Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d'enveloppe l'aide d'un base de cellules test ELISA

L’objectif global de l’expérience suivante est d’interroger les glycoprotéines d’une enveloppe RIC HIV ou la confirmation ENV avec des anticorps monoclonaux. Ceci est réalisé en transectant d’abord les cellules d’adhérence pour exprimer les protéines chimériques du VIH un E NV à la surface de la cellule. Dans un deuxième temps, les cellules sont incubées avec des anticorps monoclonaux anti-ENV, qui vont se lier à l’ENV en fonction de l’exposition à l’épitope.

Ensuite, un anticorps secondaire conjugué HRP est ajouté afin de quantifier l’interaction des anticorps par un test de chimiluminescence. On obtient des résultats qui montrent les niveaux relatifs d’anticorps liés au VNV en fonction des unités de lumière relatives acquises pour chacun. Eh bien, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la liaison basée sur les faits, est que cette technique peut être réalisée avec une faible quantité d’anticorps et à haut débit, un post-doctorant en laboratoire effectuera cette technique.

Les cellules d’ostéosarcome humain sont utilisées dans cette expérience un jour avant la plaque de transfection, deux fois 10 à la quatrième cellule par puits. Dans une plaque de culture cellulaire opaque de 96 puits adaptée à la lecture par luminescence. Le milieu d’aigle modifié Delcos utilisé complété par du sérum de veau fœtal et de la streptomycine à la pénicilline incube les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.

Préparez le mélange de transfection. Tout d’abord, disposez deux tubes, deux baies et deux B à deux baies. Ajoutez cinq microlitres de DMEM complétés par 25 millimolaires de hippies, suivis de 10 nanogrammes de tat et de plasmide d’enrobage, et de 150 nanogrammes de plasmide codant pour une glycoprotéine chimérique du VIH.

Il est à noter que le plasmide codant pour TAT n’est requis que lors de l’utilisation d’un plasmide codant pour une glycoprotéine d’enveloppe du VIH dépendant de TAT à deux B à cinq microlitres de DMM et 450 nanogrammes de polyéthaline ou PEI. Les quantités de réactifs et d’ADN doivent être ajustées en fonction du nombre de puits qui doivent être transfectés avec la même glycoprotéine d’enveloppe du VIH. Ensuite, ajoutez le contenu de deux B à deux baies et mélangez soigneusement en vortex pendant 10 secondes.

Incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, ajoutez 10 microlitres du mélange de transfection par puits de la plaque de 96 puits incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % d’oxyde de carbone. L’étude Ali SA pour étudier la reconnaissance de la glycoprotéine chimérique d’une enveloppe du VIH par des anticorps monoclonaux est réalisée deux jours après la transfection des cellules de l’ostéosarcome humain.

Préparez 250 millilitres de tampon de lavage par plaque utilisée en même temps. Préparez 125 millilitres de tampon de blocage par assiette en ajoutant 1 % de lait écrémé en poudre et cinq millimolaires de tris pH 8,0 au tampon de lavage. Retirez le milieu de culture cellulaire et le mélange de transfection de la plaque à 96 puits.

Ajouter 100 microlitres de tampon de blocage par puits et incuber pendant 20 minutes. À température ambiante, retirer le surnageant et ajouter 50 microlitres d’anticorps par puits dilués à la concentration appropriée dans un tampon de blocage. Incuber pendant une heure à température ambiante.

Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis répétez le processus de lavage trois fois. Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage après le dernier lavage. Retirez le sate.

Ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage et incubez pendant cinq minutes. À température ambiante, retirez le surnageant et ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués un à 3000 dans un tampon de blocage. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante après 40 minutes.

Laver trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, suivi de trois lavages avec 100 microlitres de tampon de lavage. Pour préparer les échantillons à l’acquisition des données, retirez le surnageant de la plaque de 96 puits et ajoutez 30 microlitres d’un substrat de chimiluminescence x amélioré par puits. Acquérir le signal de chimiluminescence pendant une seconde par puits sur un lecteur de plaques approprié.

Selon les instructions du fabricant, l’impact du CD quatre soluble ou du CD quatre S sur l’exposition des épitopes du CD quatre I sur les glycoprotéines d’enveloppe ou l’ENV a été l’interaction du CD quatre avec l’ENV induit des changements de confirmation de l’ENV qui exposent les épitopes 17 B et 48 D qui chevauchent le site de liaison du corécepteur, mais n’affecte pas le domaine externe reconnaissant l’anticorps deux G 12. Pour évaluer l’impact des mutations ponctuelles dans la confirmation NV, deux mutants ENV ont été utilisés : H 66 A, qui a une propension réduite à échantillonner spontanément la confirmation liée à quatre CD, et S3 75 W, qui prédispose la NV à l’état CD à quatre liaisons. La normalisation des données brutes en fonction des niveaux d’expression révèle que H 66 A diminue la reconnaissance des CD quatre I 17 B, tandis que S3 75 W améliore le signal 17 B et est suffisant pour restaurer le phénotype du H 66.

Un mutant testant les cellules cot transfectées avec des quantités croissantes d’un exprimeur CD quatre. Avec les barres bleues NV, les barres bleues ont révélé des signaux croissants pour les anticorps monoclonaux CD quatre I, A trois, deux et C 11, qui ont reconnu les épitopes discontinus dans le domaine interne de la glycoprotéine ENV. La reconnaissance de GP un 20 ENV par les deux anticorps G 12 n’a pas été affectée.

Enfin, les données brutes ont été normalisées à deux G 12, l’absence d’une modulation 32 et C 11 lorsque ENV a été transfectée avec un mutant CD quatre avec une capacité réduite à interagir avec ENV indique que l’augmentation des signaux dépendait de l’interaction E NV CD quatre Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures.