Name: Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'analyse de fusion à haute résolution pour détecter les indels CRISPR/Cas9 chez Aedes aegypti. Ce protocole efficace permet d'identifier les mutants en quelques heures et s'applique à divers organismes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Toutes les figurines ont été créées avec Biorender.com sous licence à la Texas A & M University. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (AI137112 et AI115138 à Z.N.A.), texas a & M AgriLife Research dans le cadre du programme de subventions pour les maladies tronquées par insectes et le national Institute of Food and Agriculture de l’USDA, projet Hatch 1018401.

1. Recherche de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), conception de l’amorce HRMA et validation de l’amorce
<ol><li>Identification SNP chez les moustiques de colonie de laboratoire de type sauvage<ol><li>Sélectionnez l’exon cible pour perturber la traduction appropriée des polypeptides. REMARQUE: La cible doit être proche du codon de départ ou parmi les résidus clés nécessaires à la fonction protéique. Plus l’exon est court (par exemple, ≤200 bases), plus il est difficile à cibler et à analyser. Évitez d’éditer près des limites d’un exon, car cela force l’un des amorces HRMA à traverser un intron ou à être dans un intron. Cela n’est pas souhaitable car les taux de SNP ont tendance à être beaucoup plus élevés dans ces régions.</li>
		<li>Conception de l’apprêt<ol>
<li>Rendez-vous sur le site Web NCBI Blast - Primer Blast15, copiez et collez l’exon choisi dans la boîte en haut de la page | choisissez la taille du produit PCR (assurez-vous qu’il englobe la majeure partie de l’exon) | choisissez l’organisme.</li>
			<li>Cliquez sur Paramètres avancés | Optez (pour PCR Product Tm) et ajoutez 60 (pour une température optimale de 60 °C) | Obtenez des amorces. Conservez les autres paramètres par défaut.</li>
		</ol></li>
		<li>Obtenir de l’ADN génomique (ADNg) de la colonie de laboratoire de type sauvage. Réservez 10 moustiques, anesthésiez-les avec du CO2 et placez-les dans une boîte de Pétri sur de la glace pour les garder inactifs. Installez 10 tubes contenant 0,5 μL de réactif pour la libération d’ADN des tissus et 20 μL de tampon de dilution, tous deux fournis dans le kit de libération d’ADN suggéré dans la table des matériaux.</li>
		<li>Retirez une jambe d’un seul moustique à l’aide d’une pince et placez-la dans un tube correspondant d’une solution diluée du réactif de libération d’ADN (à partir de l’étape 1.1.3), en immergeant complètement la jambe dans la solution. Répétez cette étape avec les moustiques restants, en essuyant les pinces avec 70% d’éthanol avant de passer à la suivante.</li>
		<li>Incuber la solution contenant la jambe à température ambiante pendant 2 à 5 min, puis à 98 °C pendant 2 min, et laisser refroidir tout en mettant en place la réaction PCR. REMARQUE: Les plaques contenant l’ADNg libéré peuvent être stockées à -20 ° C et le protocole peut être mis en pause à ce stade.</li>
		<li>Préparer 10 tubes contenant 10 μL de 2x PCR Master Mix, des amorces à une concentration finale de 0,5 μM et de l’eau de qualité moléculaire à un volume final de 20 μL, et transférer 1 μL de l’échantillon dilué dans chaque tube. Effectuer la PCR en suivant ces paramètres de cycle : 98 °C 5 min, 40 cycles de 98 °C pendant 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s par ko ; extension finale de 72 °C pendant 1 min.</li>
		<li>Purifier les produits pcR avec une enzyme pour dégrader les amorces de PCR résiduelles et déphosphoryler l’excès de dNTP ou tout kit de nettoyage de colonne. Procédez au séquençage des échantillons.</li>
		<li>Analysez chaque électrophérogramme pour détecter la présence de doubles pics/bases ambiguës et ajustez manuellement les appels de base dans chaque séquence à l’aide du code de base dégénéré approprié. REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avant l’alignement de plusieurs séquences, car il est courant que le logiciel appelant la base sélectionne le pic le plus important comme « vrai » appel de base, donnant la fausse impression d’une absence de SNP.</li>
		<li>Effectuez un alignement de plusieurs séquences à l’aide du logiciel d’alignement SeqMan Pro répertorié dans la table des matériaux ou d’un autre logiciel d’alignement open source, tel que ClustalW16 ou T-Coffee17.<ol>
<li>Ouvrez le logiciel d’alignement | cliquez sur Ajouter des séquences | sélectionnez les séquences souhaitées et cliquez sur Ajouter | une fois toutes les séquences choisies, cliquez sur Terminé.</li>
			<li>Cliquez sur Assembler pour effectuer l’alignement. Pour ouvrir l’alignement, cliquez sur Contig 1 et analysez l’alignement et identifiez les SNP (Figure 1). REMARQUE : Comme solution de rechange aux étapes 1.1.3 à 1.1.6, la PCR peut être effectuée à partir d’ADN génomique isolé obtenu à partir d’échantillons en vrac (provenant d’individus >10). Les amplicons séquencés peuvent être analysés directement pour détecter la présence de SNP apparaissant sous forme de doubles pics dans l’électrophérogramme, bien que les SNP rares soient plus difficiles à détecter.</li>
		</ol></li>
		<li>Concevoir 3 à 5 ARN à guide unique (SGRNV), en évitant les régions contenant tout SNP identifié ci-dessus, en suivant le protocole décrit en 18.</li>
	</ol></li>
	<li>Conception de l’apprêt HRMA<ol>
<li>Testez la séquence d’exons pour la formation possible de structures secondaires pendant la PCR à l’aide de mFold19.<ol>
<li>Accédez au serveur Web UNAFold | cliquez sur mFold | dans le menu déroulant, cliquez sur Applications | Forme de repliement de l’ADN.</li>
			<li>Entrez le nom de la séquence dans la zone et collez l’exon.</li>
			<li>Modifier la température de pliage à 60 °C; sur les conditions ioniques, changer [Mg++] à 1,5 et sur les unités passer à mM; cliquez sur Fold DNA.</li>
			<li>Sur Sortie, sous Structure 1, cliquez sur pdf pour ouvrir les tracés de structure circulaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Accédez à NCBI Blast - Primer Blast15 pour la conception de l’apprêt.</li>
		<li>Copiez et collez la séquence d’exons sélectionnée déterminée par séquençage à l’étape 1.1 (la séquence qui contient le plus petit nombre de SNP ou aucun SNP) dans la zone en haut de la page.</li>
		<li>Utilisez le symbole < > pour marquer et exclure les séquences qui contiennent des SNP, le site cible et les régions avec la formation possible d’une structure secondaire.</li>
		<li>Sélectionnez la taille du produit PCR entre 80 et 150 pb et choisissez l’organisme. REMARQUE: Des tailles de fragments plus grandes peuvent être utilisées avec succès (~ 300 bp). Cependant, des amplicons plus longs peuvent diminuer la sensibilité entre des séquences différant en une ou quelques paires de bases.</li>
		<li>Cliquez sur Obtenir des amorces. Sélectionnez 2 à 3 paires d’amorces à tester (idéalement, les sites d’amorce sont à ≥20 à 50 pb de tout site cible CRISPR).</li>
	</ol></li>
	<li>Validation de l’amorce<ol>
<li>Effectuez une PCR à gradient à l’aide de l’ADNg d’une seule personne.<ol>
<li>Préparez un mélange maître et retirez un échantillon pour le contrôle sans gabarit (NTC) dans un tube séparé. Ajoutez le gabarit au mélange principal restant et aliquote dans une plaque de 96 puits.</li>
			<li>Suivez les paramètres de cyclisme : 98 °C 30 s, 34 cycles de 98 °C pendant 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s ; prolongation finale de 72 °C pendant 10 min.</li>
			<li>Générez des profils de fusion thermique en suivant les paramètres : étape de dénaturation 95 °C pendant 1 min, recuit 60 °C pendant 1 min, détection de la courbe de fusion entre 75 °C et 95 °C par incréments de 0,2 °C, avec un temps de maintien de 10 s à chaque température. REMARQUE: Seules les températures de recuit avec un seul profil de fusion thermique doivent être utilisées.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Procéder à la génération des lignées mutantes avec des injections d’embryons comme décrit en 12.</li>
</ol>2. Préparation de l’ADN génomique des pattes de moustiques
<ol><li>Séparez les moustiques G1 par sexe au stade nymphal afin qu’ils ne s’accouplent pas avant le génotypage, et assurez-vous que des moustiques témoins de type sauvage et appariés selon l’âge seront disponibles pour être utilisés pour les références et les rétrocroisements. Séparez-les de sexe de même.</li>
	<li>Rassembler les matériaux nécessaires (figure 2A) et préparer une plaque de PCR de 96 puits avec 0,5 μL du réactif de libération d’ADN et 20 μL de tampon de dilution (du kit de libération d’ADNg) par individu à génotyper (figure 2B) et laisser sur la glace. Réservez deux réactions pour NTC.</li>
	<li>Étiquetez un plateau pour les flacons de moustiques (flacons de drosophiles ) afin que chaque puits sur la plaque de 96 corresponde au flacon de moustique respectif dans le plateau.</li>
	<li>Anesthésiez les moustiques G1 avec du CO2 et placez-les dans une boîte de Petri en verre pour les garder sous sédation (Figure 2C,D). Anesthésiez et placez 8 moustiques de type sauvage dans une deuxième boîte de Pétri.</li>
	<li>Essuyez une pince à épiler avec de l’éthanol à 70 % et retirez l’une des pattes postérieures des moustiques (Figure 2E, F).</li>
	<li>Immergez la jambe dans la solution de réactif à libération d’ADN, placez le moustique dans le flacon correspondant et fermez-le avec une éponge (Figure 2G,H).</li>
	<li>Essuyez à nouveau la pince à épiler avec de l’éthanol à 70% et retirez la jambe du moustique suivant. Répétez les étapes 2.5 à 2.7 jusqu’à ce que la plaque de 96 puits soit terminée. REMARQUE: Il est important d’essuyer la pince à épiler avec de l’éthanol à 70%. Cela minimise la contamination croisée de l’ADN.</li>
	<li>Sceller la plaque à l’aide d’un joint optique à plaque PCR (Figure 2I) et incuber la plaque de 96 puits contenant les pieds à température ambiante (RT) pendant 2 à 5 min, puis à 98 °C pendant 2 min. Laissez la plaque refroidir à RT pendant la préparation du mélange PCR. REMARQUE: L’ensemble du processus prend généralement 3-4 h. Si les moustiques doivent être conservés dans les flacons pendant plus de temps que la durée prévue (en particulier ≥1 jour), placez un petit morceau de raisin sec (ou source de sucre et d’eau) avec chaque moustique pour assurer la survie des moustiques pendant les incubations prolongées.</li>
</ol>3. HRMA
<ol><li>Effectuez la PCR.<ol>
<li>Préparer un mélange maître contenant les composants suivants pour chaque réaction : 10 μL de tampon 2x (du kit de libération d’ADNg), 0,5 μM de chaque apprêt, 1 μL de colorant EvaGreen, 0,4 μL de polymérase (du kit de libération d’ADNg), et compléter à 19 μL avec de l’eau de qualité moléculaire.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 19 μL du mélange maître dans chaque puits. Transférer 1 μL de la solution de libération d’ADN contenant de l’ADN de moustique préparée à la section 2 sur la plaque (Figure 3A). Scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR.</li>
		<li>Effectuer la PCR en suivant les paramètres de cycle : 98 °C pendant 5 min, 39 cycles de 98 °C pendant 10 s, la température de recuit choisie (72 °C) pendant 30 s ; extension finale 72 °C pendant 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Générez des profils de fusion thermique en suivant les paramètres : étape de dénaturation 95 °C pendant 1 min, recuit 60 °C pendant 1 min, détection de la courbe de fusion entre 75 °C et 95 °C par incréments de 0,2 °C, avec un temps de maintien de 10 s à chaque température. Reportez-vous au matériel supplémentaire et à la figure supplémentaire S1-S5 pour obtenir une description détaillée de la configuration logicielle pour l’exécution de HRMA à l’aide du système en temps réel CFX96.</li>
	<li>Examinez les profils de fusion (Figure 3B). Affectez un contrôle de type wild au cluster de référence. REMARQUE: Le logiciel (voir la table des matériaux) normalise automatiquement les données et désigne des clusters avec des couleurs pour différentes courbes de fusion.</li>
	<li>Marquez les différents clusters avec les couleurs correspondantes sur le modèle de 96 puits (Figure 3C).</li>
	<li>Sélectionnez les individus avec des courbes d’intérêt, retirez-les des tubes et rétrocroisez -- (Figure 3D). Nourrissez les femelles accouplées et recueillez des œufs de G2 .</li>
</ol>4. Vérification des séquences par séquençage sanger
<ol><li>Purifier le produit pcR des puits avec des moustiques sélectionnés (à partir de la plaque préparée à la section 3.1), en utilisant une enzyme pour dégrader les amorces de PCR résiduelles et déphosphoryler l’excès de dNTP. Vous pouvez également utiliser n’importe quel kit de nettoyage de colonne et procéder au séquençage des échantillons. REMARQUE: Le séquençage direct peut être plus difficile lorsque la taille du produit PCR est petite (≤200 pb). Dans de tels cas, concevez des amorces pour amplifier des fragments plus grands englobant le site cible (≥250 pb) et amplifier par PCR en utilisant l’ADN dans la plaque de 96 puits (étape 2.2).</li>
	<li>Analysez et identifiez les indels à l’aide d’un logiciel de visionneuse de traces (Figure 4). Alternativement, Poly Peak Parser software20 peut aider à détecter la mutation chez les individus hétérozygotes.<ol>
<li>Accédez au site Web Poly Peak Parser, sélectionnez la séquence parmi les individus mutants dans le menu Parcourir , puis copiez et collez la séquence de référence dans la zone. REMARQUE: L’alignement entre l’allèle alternatif et la référence apparaîtra automatiquement sur le côté droit de l’écran.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , Report No. 978 160(2009).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+epidemiology+update%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li>
<li>WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li>
<li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li>
<li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li>
<li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female%2C+but+not+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).</li>
<li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li>
<li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Coffee%3A+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+peak+parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP%2FZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L’analyse de fusion à haute résolution offre une solution simple et rapide pour l’identification des indels générés par la technologie CRISPR/Cas9 chez le moustique vecteur Ae. aegypti. Il offre de la flexibilité, permettant le génotypage des moustiques mutés pour un large éventail de gènes allant du muscle de vol au métabolisme du fer et plus encore13,14. HRMA peut être effectué en quelques heures seulement, de la collecte de l’échantillon aux analyses ...

En tant que vecteurs d’agents pathogènes tels que les virus de la dengue1, zika2 et chikungunya3, ainsi que des parasites du paludisme4, les moustiques représentent une menace importante pour la santé publique humaine. Pour toutes ces maladies, l’intervention de transmission est fortement axée sur la lutte contre les moustiques vecteurs. L’étude des gènes importants, par exemple, dans la permissivité des agents pathogènes, la condition physique des moustiques, la survie, la reproduction et la résistance aux insecticides est essentielle pour développer de nouvelles stratégies de lutte contre les moustiques. À ces fins, l’édition du génome chez les moustiques devient une pratique courante, en particulier avec le développement de technologies telles que les HE, les ZFN, les TALEN et, plus récemment, CRISPR avec Cas9. L’établissement de souches génétiquement modifiées implique généralement le croisement d’individus porteurs des mutations souhaitées pendant quelques générations afin de minimiser les effets hors cible et fondateurs (goulot d’étranglement), suivis du croisement d’individus hétérozygotes pour générer des lignées homozygotes ou trans-hétérozygotes. En l’absence d’un marqueur dominant, le génotypage moléculaire est nécessaire dans ce processus car, dans de nombreux cas, aucun trait phénotypique clair ne peut être détecté pour les mutants hétérozygotes.
Bien que le séquençage soit l’étalon-or pour la caractérisation génotypique, le faire sur des centaines, voire des milliers d’individus, entraîne des coûts, de la main-d’œuvre et du temps importants pour obtenir des résultats, ce qui est particulièrement critique pour les organismes à courte durée de vie tels que les moustiques. Les solutions de rechange couramment utilisées sont le test de nucléase Surveyor5 (SNA), le test T7E16 et l’analyse de fusion à haute résolution (HRMA, examiné dans 7). SNA et T7E1 utilisent tous deux des endonucléases qui ne coupent que des bases incompatibles. Lorsqu’une région mutée du génome mutant hétérozygote est amplifiée, des fragments d’ADN provenant d’allèles mutants et de type sauvage sont recuits pour former de l’ADN double brin dépareillé (ADNds). Le SNA détecte la présence d’inadéquations par digestion avec une endonucléase spécifique à l’inadéquation et une électrophorèse simple sur gel d’agarose. Alternativement, HRMA utilise les propriétés thermodynamiques de l’ADNds détectés par les colorants fluorescents liant l’ADNds, la température de dissociation du colorant variant en fonction de la présence et du type de mutation. HRMA a été utilisé pour la détection de polymorphismes mononucléotidiques (SNP)8, le génotypage mutant du poisson zèbre9, les applications microbiologiques10 et la recherche en génétique végétale11, entre autres.
Cet article décrit HRMA, une méthode simple de génotypage moléculaire pour les moustiques mutants générée par la technologie CRISPR/Cas9. Les avantages de HRMA par rapport aux techniques alternatives comprennent 1) la flexibilité, car elle s’est avérée utile pour divers gènes, une large gamme de tailles d’indel, ainsi que la distinction entre différentes tailles d’indel et la différenciation hétérozygote, homozygote et trans-hétérozygote12,13,14, 2) le coût, car il est basé sur les réactifs PCR couramment utilisés, et 3) le gain de temps, car il peut être effectué en quelques heures seulement. En outre, le protocole utilise une petite partie du corps (une jambe) comme source d’ADN, permettant au moustique de survivre au processus de génotypage, permettant l’établissement et le maintien de lignées mutantes.

<table><tbody><tr><td>70 % d’éthanol</td><td></td><td></td> Solution <td>d’éthanol à 70 % dans l’eau</td></tr><tr><td>Plaques PCR à 96 puits et PCR en temps réel</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>Pour l’obtention de l’ADN génomique (de la patte du moustique)</td></tr><tr><td>Modèles</td><td></td><td></td> de plaques à 96 puits <td>Imprimés sur place, pour l’enregistrement du génotype</td></tr><tr><td>Bio Rad CFX96</td><td>Machine de PCR Bio Rad</td><td></td><td></td> avec capacités de gradient et HRMA</tr><tr><td>Réservoirs de réactifs Diversified Biotech</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Plaques PCR à paroi mince à 96 puits à coque dure</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>pour</td></tr><tr><td>HRMA Pipette multicanaux (P10)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Ruban d’étanchéité en polyoléfine acrylate, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>À utiliser avec le 96-well&nbsp ; Plaques PCR pour l’obtention de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>Bande de scellement optique</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>À utiliser avec les plaques PCR à jupe à 96 puits pour HRMA</td></tr><tr><td>Phire Kit de PCR directe pour tissus animaux (sans outils d’échantillonnage)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>Pour l’obtention de l’ADN génomique et la réalisation de</td></tr><tr><td>PCR Diviseurs de flacons de mouches en plastique</td><td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de fusion de précision</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>Utilisé pour le génotypage des échantillons d’ADN de moustiques et l’analyse des propriétés de dénaturation thermique de l’ADN double brin (voir protocole étape 3.3)</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td> SeqMan Pro <td>DNAstar Lasergene</td><td>Pour l’alignement de séquences multiples</td></tr><tr><td>Pipette monocanal</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler Dumont #5 11 cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons en mousse blanche</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>Flacons larges pour drosophiles, polystyrène</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Plateau pour flacons larges pour mouches, bleu</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

détection d’indel suite à la mutagénèse crispr/cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique aedes aegypti

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

L’édition de gènes de moustiques est devenue une routine dans plusieurs laboratoires avec la mise en place de systèmes tels que les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les endonucléases de homing (HE). Plus récemment, la technologie CRISPR (CRISPR) / protéine 9 associée à CRISPR (CAS9) a offert une alternative plus facile et moins chère pour l’ingénierie du génome de précision. Après l’action de la nucléase, les voies de réparation de l’ADN répareront les extrémités brisées de l’ADN, introduisant souvent des indels. Ces mutations hors cadre sont ensuite utilisées pour comprendre la fonction des gènes dans les organismes cibles. Un inconvénient, cependant, est que les individus mutants ne portent aucun marqueur dominant, ce qui rend l’identification et le suivi des allèles mutants difficiles, en particulier aux échelles nécessaires pour de nombreuses expériences. 
L’analyse de fusion à haute résolution (HRMA) est une méthode simple pour identifier les variations dans les séquences d’acides nucléiques et utilise des courbes de fusion PCR pour détecter de telles variations. Cette méthode d’analyse post-PCR utilise des colorants fluorescents à double brin liant l’ADN avec une instrumentation dotée d’une capacité de capture de données de contrôle de la température et facilement mise à l’échelle à des formats de plaques à 96 puits. Décrit ici est un flux de travail simple utilisant HRMA pour la détection rapide des indels induits par CRISPR / Cas9 et l’établissement de lignées mutantes chez le moustique Ae. aegypti. De manière critique, toutes les étapes peuvent être effectuées avec une petite quantité de tissu de jambe et ne nécessitent pas de sacrifier l’organisme, ce qui permet d’effectuer des croisements génétiques ou des tests de phénotypage après le génotypage.

Les moustiques contenant des mutations dans les gènes AaeZIP11 (transporteur putatif de fer21) et myo-fem (un gène de myosine à biais féminin lié aux muscles volants13) ont été obtenus à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9, génotypés à l’aide de HRMA et vérifiés par séquence (Figure 5). La figure 5A et la figure 5C montrent l’intensité de fluorescence normalisée des ...

Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Ce protocole est un moyen très simple et efficace de détecter les mutants générés par la technologie CRISPR/Cas9 de nombreux individus. Les deux principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut se faire en quelques heures et qu’elle est applicable à une multitude d’organismes. La conception de l’amorce peut être difficile pour certains gènes et plusieurs cycles de conception et de vérification de l’amorce peuvent être nécessaires pour rendre HRMA efficace.Pour effectuer une PCR de dégradé, commencez par préparer un mélange maître. Retirez ensuite 19 microlitres du mélange principal pour le contrôle sans gabarit ou NTC dans une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez le modèle au mélange principal restant.Aliquote 20 microlitres du mélange d’échantillon dans la plaque de 96 puits. Effectuez la PCR en suivant les paramètres de cycle, puis générez les profils de fusion thermique en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit. Après avoir rassemblé tout le matériel requis, préparez un mélange maître avec 0,5 microlitre du réactif de libération d’ADN et 20 microlitres de tampon de dilution par individu à génotyper.À l’aide d’une pipette multicanal, aliquotez 20 microlitres du mélange dans une plaque pcR et laissez la plaque PCR sur la glace. Ensuite, placez les moustiques G1 anesthésiés dans une boîte de Petri en verre pour les garder sous sédation et placez huit moustiques de type sauvage dans la deuxième boîte de Pétri. Essuyez une pince à épiler avec de l’éthanol à 70% et utilisez la pince à épiler désinfectée pour enlever l’une des pattes postérieures des moustiques.Ensuite, immergez la jambe dans la solution de réactif de libération d’ADN. Placez le moustique dans le flacon correspondant et fermez le flacon avec une éponge. Une fois cela fait, essuyez la pince à épiler avec de l’éthanol à 70% avant de retirer la jambe du moustique suivant jusqu’à ce que la plaque de 96 puits soit terminée.Plus tard, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR et incubez la plaque PCR contenant les pieds à température ambiante pendant deux à cinq minutes, suivie d’une incubation à 98 degrés Celsius pendant deux minutes. Laissez la plaque refroidir à la température ambiante. Pour la PCR, préparez un mélange maître contenant les composants préférés, puis utilisez une pipette multicanal pour transférer 19 microlitres du mélange maître dans chaque puits de la plaque de 96 puits.Après avoir transféré un microlitre de la solution de libération d’ADN contenant de l’ADN de moustique préalablement préparé sur la plaque, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR. Effectuez la PCR avec les paramètres de cycle appropriés pour générer des profils de fusion thermique en suivant les paramètres décrits dans le manuscrit, puis examinez les profils de fusion en attribuant un contrôle de type sauvage au cluster de référence. Marquez les différents clusters avec les couleurs correspondantes sur le modèle à 96 puits.Ensuite, sélectionnez les individus avec des courbes d’intérêt et retirez les individus sélectionnés des tubes à la croix arrière. Le sang nourrit les femelles, suivies de la collecte de G2A. Dans l’analyse représentative, l’analyse de séquence du mutant ZIP11 d’Aedes aegypti est montrée.L’électrophérogramme des mutants hétérozygotes Aedes aegypti ZIP11 indiquait la position nucléotidique où l’indel s’est produit. L’indel est représenté par un passage de pics simples à doubles car les positions polymorphes montrent les deux nucléotides en concomitance. À la fin de l’exécution, le nombre de paires de bases supprimées ou insérées a été calculé en comptant les pics uniques.Les moustiques contenant des mutations dans les gènes Aedes aegypti ZIP11 et myo-fem ont été génotypés et séquencés vérifiés à l’aide de l’analyse de fusion à haute résolution de HRMA. Les signaux fluorescents des échantillons ont été normalisés à des valeurs relatives de un à zéro. De plus, chaque courbe a été soustraite de la référence de type sauvage et notée le grossissement correspondant.Une affectation automatique de cluster ayant échoué est indiquée dans les résultats représentatifs, où une distinction correcte entre les groupes n’a pas été faite. De plus, chaque échantillon a été analysé individuellement et assigné aux groupes appropriés en fonction de la similitude avec les échantillons de référence d’hétérozygotes, d’homozygotes et de transhétérozygotes. Après avoir effectué des HRMA, le séquençage de l’ADN des individus mutés est nécessaire pour analyser les indels et identifier les autres mutations dans la séquence ciblée.

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Cette vidéo démontre le rôle de la réaction en chaîne par polymérase numérique dans l’identification de la mutation indel dans un échantillon d’ADN. La haute précision et la sensibilité de la ddPCR permettent une détection précise et cohérente des mutations rares présentes dans un échantillon, même à de faibles niveaux. Il permet d’identifier et de quantifier les mutations indel dans différentes régions du génome, fournissant ainsi des informations précieuses sur les mécanismes de mutation et...

Réaction en chaîne par polymérase numérique pour la détection de mutations indel dans des gènes cibles

Cette vidéo illustre la réaction en chaîne de la polymérase de gradient pour l’optimisation de la température de recuit des amorces, qui définit la température de recuit de gradient le long des puits. L’effet des différentes températures de recuit est déterminé par le rendement des produits amplifiés qui permet d’optimiser les conditions de réaction.

Réaction en chaîne par polymérase à gradient pour déterminer la température de recuit optimale

Ce protocole décrit le flux de travail d’un gène CRISPR/Cas9-base de montage pour la réparation des mutations ponctuelles dans les cellules de mammifères. Ici, nous utilisons une approche combinatoire de gène avec une stratégie expérimentale suivie détaillée pour mesurer la formation indel au site cible — analyse essentiellement, mutagenèse sur place.

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.

Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Ce protocole fournit les étapes de l’extraction de l’ADN à la mise en place expérimentale de la PCR numérique des gouttelettes (ddPCR), y compris l’analyse pour l’identification et la quantification des événements de jonction terminale non homologues (NHEJ) sur les sites cibles après le clivage Cas9 induit par l’ARNg et la réparation de l’ADN. D’autres utilisations de cette méthode comprennent des applications telles que la détection de polymorphisme et la vérification des variantes d’édition...

PCR numérique par gouttelettes pour détecter les mutations indels dans les populations de moustiques anophélines génétiquement modifiés

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9.

Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Génétiquement codés histone-miniSOG induit des mutations héréditaires du génome entier d'une manière dépendant de la lumière bleue. Cette méthode de mutagenèse est simple, rapide, exempt de produits chimiques toxiques, et bien adapté pour le dépistage génétique avant et l'intégration du transgène.

Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Découvrez une méthode rapide d'analyse de fusion à haute résolution pour détecter les indels CRISPR/Cas9 chez Aedes aegypti. Ce protocole efficace permet d'identifier les mutants en quelques heures et s'applique à divers organismes.

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti (Vidéo) | JoVE Journal

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

Explorer plus de vidéos