Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d'enveloppe l'aide d'un base de cellules test ELISA
14 septembre 2014
Comprendre les conformations des antigènes de surface viraux est nécessaire pour évaluer la neutralisation des anticorps et guider la conception d’immunogènes vaccinaux efficaces. Nous décrivons ici un test ELISA basé sur des cellules qui permet d’étudier la reconnaissance du VIH-1 trimérique Env exprimé à la surface des cellules transfectées par des anticorps anti-Env spécifiques.
L’objectif global de l’expérience suivante est d’interroger les glycoprotéines d’une enveloppe RIC HIV ou la confirmation ENV avec des anticorps monoclonaux. Ceci est réalisé en transectant d’abord les cellules d’adhérence pour exprimer les protéines chimériques du VIH un E NV à la surface de la cellule. Dans un deuxième temps, les cellules sont incubées avec des anticorps monoclonaux anti-ENV, qui vont se lier à l’ENV en fonction de l’exposition à l’épitope.
Ensuite, un anticorps secondaire conjugué HRP est ajouté afin de quantifier l’interaction des anticorps par un test de chimiluminescence. On obtient des résultats qui montrent les niveaux relatifs d’anticorps liés au VNV en fonction des unités de lumière relatives acquises pour chacun. Eh bien, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la liaison basée sur les faits, est que cette technique peut être réalisée avec une faible quantité d’anticorps et à haut débit, un post-doctorant en laboratoire effectuera cette technique.
Les cellules d’ostéosarcome humain sont utilisées dans cette expérience un jour avant la plaque de transfection, deux fois 10 à la quatrième cellule par puits. Dans une plaque de culture cellulaire opaque de 96 puits adaptée à la lecture par luminescence. Le milieu d’aigle modifié Delcos utilisé complété par du sérum de veau fœtal et de la streptomycine à la pénicilline incube les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.
Préparez le mélange de transfection. Tout d’abord, disposez deux tubes, deux baies et deux B à deux baies. Ajoutez cinq microlitres de DMEM complétés par 25 millimolaires de hippies, suivis de 10 nanogrammes de tat et de plasmide d’enrobage, et de 150 nanogrammes de plasmide codant pour une glycoprotéine chimérique du VIH.
Il est à noter que le plasmide codant pour TAT n’est requis que lors de l’utilisation d’un plasmide codant pour une glycoprotéine d’enveloppe du VIH dépendant de TAT à deux B à cinq microlitres de DMM et 450 nanogrammes de polyéthaline ou PEI. Les quantités de réactifs et d’ADN doivent être ajustées en fonction du nombre de puits qui doivent être transfectés avec la même glycoprotéine d’enveloppe du VIH. Ensuite, ajoutez le contenu de deux B à deux baies et mélangez soigneusement en vortex pendant 10 secondes.
Incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, ajoutez 10 microlitres du mélange de transfection par puits de la plaque de 96 puits incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % d’oxyde de carbone. L’étude Ali SA pour étudier la reconnaissance de la glycoprotéine chimérique d’une enveloppe du VIH par des anticorps monoclonaux est réalisée deux jours après la transfection des cellules de l’ostéosarcome humain.
Préparez 250 millilitres de tampon de lavage par plaque utilisée en même temps. Préparez 125 millilitres de tampon de blocage par assiette en ajoutant 1 % de lait écrémé en poudre et cinq millimolaires de tris pH 8,0 au tampon de lavage. Retirez le milieu de culture cellulaire et le mélange de transfection de la plaque à 96 puits.
Ajouter 100 microlitres de tampon de blocage par puits et incuber pendant 20 minutes. À température ambiante, retirer le surnageant et ajouter 50 microlitres d’anticorps par puits dilués à la concentration appropriée dans un tampon de blocage. Incuber pendant une heure à température ambiante.
Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis répétez le processus de lavage trois fois. Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage après le dernier lavage. Retirez le sate.
Ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage et incubez pendant cinq minutes. À température ambiante, retirez le surnageant et ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués un à 3000 dans un tampon de blocage. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante après 40 minutes.
Laver trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, suivi de trois lavages avec 100 microlitres de tampon de lavage. Pour préparer les échantillons à l’acquisition des données, retirez le surnageant de la plaque de 96 puits et ajoutez 30 microlitres d’un substrat de chimiluminescence x amélioré par puits. Acquérir le signal de chimiluminescence pendant une seconde par puits sur un lecteur de plaques approprié.
Selon les instructions du fabricant, l’impact du CD quatre soluble ou du CD quatre S sur l’exposition des épitopes du CD quatre I sur les glycoprotéines d’enveloppe ou l’ENV a été l’interaction du CD quatre avec l’ENV induit des changements de confirmation de l’ENV qui exposent les épitopes 17 B et 48 D qui chevauchent le site de liaison du corécepteur, mais n’affecte pas le domaine externe reconnaissant l’anticorps deux G 12. Pour évaluer l’impact des mutations ponctuelles dans la confirmation NV, deux mutants ENV ont été utilisés : H 66 A, qui a une propension réduite à échantillonner spontanément la confirmation liée à quatre CD, et S3 75 W, qui prédispose la NV à l’état CD à quatre liaisons. La normalisation des données brutes en fonction des niveaux d’expression révèle que H 66 A diminue la reconnaissance des CD quatre I 17 B, tandis que S3 75 W améliore le signal 17 B et est suffisant pour restaurer le phénotype du H 66.
Un mutant testant les cellules cot transfectées avec des quantités croissantes d’un exprimeur CD quatre. Avec les barres bleues NV, les barres bleues ont révélé des signaux croissants pour les anticorps monoclonaux CD quatre I, A trois, deux et C 11, qui ont reconnu les épitopes discontinus dans le domaine interne de la glycoprotéine ENV. La reconnaissance de GP un 20 ENV par les deux anticorps G 12 n’a pas été affectée.
Enfin, les données brutes ont été normalisées à deux G 12, l’absence d’une modulation 32 et C 11 lorsque ENV a été transfectée avec un mutant CD quatre avec une capacité réduite à interagir avec ENV indique que l’augmentation des signaux dépendait de l’interaction E NV CD quatre Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures.
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Aperçu
Cette étude porte sur la conformation des glycoprotéines de l'enveloppe du VIH-1 et leur interaction avec des anticorps monoclonaux. Un dosage ELISA basé sur des cellules est utilisé pour évaluer la liaison d'anticorps anti-Env spécifiques aux protéines d'enveloppe trimeriques du VIH-1 exprimées à la surface de cellules transfectées.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La compréhension des antigènes de surface virale est essentielle pour le développement de vaccins.
- La neutralisation par les anticorps dépend de la conformation de ces antigènes.
- Les méthodes existantes peuvent nécessiter des quantités plus importantes d'anticorps et sont moins efficaces.
- Cette étude présente une technique à haut débit pour l'analyse des interactions des anticorps.
Objectif de l'étude
- Étudier la conformation des protéines Env du VIH-1.
- Évaluer la liaison d'anticorps monoclonaux à ces protéines.
- Développer un dosage plus efficace pour l'analyse des interactions anticorps.
Méthodes utilisées
- Transfection de cellules adhérentes pour exprimer des protéines chimériques de l'Env du VIH-1.
- Incubation des cellules avec des anticorps monoclonaux anti-Env.
- Utilisation d'anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pour la quantification.
- Mesure de la chimiluminescence afin de déterminer les niveaux de liaison des anticorps.
Résultats principaux
- Démonstration de la liaison d'anticorps à Env du VIH-1 en fonction de l'exposition de l'épitope.
- Mesure des niveaux relatifs d'interaction des anticorps par unités de lumière.
- Mise en évidence des avantages de ce dosage par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Permis l'analyse avec des quantités réduites d'anticorps et un débit plus élevé.
Conclusions
- Le dosage ELISA basé sur des cellules est efficace pour l'étude des conformations de l'Env du VIH-1.
- Cette méthode peut faciliter la conception d'immunogènes vaccinaux plus efficaces.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette technique pour des recherches supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce dosage ELISA basé sur des cellules permet une évaluation à haut débit des états conformationnels de l'Env du VIH-1 en utilisant des quantités minimales d'anticorps, facilitant ainsi le criblage précoce d'immunogènes et la caractérisation d'anticorps. En détectant les variations d'exposition des épitopes induites par le CD4 ou par des protéines cellulaires, ce dosage fournit des lectures quantitatives qui éclairent les décisions en matière de conception de vaccins et réduisent les ambiguïtés mécanistiques lors de la validation des cibles. L'adaptabilité de cette méthode à l'analyse de l'Env muté et au criblage de ligands solubles en fait un outil de découverte réutilisable pour hiérarchiser les candidats présentant des profils antigéniques favorables.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en mesurant la liaison conformationnellement dépendante d'anticorps aux trimères de l'Env du VIH-1.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles Env grâce à la détection spécifique d'épitopes dans des conditions définies.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en identifiant les antigènes qui exposent des épitopes clés tels que 17B ou 48D lors de l'engagement du CD4.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Prépare un Env trimerique exprimé par les cellules, standardisé, destiné à des campagnes de criblage d'anticorps en aval.
- Valeur opérationnelle : Fournit des signaux lisibles reproductibles basés sur la chimiluminescence, adaptés à des formats allant du moyen au haut débit.
- Extensibilité : Nécessite un équipement spécialisé minimal, permettant une adoption large dans les laboratoires de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Associe l'exposition des épitopes conformationnels à des résultats fonctionnels pertinents pour l'immunité induite par les vaccins.
- Réduction des risques mécanistiques : Évalue comment des mutations ponctuelles (par exemple, H66A, S375W) modifient l'échantillonnage par Env des états liés au CD4, apportant des informations sur la stabilité de l'immunogène.
- Alignement préclinique : Facilite l'évaluation des profils de reconnaissance des anticorps qui corrélatent avec l'étendue de la neutralisation.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la conception de l'antigène à l'identification des anticorps candidats, permettant un affinement itératif des immunogènes Env fondé sur le profilage conformationnel.
- Découverte en biologie : Évalue comment les ligands solubles ou les mutations affectent la conformation d'Env et l'accessibilité des épitopes.
- criblage : Génère des données quantitatives de liaison des anticorps par chimiluminescence pour la sélection des hits dans des panels d'anticorps.
- Analytique : Normalise le signal par rapport aux contrôles d'expression (par exemple, 2G12) afin d'isoler les effets spécifiques à la conformation des variations d'expression.
- Recherche translationnelle : Corrèle l'exposition des épitopes du domaine interne (par exemple, 17B, 48D) à l'accessibilité du site de liaison du co-récepteur, un aspect pertinent pour la conception d'inhibiteurs d'entrée.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme modulaire permettant d'évaluer diverses variantes d'Env, anticorps ou ligands sans avoir à reformater le flux opérationnel principal.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive de l'antigénicité en associant la conformation à la reconnaissance par les anticorps.
- Valeur opérationnelle : Réduit la consommation de réactifs et la durée des tests, permettant une itération rapide dans l'optimisation des anticorps et des antigènes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant dès le départ une évaluation quantitative des états structuraux d'Env.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des immunogènes en fonction de leur capacité à adopter des conformations pertinentes pour le vaccin.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en transfection de cellules de mammifères et en manipulation d'anticorps.
- Dépend de l'accès à un lecteur de plaques doté d'une fonction de détection de la luminescence et à une infrastructure standard de culture cellulaire.
- Exige une standardisation des tampons de blocage et de lavage entre les équipes afin d'obtenir un signal reproductible.
- Doit tenir compte de la variabilité des niveaux d'expression d'Env lors de la comparaison de mutants ou de conditions expérimentales.
- Limité aux trimères exprimés à la surface cellulaire et conservant une conformation intacte ; peut ne pas détecter les intermédiaires intracellulaires.
