Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti
10 septembre 2021
Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.
Ce protocole est un moyen très simple et efficace de détecter les mutants générés par la technologie CRISPR/Cas9 de nombreux individus. Les deux principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut se faire en quelques heures et qu’elle est applicable à une multitude d’organismes. La conception de l’amorce peut être difficile pour certains gènes et plusieurs cycles de conception et de vérification de l’amorce peuvent être nécessaires pour rendre HRMA efficace.
Pour effectuer une PCR de dégradé, commencez par préparer un mélange maître. Retirez ensuite 19 microlitres du mélange principal pour le contrôle sans gabarit ou NTC dans une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez le modèle au mélange principal restant.
Aliquote 20 microlitres du mélange d’échantillon dans la plaque de 96 puits. Effectuez la PCR en suivant les paramètres de cycle, puis générez les profils de fusion thermique en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit. Après avoir rassemblé tout le matériel requis, préparez un mélange maître avec 0,5 microlitre du réactif de libération d’ADN et 20 microlitres de tampon de dilution par individu à génotyper.
À l’aide d’une pipette multicanal, aliquotez 20 microlitres du mélange dans une plaque pcR et laissez la plaque PCR sur la glace. Ensuite, placez les moustiques G1 anesthésiés dans une boîte de Petri en verre pour les garder sous sédation et placez huit moustiques de type sauvage dans la deuxième boîte de Pétri. Essuyez une pince à épiler avec de l’éthanol à 70% et utilisez la pince à épiler désinfectée pour enlever l’une des pattes postérieures des moustiques.
Ensuite, immergez la jambe dans la solution de réactif de libération d’ADN. Placez le moustique dans le flacon correspondant et fermez le flacon avec une éponge. Une fois cela fait, essuyez la pince à épiler avec de l’éthanol à 70% avant de retirer la jambe du moustique suivant jusqu’à ce que la plaque de 96 puits soit terminée.
Plus tard, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR et incubez la plaque PCR contenant les pieds à température ambiante pendant deux à cinq minutes, suivie d’une incubation à 98 degrés Celsius pendant deux minutes. Laissez la plaque refroidir à la température ambiante. Pour la PCR, préparez un mélange maître contenant les composants préférés, puis utilisez une pipette multicanal pour transférer 19 microlitres du mélange maître dans chaque puits de la plaque de 96 puits.
Après avoir transféré un microlitre de la solution de libération d’ADN contenant de l’ADN de moustique préalablement préparé sur la plaque, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR. Effectuez la PCR avec les paramètres de cycle appropriés pour générer des profils de fusion thermique en suivant les paramètres décrits dans le manuscrit, puis examinez les profils de fusion en attribuant un contrôle de type sauvage au cluster de référence. Marquez les différents clusters avec les couleurs correspondantes sur le modèle à 96 puits.
Ensuite, sélectionnez les individus avec des courbes d’intérêt et retirez les individus sélectionnés des tubes à la croix arrière. Le sang nourrit les femelles, suivies de la collecte de G2A. Dans l’analyse représentative, l’analyse de séquence du mutant ZIP11 d’Aedes aegypti est montrée.
L’électrophérogramme des mutants hétérozygotes Aedes aegypti ZIP11 indiquait la position nucléotidique où l’indel s’est produit. L’indel est représenté par un passage de pics simples à doubles car les positions polymorphes montrent les deux nucléotides en concomitance. À la fin de l’exécution, le nombre de paires de bases supprimées ou insérées a été calculé en comptant les pics uniques.
Les moustiques contenant des mutations dans les gènes Aedes aegypti ZIP11 et myo-fem ont été génotypés et séquencés vérifiés à l’aide de l’analyse de fusion à haute résolution de HRMA. Les signaux fluorescents des échantillons ont été normalisés à des valeurs relatives de un à zéro. De plus, chaque courbe a été soustraite de la référence de type sauvage et notée le grossissement correspondant.
Une affectation automatique de cluster ayant échoué est indiquée dans les résultats représentatifs, où une distinction correcte entre les groupes n’a pas été faite. De plus, chaque échantillon a été analysé individuellement et assigné aux groupes appropriés en fonction de la similitude avec les échantillons de référence d’hétérozygotes, d’homozygotes et de transhétérozygotes. Après avoir effectué des HRMA, le séquençage de l’ADN des individus mutés est nécessaire pour analyser les indels et identifier les autres mutations dans la séquence ciblée.
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Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant l'identification rapide d'indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l'aide d'une analyse de fusion à haute résolution. La méthode est efficace et applicable à divers organismes, permettant une détection rapide des mutants.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génétique
- Biologie moléculaire
- Entomologie
Contexte
- La technologie CRISPR/Cas9 est largement utilisée pour l'édition de gènes.
- Identifier efficacement les mutations est essentiel pour les études génétiques.
- L'analyse de fusion à haute résolution (HRMA) offre une méthode de détection rapide.
- Les difficultés dans la conception des amorces peuvent affecter l'efficacité de la HRMA.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole pour l'identification des mutations induites par CRISPR.
- Démontrer l'applicabilité de l'analyse HRMA chez divers organismes.
- Faciliter le processus de sélection des lignées mutantes.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un mélange maître pour la PCR.
- Utilisation de témoins sans matrice (NTC) dans une plaque de 96 puits.
- PCR en gradient pour optimiser les conditions.
- Analyse de fusion à haute résolution pour la détection d'indels.
Résultats principaux
- Le protocole permet une identification rapide des mutants.
- La HRMA peut être réalisée en quelques heures.
- Plusieurs cycles de conception d'amorces peuvent être nécessaires pour optimiser l'efficacité.
- La méthode est polyvalente et s'applique à différentes espèces.
Conclusions
- Ce protocole améliore l'efficacité de la détection des mutants.
- Il fournit un outil précieux pour la recherche génétique chez les moustiques.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode pour des applications plus larges.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection rapide des insertions et délétions induites par CRISPR/Cas9 permet une validation efficace des cibles dans la recherche sur la lutte antivectorielle, réduisant ainsi la durée des études fonctionnelles sur les gènes. L'analyse de fusion à haute résolution permet un génotypage à grande échelle sans sacrifice d'organisme, facilitant les tests phénotypiques ultérieurs et les croisements génétiques. Cette approche améliore la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en offrant une détection quantitative des mutations à partir d'échantillons tissulaires minimes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une détection rapide des insertions et délétions après mutagénèse CRISPR.
- Valeur opérationnelle : Facilite la réduction des risques biologiques en identifiant les allèles mutants sans sacrifier les organismes, préservant ainsi les échantillons pour des tests complémentaires.
- Impact sur le portefeuille : Accélère les flux de travail de validation des cibles, permettant une priorisation plus rapide des gènes cibles dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des courbes de fusion fluorescentes normalisées permettant une comparaison quantitative des génotypes sauvages et mutants.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les formats de plaques de 96 puits, permettant le criblage à débit moyen d'individus modifiés.
- Préparation du test : Génère des profils de fusion distincts pour les hétérozygotes, homozygotes et transhétérozygotes, permettant une attribution fiable aux groupes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet le génotypage suivi du phénotypage ou de l’alimentation en sang, établissant un lien entre la modification génétique et les résultats fonctionnels dans les modèles de maladies.
- Évaluation préventive des risques mécanistiques : Facilite la caractérisation des insertions/délétions (indels) par séquençage ultérieur, confirmant les effets spécifiques de la cible et identifiant d’éventuelles modifications hors cible.
- Soutien aux modèles précliniques : Permet la création de lignées mutantes chez Aedes aegypti, un vecteur clé pour les études de transmission des arbovirus.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la mutagénèse CRISPR à l'identification de candidats thérapeutiques, en fournissant un point de contrôle de génotypage avant la validation fonctionnelle.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en identifiant rapidement les indels perturbant la fonction génique dans les voies ciblées.
- Tri : Permet la standardisation des tests grâce à l'analyse normalisée des courbes de fusion et au regroupement basé sur des références.
- Analytique : Génère des décalages quantitatifs des profils de fusion corrélés à la taille des indels, permettant une analyse comparative entre échantillons.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la modification génétique et l'évaluation phénotypique en autorisant l'utilisation d'organismes vivants après génotypage.
- Réutilisation en entreprise : Réutilisable sur divers organismes et gènes, avec une conception d'amorces adaptable assurant une large applicabilité cible.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation de cibles en fournissant une preuve directe des résultats de l'édition génique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de PCR et d'analyse de fusion comportant des contrôles intégrés.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en réduisant le temps et les ressources nécessaires au criblage des mutants.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque en confirmant la présence de mutations avant d'investir dans des tests phénotypiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception et optimisation des amorces, car certains gènes peuvent requérir plusieurs itérations de conception pour une analyse HRMA efficace.
- Dépend d'un instrument disposant d'un contrôle précis de la rampe de température et d'une détection de la fluorescence adaptée à l'analyse de fusion haute résolution.
- Exige une préparation standardisée des échantillons à l'aide de tissu de jambe et de réactifs de libération d'ADN afin de garantir une qualité d'entrée constante.
- Nécessite des échantillons de référence de type sauvage pour une attribution précise des groupes et une normalisation des profils de fusion.
- Limitée par la nécessité d'effectuer un séquençage post-HRMA afin de caractériser complètement les indels et de détecter d'éventuelles mutations supplémentaires dans la séquence cible.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
