Name: Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement lépissage alternatif dans les cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Découvrez comment concevoir des facteurs d'épissage artificiels pour moduler l'épissage alternatif dans les cellules humaines. Cette méthode flexible permet d'étudier la régulation de l'ARN dans les cellules cancéreuses.

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Ce travail a été soutenu par subvention du NIH R01-CA158283 et NSFC accorde à 31.400.726 ZWYW est financé par le programme Jeunes Talents Mille et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31471235 et 81422038). XY est financé par la fondation scientifique post-doctorale de la Chine (2015M571612).

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce rapport fournit une description détaillée de la conception et la construction de facteurs d&#39;épissage artificiels qui peuvent manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif d&#39;un gène cible. Ce procédé met à profit le mode de liaison unique de l&#39;ARN de PUF répète pour produire un échafaudage de liaison à l&#39;ARN avec une spécificité personnalisée. Il peut être utilisé pour activer ou réprimer épissage. L&#39;étape critique dans ce protocole est la génération du domaine rep...

La plupart des gènes humains subissent Alternative Splicing (AS) pour produire des isoformes multiples avec des activités distinctes, ce qui a considérablement augmenté la complexité du codage du génome 1, 2. AS fournit un mécanisme important pour réguler la fonction des gènes, et il est étroitement régulée par des voies différentes à différents stades cellulaires et de développement 3, 4. Parce que l&#39; épissage misregulation est une cause fréquente de la maladie humaine 5, 6, 7, 8, ciblage régulation de l&#39; épissage devient une voie thérapeutique intéressante. Selon un modèle simplifié de la régulation de l&#39; épissage, comme cela est principalement contrôlée par épissage cis Regulatory -elements (SRE) dans le pré-ARNm qui fonctionnent comme activateurs d&#39;épissage d&#39;exons ou des silencieux de remplacement. thSRE ese recruter spécifiquement divers facteurs protéiques trans -acting ( à savoir les facteurs d&#39;épissage) qui favorisent ou inhibent la réaction d&#39;épissage 3, 9. La plupart des facteurs d&#39;épissage trans -acting ont des domaines de liaison d&#39;ARN spécifiques de séquence distincts pour reconnaître leurs cibles et domaines effecteurs pour contrôler l&#39; épissage. Les exemples sont les membres de la sérine / riche en arginine (SR) de la famille de protéines qui contiennent de l&#39; ARN N-terminaux de reconnaissance motifs (RRMS), qui se lient activateurs d&#39;épissage d&#39; exons, et des domaines RS C-terminaux, qui favorisent l&#39; inclusion de l&#39; exon 10 les plus connus . A l&#39; inverse, hnRNP A1 se lie à des silencieux d&#39;épissage d&#39; exons dans les domaines RRM et inhibe l&#39; inclusion de l&#39; exon à travers un domaine riche en glycine C-terminal 11. L&#39;utilisation de ces configurations modulaires, les chercheurs devraient être en mesure de concevoir des facteurs d&#39;épissage artificiels en combinant un domaine ARN liaison spécifique (RBD) avec différents effecdomaines tor qui activent ou inhibent l&#39;épissage. La clé d&#39;une telle conception consiste à utiliser un RBD qui reconnaît les cibles donné avec une spécificité de liaison d&#39;ARN programmable, qui est analogue au mode de liaison à l&#39;ADN du domaine CONTE. Cependant, la plupart des domaines contiennent des facteurs d&#39;épissage RRM ou K Homologie (KH) natifs, qui reconnaissent des éléments d&#39;ARN courts avec une faible affinité , et donc un manque de reconnaissance prédictive d&#39;ARN-protéine « code » 12. Le RBD des protéines de répétition MPU ( à savoir le domaine PUF) dispose d&#39; un mode de reconnaissance de l&#39; ARN unique, permettant pour la refonte des domaines PUF de reconnaître spécifiquement l&#39; ARN cibles différentes 13, 14. Le domaine PUF canonique contient huit répétitions de trois hélices a, en reconnaissant chacun une base unique dans une cible d&#39;ARN de 8 nt. Les chaînes latérales des acides aminés à certaines positions des secondes liaisons hydrogène spécifiques forment α-hélice avec le bord de Watson-Crick de tLa base d&#39;ARN, qui détermine la spécificité de liaison de l&#39;ARN de chaque répétition ( figure 1A ). Le code pour la reconnaissance par ARN de la répétition PUF est étonnamment simple ( Figure 1A ), permettant la génération de domaines PUF qui reconnaissent toute combinaison possible de 8 bases (examinée par Wei et Wang 15 ). Ce principe de conception modulaire permet la génération d&#39;un Factor d&#39;épissage Engineered (ESF) qui consiste en un domaine PUF personnalisé et un domaine de modulation d&#39;épissage ( c&#39;est-à-dire un domaine SR ou un domaine riche en Gly). Ces ESF peuvent fonctionner comme activateurs d&#39;épissage ou comme inhibiteurs pour contrôler différents types d&#39;événements d&#39;épissage, et ils se sont révélés utiles comme outils pour manipuler l&#39;épissage des gènes endogènes liés à la maladie humaine 16,17 . Par exemple, nous avons construit des ESF de type PUF-Gly pour modifier spécifiquement l&#39;épissage du gène Bcl-x, La conversion de l&#39;isoforme longue anti-apoptotique (Bcl-xL) en isoforme courante pro-apoptotique (Bcl-xS). Le changement du rapport de l&#39;isoforme Bcl-x était suffisant pour sensibiliser plusieurs cellules cancéreuses à de multiples médicaments contre la chimiothérapie anticancéreux 16 , ce qui suggère que ces facteurs artificiels peuvent être utiles en tant que réactifs thérapeutiques potentiels. En plus de contrôler l&#39;épissage avec des domaines effecteurs d&#39;épissage connus ( par exemple, un domaine RS ou Gly), les facteurs PUF modifiés peuvent également être utilisés pour examiner les activités de nouveaux facteurs d&#39;épissage. Par exemple, en utilisant cette approche, nous avons démontré que le domaine C-terminal de plusieurs protéines SR peut activer ou inhiber l&#39;épissage lors de la liaison à différentes régions pré-ARNm 18 , que le motif riche en alanine de RBM4 peut inhiber l&#39;épissage 19 et Le motif riche en proline de DAZAP1 peut améliorer l&#39;épissage 20 , 21 &lt;/ Sup&gt;. Ces nouveaux domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour construire des types supplémentaires de facteurs artificiels pour affiner l&#39;épissage.

<table><tbody><tr><td>ADN polymérase haute fidélité (Phusion High-Fidelity) avec tampon PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>ADN ligase (T4 DNA ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection liposomale (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>ARN tampon d’extraction (réactif TRIzol)</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>réactif TRIzol contient du phénol, qui peut provoquer des brûlures. Porter des gants lors de la manipulation</td></tr><tr><td>de PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptase inverse (RT)</td><td>Anticorps Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps PARP</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Bcl-x</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps bêta-actine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps alpha-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blot réactifs de détection</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules activé par fluorescence (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtrer-stériliser et stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Vecteur pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (sans RNase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris (IgG anti-souris, anticorps liés à la HRP)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif dans les cellules humaines

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Le traitement de la plupart des ARN eucaryotes est médié par des protéines de liaison à l&#39;ARN (RBP) avec des configurations modulaires, y compris un module de reconnaissance d&#39;ARN, qui lie spécifiquement la cible pré-ARNm et un domaine effecteur. Auparavant, nous avons profité du mode unique de liaison de l&#39;ARN du domaine PUF dans le Pumilio humain 1 pour générer un échafaudage de liaison d&#39;ARN programmable, qui a été utilisé pour concevoir divers RBP artificiels pour manipuler le métabolisme de l&#39;ARN. Ici, un protocole détaillé est décrit pour construire Engineered Splicing Factors (ESF) qui sont spécifiquement conçus pour moduler l&#39;épissage alternatif des gènes cibles. Le protocole comprend la façon de concevoir et de construire un échafaudage PUF personnalisé pour une cible d&#39;ARN spécifique, comment construire un plasmide d&#39;expression ESF en fusionnant un domaine PUF concepteur et un domaine effecteur, et comment utiliser les ESF pour manipuler l&#39;épissage des gènes cibles. Dans les résultats représentatifs de cette méthode, nous avons également décrit les tests communsDes activités du FSE en utilisant les journalistes d&#39;épissage, l&#39;application du FSE dans les cellules humaines cultivées et l&#39;effet subséquent des changements d&#39;épissage. En suivant les protocoles détaillés dans ce rapport, il est possible de concevoir et de générer des ESF pour la régulation de différents types d&#39;épissage alternatif (AS), en fournissant une nouvelle stratégie pour étudier la régulation de l&#39;épissage et la fonction des différentes isoformes d&#39;épissage. De plus, en fusionnant différents domaines fonctionnels avec un domaine PUF conçu, les chercheurs peuvent concevoir des facteurs artificiels qui ciblent des ARN spécifiques pour manipuler diverses étapes du traitement de l&#39;ARN.

Ce rapport décrit le protocole complet pour la conception et la construction de journalistes et de sociétés d'ingénierie épissage. Il présente également la nouvelle application de SESF manipuler l'AS de gènes endogènes 16. Pour illustrer les résultats typiques des changements d'épissage FSE médiation, nous utilisons les données de nos travaux antérieurs à titre d'exemple. SESF avec différents domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour favoriser ou inhiber l'...

Ce rapport décrit une méthode de bio-ingénierie pour concevoir et construire de nouveaux Facteurs d&#39;épissage artificiel (ASF) qui modulent spécifiquement l&#39;épissage des gènes cibles dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut être élargie pour englober divers facteurs artificiels pour manipuler d&#39;autres aspects du métabolisme de l&#39;ARN.

Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif dans les cellules humaines

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

L’objectif global de ce protocole est de concevoir des facteurs d’épissage artificiels qui peuvent spécifiquement manipuler l’épissage alternatif d’une cible donnée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du traitement de l’ARN, telles que la régulation et la mauvaise régulation de l’épissage alternatif dans les cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est sa flexibilité.Nous pouvons concevoir des facteurs artificiels qui favorisent ou inhibent différents types d’épissage alternatif dans des gènes donnés. La démonstration de cette procédure sera assurée par Huan-Huan, un associé de recherche de mon laboratoire, et Qianyun, un post-doctorant de mon laboratoire. L’ADN PUF de type sauvage est utilisé comme modèle pour générer l’échafaudage personnalisé du domaine PUF.Utilisez des amorces PCR contenant des séquences PUF qui reconnaissent spécifiquement différents nucléotides d’ARN dans chaque position. Pour chaque répétition de PUF, utilisez quatre amorces différentes pour reconnaître une base différente à chaque position. Dans le premier tour de la PCR, utilisez les paires d’amorces montrées pour générer des séquences codantes po

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Il a été démontré que la régulation de l’épissage alternatif  contribue à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant un modèle EMT inductible pour la détection d’épissages alternatifs pendant l’EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques des modèles parentaux et résistants in vitro par l' ARN-seq et établi une méthode basée qRT-PCR pour valider les gènes candidats.

En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.

Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

L’épissage alternatif (AS) et la polyadénylation alternative (APA) élargissent la diversité des isoformes de transcrits et de leurs produits. Ici, nous décrivons des protocoles bioinformatiques pour analyser les tests de séquençage d’ARN en vrac et de séquençage à 3' pour détecter et visualiser l’AS et l’APA variant selon les conditions expérimentales.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

Ce protocole décrit un test rapporteur minigène pour surveiller l’impact des mutations du site de l’épissure 5'sur l’épissage et développe un suppresseur U1 snRNA pour le sauvetage de l’inhibition de l’épissage induite par mutation. Les constructions de l’ARNN U1 rapporteur et suppresseur sont exprimées dans les cellules HeLa, et l’épissage est analysé par extension d’amorce ou RT-PCR.

Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage

De nouvelles stratégies pour modéliser fidèlement les mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) sont nécessaires pour mieux étudier la biologie des cellules souches hématopoïétiques et les hémopathies malignes. Ici, un protocole pour modéliser les mutations hétérozygotes de gain de fonction dans les HSPC en combinant l’utilisation de CRISPR / Cas9 et la double transduction du donneur rAAV est décrit.

Ingénierie des mutations hétérozygotes oncogéniques de gain de fonction dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines

Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l'identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules humaines pour analyser les facteurs d’initiation de la traduction qui se lient à la coiffe 5' de l’ARNm dans des conditions physiologiques d’oxygène. Cette méthode utilise un analogue du chapeau m7GTP lié à l’agarose et convient pour étudier les facteurs de liaison au chapeau et leurs partenaires en interaction.

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Découvrez comment concevoir des facteurs d'épissage artificiels pour moduler l'épissage alternatif dans les cellules humaines. Cette méthode flexible permet d'étudier la régulation de l'ARN dans les cellules cancéreuses.

Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l'épissage alternatif dans les cellules humaines

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