Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l'épissage alternatif dans les cellules humaines

L’objectif global de ce protocole est de concevoir des facteurs d’épissage artificiels qui peuvent spécifiquement manipuler l’épissage alternatif d’une cible donnée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du traitement de l’ARN, telles que la régulation et la mauvaise régulation de l’épissage alternatif dans les cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est sa flexibilité.

Nous pouvons concevoir des facteurs artificiels qui favorisent ou inhibent différents types d’épissage alternatif dans des gènes donnés. La démonstration de cette procédure sera assurée par Huan-Huan, un associé de recherche de mon laboratoire, et Qianyun, un post-doctorant de mon laboratoire. L’ADN PUF de type sauvage est utilisé comme modèle pour générer l’échafaudage personnalisé du domaine PUF.

Utilisez des amorces PCR contenant des séquences PUF qui reconnaissent spécifiquement différents nucléotides d’ARN dans chaque position. Pour chaque répétition de PUF, utilisez quatre amorces différentes pour reconnaître une base différente à chaque position. Dans le premier tour de la PCR, utilisez les paires d’amorces montrées pour générer des séquences codantes pour quatre répétitions PUF, des fragments de pont universels et des fragments de capuchon.

Dans la deuxième série, utilisez les produits de PCR générés à la dernière étape comme matrices avec les combinaisons d’amorces montrées pour générer des séquences codantes pour les codes de reconnaissance d’ARN R-un à R-quatre, et R-cinq à R-huit. Au troisième tour, utilisez les produits du deuxième tour et des ponts quatre à cinq comme modèles avec l’amorce directe R-one et l’amorce inverse R-huit pour générer des séquences de codage pour R-un à R-huit sans majuscules. Dans la PCR du quatrième tour, utilisez R-un à R-huit, cinq premiers embouts et trois premiers embouts comme modèles, afin de générer des séquences de codage pour des domaines PUF complets.

Pour commencer la transfection des cellules HEK-293T, mélangez le réactif de transfection liposomale en inversant doucement les flacons. Diluez ensuite deux microlitres de réactif de transfection liposomale dans 50 microlitres de milieu sérique réduit par transfection. Mélangez doucement, puis laissez incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, diluez 04 microgrammes de vecteur d’expression de domaine riche en glycine et 0,2 microgramme du plasmide rapporteur d’épissage modulaire dans 50 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube stérile. Diluez ensuite 0,4 microgramme de vecteur d’expression du domaine effecteur RS et 0,2 microgramme de plasmide rapporteur PGZ-3 dans 50 microlitres de milieu sérique réduit. Enfin, diluez 0,4 microgramme de vecteur d’expression PGL-RS-PUF et 0,2 microgramme de plasmides rapporteurs PEZ-1B ou PEZ-2F dans 50 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube stérile.

Après cinq minutes d’incubation à température ambiante, mélanger délicatement le réactif de transfection liposomale dilué avec les mélanges de plasmides dilués. Incuber les mélanges finaux pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite les mélanges de transfection contenant les vecteurs d’expression dans chaque puits d’une plaque de 24 puits ensemencée de cellules HEK-293, et incubez pendant au moins 12 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 12 heures d’incubation, récoltez les cellules transfectées par trypsinisation et centrifugation. Après la centrifugation, jeter le milieu et ajouter 0,5 millilitre de tampon d’extraction d’ARN par tube. Ajouter 0,1 millilitre de chloroforme pour 0,5 millilitre de tampon d’extraction d’ARN à chaque échantillon.

Après l’incubation, centrifugez les tubes pendant 15 minutes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez ensuite la base aqueuse dans un tube frais. Ajouter 0,25 millilitre d’isopropanol par 0,5 millilitre de tampon d’extraction d’ARN utilisé lors de l’homogénéisation initiale.

Mélanger par vortex et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après une centrifugation comme précédemment, le précipité d’ARN est généralement visible au fond du tube. Jetez le surnageant et lavez la pastille d’ARN avec 0,5 millilitre d’éthanol à 75 % pour 0,5 millilitre de tampon d’extraction d’ARN.

Vortex vigoureusement, puis centrifuger à 7, 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, retirez le surnageant et faites sécher les pastilles d’ARN à l’air. Dissoudre les ARN dans 50 microlitres d’eau sans RNase.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de cinq unités par microlitre de DNase-un, sept microlitres de tampon 10X et 11 microlitres d’eau à chaque solution d’ARN de 50 microlitres. Après l’incubation, chauffez les solutions à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes pour inactiver la DNase. Après avoir effectué une réaction de transcriptase inverse pour synthétiser l’ADNc de chaque échantillon, ajoutez les composants de la réaction PCR du corps dans l’ordre indiqué à l’écran sur les tubes PCR.

Préparez une réaction par échantillon. Exécutez le programme RT-PCR sur le thermocycleur. Enfin, résoudre les produits PCR par électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide à 10 % avec tampon TBE.

Utilisez un scanner à fluorescence pour visualiser les produits et mesurez la quantité de chaque isoforme épissée à l’aide d’un logiciel de densitométrie. Pour le test d’immunofluorescence afin de mesurer l’apoptose, préparez un mélange de transfection contenant des plasmides d’expression de domaine riches en glycine, comme indiqué précédemment, et transfectez les cellules HeLa cultivées sur des lamelles de verre recouvertes de polylysine dans une plaque à six puits. 24 heures après la transfection, fixez les cellules sur les lamelles avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS pendant 20 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez doucement les cellules sur les lamelles avec deux millilitres de 1x PBS pendant cinq minutes. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 10 minutes. Après avoir lavé trois fois avec 1x PBS comme précédemment, bloquez la liaison non spécifique avec 3 % d’albumine sérique bovine dans 1x PBS pendant 10 minutes.

Diluer l’anticorps du drapeau un à 1 000 dans 3 % BSA dans du PBS et pipeter 30 microlitres de l’anticorps dilué sur une feuille de parafilm. Utilisez une pince pour retirer une lamelle. Séchez soigneusement l’excès de tampon avec des lingettes de laboratoire, puis placez la lamelle côté cellulaire vers le bas sur la solution anti-drapeau.

Incuber pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez environ 500 microlitres de 1x PBS sur le côté cellulaire de la lamelle jusqu’à ce qu’elle flotte sur la solution. Remettez-le dans la plaque à six puits avec 1x PBS dans les puits.

Incuber avec l’anticorps secondaire sur le parafilm comme précédemment pendant 15 minutes. Laver comme précédemment, puis monter les lamelles sur les lames de microscope à l’aide d’un support de montage contenant du DAPI. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence et photographiez-les à l’aide d’un appareil photo numérique.

À l’aide de la microscopie d’immunofluorescence, de nombreuses cellules exprimant Gly-PUF-531 avaient de l’ADN nucléaire fragmenté, indiquant qu’elles subissaient une apoptose. En tant que témoin, les cellules exprimant le type sauvage Gly-PUF avaient moins d’ADN nucléaire fragmenté que les cellules transfectées Gly-PUF-531. Ici, la microscopie d’immunofluorescence utilisant l’anticorps anti-drapeau fusionné avec des cellules colorées au DAPI montre que le Gly-PUF-531 localisé principalement dans les noyaux des cellules transfectées.

Gly-PUF de type sauvage également localisé dans les noyaux des cellules transfectées, suggérant que ces ESF se dissocient de leurs cibles lorsque les ARNm entièrement épissés sont transportés dans le cytoplasme. Le pourcentage de cellules apoptotiques avec de l’ADN nucléaire fragmenté a été mesuré à partir de champs choisis au hasard d’images de microscopie à fluorescence. Une fois maîtrisée, la construction d’échafaudages PUF avec une spécificité de liaison à l’ARN peut se faire en deux jours si elle est réalisée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler spécifiquement l’épissage alternatif dans les cellules humaines en modifiant des facteurs artificiels.