionnez-le à l’aide de la commande Analyser, Gels et Sélectionner la première voie ou à l’aide du raccourci clavier. Utilisez la souris pour cliquer et maintenir au milieu du rectangle sur la première voie, puis faites-la glisser vers la voie suivante.Accédez à Analyser, Gels et Sélectionnez Next Lane. Répétez cette étape pour toutes les voies restantes. Une fois que toutes les voies sont mises en évidence et numérotées, accédez à Analyser, Gels et Tracer les voies pour dessiner un diagramme de profil de chaque voie.Utilisez l’outil de sélection de ligne droite pour tracer une ligne à travers la base de chaque pic, correspondant à chaque bande, en omettant le bruit de fond. Une fois que tous les pics de chaque voie ont été fermés, sélectionnez l’outil baguette et cliquez à l’intérieur de chaque pic. Les mesures doivent apparaître dans la fenêtre de résultats pour chaque pic mis en surbrillance.Considérez uniquement les pics 13S, 12S et 9S correspondant aux bandes de paires de bases 631, 493 et 156. Copiez les données d’intensité pour un éditeur de feuille de calcul et additionnez l’intensité des trois canaux pour chaque échantillon, puis calculez le pourcentage pour chaque isoforme par rapport au total. Tracer les pourcentages de chaque isoforme ou les différences dans le pourcentage par rapport aux échantillons non traités.Un plasmide contenant le minigène d’E1A a été utilisé pour observer l’effet sur l’épissage alternatif en évaluant la proportion d’ARNm de chaque isoforme produite. L’expression basique des variantes d’isoforms d’E1A a dépendu de la variété de cellule et du temps de l’expression d’E1A. La variété de cellule stable HEK 293, ou la recombinase HEK 293 contenant l’emplacement, a montré une expression plus élevée de 13S par rapport aux cellules de HeLa, mais a montré les niveaux semblables des isoforms 13S et 12S après 48 heures d’expression d’E1A.Les cellules exposées au cisplatin ont montré un décalage de cinq sélection de épissure S-S de premier choix favorisant l’expression 12S. Cet effet a été observé dans HEK 293 exprimant de manière stable le vecteur vide Flag, ainsi que l’isoforme de Nek4. Les changements dans l’épissage alternatif après traitement de paclitaxel étaient très discrets, mais les directions des changements étaient opposées dans les cellules exprimant Flag et Nek4.Lors de l’exécution de ce protocole, il est important d’utiliser des contrôles de transcriptase non traduits et non inversés pour éviter une mauvaise interprétation avec l’expression endogène d’E1A, principalement lors de l’utilisation de cellules HEK 293. Après avoir obtenu des résultats positifs, l’épissage alternatif de gènes spécifiques liés à la réponse chimiothérapeutique peut être évalué. Lorsqu’un effet est observé, ce protocole simple peut orienter ces études vers des voies plus cohérentes, où la protéine joue un rôle régulant l’épissage alternatif dans la réponse chimiothérapeutique, par exemple.

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