Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier les composantes transcriptionnelles de la réponse photopériodique à la diapause. Dans un pictus de coude des années 80 non modèle, cela est réalisé en produisant d’abord des échantillons biologiquement répliqués d’œufs de diapause et de non-diapause via différents traitements photopériodiques. Dans un deuxième temps, l’ARN est extrait de chaque réplication pour un séquençage de l’ARN à haut débit.

Les séquences d’ARN sont ensuite traitées par calcul pour les assembler en congs et les annoter. En fin de compte, des variations dans l’expression des gènes en réponse à des photopériodes induisant une diapause par rapport à des photopériodes non induisant une diapause peuvent être déduites de la MAP de Reeds à l’assemblage de l’ARN. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’analyse micrologique, est qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser des ressources génétiques préalables, telles que la séquence du génome ou une puce à ADN, pour obtenir des estimations globales de l’expression génique en réponse à des conditions de diapause.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique écologique, telles que la base transcriptionnelle des DPO ou d’autres adaptations écologiques clés chez des organismes non modèles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il peut être difficile d’obtenir des quantités suffisantes d’ovules de diapause et de non-DPO et l’analyse bioinformatique en aval peut être difficile. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que les technologies de séquençage de l’ADN à haut débit devenaient plus abordables et offraient une méthode débauchable pour obtenir des profils d’expression du génome entier dans des organismes non modèles avant de commencer la procédure.

Réglez deux armoires photopériodiques avec un éclairage programmable à 21 degrés Celsius pour une expression optimale de la diapause et une humidité relative d’environ 80 % Programmez une armoire pour une photopériode non induisant une diapause avec un cycle d’obscurité de 16 à huit lumières et l’autre pour un cycle d’obscurité de huit à huit lumières induisant une diapause avec les lumières allumées en même temps pour que les deux armoires synchronisent le temps circadien entre les périodes de photo. Ensuite, immergez les feuilles d’œufs pour le nombre approprié d’œufs dans 500 millilitres d’eau déminéralisée et ajoutez un millilitre de nourriture pour chiens hachée et de bouillie de nourriture pour crevettes de saumure. Couvrez le récipient avec un grillage, en plaçant un élastique autour du filet pour le maintenir en place.

Ensuite, incubez les œufs dans l’armoire photo d’époque 16 huit lumières, obscurité et longue journée pendant environ 24 heures. Le lendemain, transférez environ 30 larves écloses par groupe dans des boîtes de Pétri individuelles de 10 x 10 x 2 centimètres remplies de 90 millilitres d’eau désionisée. Toutes les 48 à 72 heures, transférez les larves dans une parabole propre, en les nourrissant avec de la bouillie de nourriture fraîche à chaque transfert.

Après environ six jours, tapissez le fond de trois à quatre cages d’adultes pour chaque traitement photopériodique avec du papier filtre humide et humidifiez le papier filtre avec suffisamment d’eau désionisée pour augmenter l’humidité locale dans la cage tout en évitant l’eau stagnante. Notez la photopériode, le numéro de la réplique, la date de début de la cage et d’autres informations pertinentes pour l’expérience avec un marqueur permanent sur le côté de la cage. Ensuite, tous les deux jours pendant 10 jours, transférez le puy dans de petites tasses d’eau propre à pas plus de 50 puy pour 25 millilitres d’eau dans les cages pour adultes appropriées pour l’expérience et placez des raisins secs biologiques sur le maillage supérieur de la cage pour fournir du sucre aux adultes émergés Pour stimuler la position des ovules quatre à cinq jours après le premier repas de sang, Remplissez des gobelets de 50 millilitres de couleur foncée tapissés d’un essuie-tout texturé non blanchi à moitié avec de l’eau désionisée et placez un gobelet dans chaque cage pour recueillir et stocker les œufs.

Remplacez les papiers d’œufs dans chaque cage par du papier frais, en plaçant les papiers récemment retirés dans des boîtes de Pétri et en les rangeant dans l’armoire photo de huit 16 jours clairs, sombres et courts pour éviter les effets de confusion sur le stockage des œufs. Environ 48 heures après la collecte, faites sécher les papiers d’œufs à l’air libre de manière à ce qu’ils soient mous et légèrement humides au toucher, mais pas trop mouillés pour qu’ils soient foncés par l’eau ou stimulent l’éclosion. Pour mesurer les incidents de diapause, notez le nombre d’œufs sur chaque papier d’œuf.

Ensuite, immergez complètement les papiers individuels dans une boîte de Pétri de 90 millilitres avec environ 80 millilitres d’eau déminéralisée. Pour stimuler leur éclosion, ajoutez environ 0,25 millilitre de bouillie alimentaire, puis après 24 heures, transférez la boîte de Pétri sur une surface noire. Placez maintenant une source de lumière sur un côté de la, les larves s’éloigneront de la lumière, ce qui permettra un décompte clair de l’individu en premier dans les larves d’étoiles.

À l’aide d’une pipette, prélevez chaque larve après le comptage afin d’éviter de recompter les individus. Placez ensuite les feuilles d’œuf dans une nouvelle boîte de Pétri pour qu’elles sèchent au rouge. Après avoir compté un deuxième lot de nouveau-nés une semaine plus tard, placez les feuilles d’œufs avec les œufs non éclos restants dans de nouvelles boîtes de Pétri de 90 millilitres avec environ 80 millilitres de solution de blanchiment fraîche en veillant à ce que les feuilles soient complètement immergées dans la solution de blanchiment.

Laissez les papiers sous une hotte pendant la nuit, puis le lendemain, utilisez un microscope optique pour compter le nombre d’œufs non éclos. Si un œuf est embryonné, il présentera une couleur blanc cassé avec les yeux apparaissant comme deux petits points noirs opposés l’un à l’autre sur la face dorsale. Pour commencer, nettoyez soigneusement le banc avec une solution de décontamination de l’ARN afin d’éliminer les nucléases résiduelles et d’éviter la dégradation de l’ARN.

Ensuite, utilisez une brosse en poil de chameau pour brosser au moins 400 œufs de moustiques contenant des embryons en développement au moment du développement. Point d’intérêt dans les broyeurs de verre. Dans une hotte, ajoutez un millilitre de triol et broyez les œufs jusqu’à ce qu’ils soient complètement pulvérisés, puis effectuez l’extraction de l’ARN en triol, suivie d’une précipitation à l’isopropanol selon les instructions du fabricant.

Utilisez maintenant jusqu’à un microlitre de D ns pour un maximum de 10 microgrammes d’ARN dans 50 microlitres de réaction pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius selon les instructions du fabricant. Ensuite, incubez la réaction dans cinq microlitres de réactif d’inactivation de l’ADN en suspension pendant cinq minutes à température ambiante. Tourbillonnant doucement la suspension trois fois pendant la période d’incubation.

Ensuite, centrifugez les extraits d’ARN pendant 1,5 minute à 10 000 fois G et Eloqua, l’ARN contenant des surnageants, dans des tubes frais pour le séquençage. Enfin, consultez le texte d’accompagnement pour plus de détails sur la façon de traiter les données de séquençage de nouvelle génération résultantes, de la lecture, de la préparation, de l’assemblage et de l’annotation à l’analyse d’expression différentielle. Dans cette première figure, la fluorométrie de deux échantillons d’ARN représentatifs montre deux bandes à environ 2000 nucléotides.

L’ARN ribosomique de l’insecte 28 s est composé de deux chaînes polynucléotidiques maintenues ensemble par des liaisons hydrogène qui sont facilement perturbées par un bref chauffage ou des agents qui brisent les liaisons hydrogène. Les deux composants résultants ont à peu près la même taille qu’un ARN ribosomique de 18 s dans le deuxième échantillon d’ARN ; des niveaux élevés de dégradation peuvent être observés dans cette expérience représentative. Le traitement photopériodique d’un groupe représentatif de moustiques albopictus a entraîné une diapause élevée chez les moustiques élevés de jour court et une faible diapause chez les moustiques élevés de jour long.

Bien qu’il y ait eu une certaine variation entre les répétitions, par exemple, le groupe du deuxième jour court a présenté un nombre plus faible d’incidents de diapause que les autres répétitions. Un assemblage Trinity de lectures normalisées numériquement a donné 76 377 contigs avec une longueur moyenne de conig de 1020 3,1 et une longueur maximale de Conti de 20 892. Notez que la distribution des longueurs des Conti est fortement biaisée en faveur des contigs plus courts.

Ceci est typique de l’assemblage du transcriptome Denovo. Dans ce dernier graphique, les analyses d’expression différentielle d’un flux de travail similaire d’embryons élevés dans des conditions induisant la diapause à 11 et 21 jours après la position des ovules révèlent 3 128 gènes exprimés différemment entre ces deux périodes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en six à huit mois à partir de la génération de tissus par analyse informatique divine si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le succès de chaque étape doit être vérifié avant de passer à l’étape suivante. Par exemple, confirmez que les conditions expérimentales ont produit des APD et des œufs non diapause avant de tester l’intégrité de l’ARN après cette procédure. D’autres méthodes, telles que l’analyse quantitative R-T-P-C-R ou l’analyse génomique comparative, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant l’expression tissulaire ou développementale, l’expression spécifique des gènes d’intérêt et/ou les processus d’évolution moléculaire.

N’oubliez pas que travailler avec du triol peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de gants, d’une blouse de laboratoire et d’une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.