Name: Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines denveloppe laide dun base de cellules test ELISA (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez une méthode ELISA cellulaire pour évaluer la conformation des glycoprotéines d'enveloppe du VIH-1 et leur interaction avec des anticorps monoclonaux. Cette technique haut débit permet d'analyser les épitopes exposés avec peu d'anticorps.

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Nous remercions le Dr James Robinson pour son généreux don de la A32, 17b, 48d, et C11 Acm. PGT 121 a été obtenue par le programme réactif NIH SIDA, Division du sida, NIAID, NIH (Cat # 12343). Ce travail a été soutenu par une Fondation canadienne pour chef de programme Innovation # 29866, par un fonctionnement des IRSC # 257792, par un FRQS création de Young Scientist accorder # 24639 à AF et par un continuum subvention au CRCHUM ainsi que par une subvention de catalyseur des IRSC # 126630 AF et MR. AF est le destinataire d&#39;un FRSQ Chercheur Boursier junior 1 bourse # 24639. MV a été soutenue par une bourse de recherche au doctorat des IRSC # 291485.

1 Jour 1 - Culture Cellulaire <ol><li> Planche 2 x 10 4 ostéosarcome humain (HOS) des cellules par puits dans une, plaque à 96 puits de culture cellulaire opaque approprié pour la lecture de luminescence. Utilisation du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine. Incuber jusqu&#39;au lendemain à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2 Jour 2 - Polyéthylènimine (PEI) de transfection <ol><li> Préparer mélange de transfection selon les étapes suivantes. Ajuster les réactifs et les quantités d&#39;ADN en fonction du nombre de puits qui doivent être transfectées avec le même Env. </li><li> Tube A: Ajouter 10 ng Tat plasmide codant (comme pTAT-III 27) et 150 ng Env plasmide codant pour 5 pi DMEM supplémenté avec 25 mM d&#39;HEPES. </li><li> Le plasmide Tat-codage n&#39;est nécessaire lors de l&#39;utilisation des plasmides Tat-dépendante Env-codant tels que pSVIII. </li><li> Tube B: Ajouter 450 ng PEI (à partir d&#39;un 1ug / ul solution) à 5 pi DMEM. </li><li> Ajouter le contenu d&#39;un tube B au tube A. Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes et incuber mélange de transfection 10 min à température ambiante (22 ° C). </li><li> Ajouter 10 ul du mélange de transfection par puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 48 heures à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 3 Jour 4 - ELISA <ol><li> Effectuer toutes les expériences à température ambiante pour minimiser possible endocytose de Env / anticorps complexes. </li><li> Préparer 250 ml de tampon de lavage par plaque étant utilisés en même temps. Tampon de lavage est une solution saline tamponnée 1 x Tris (TBS) à pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM), supplémenté avec 1 mM de MgCl2 et 1,8 mM de CaCl2. </li><li> Préparer 125 ml de tampon de blocage par plaque en ajoutant du lait en poudre écrémé 1% et 5 mM Tris pH 8,0 à tampon de lavage. </li><li> Retirer les milieux de culture cellulaire et transfection mélange (surnageant) de la plaque à 96 puits. </li><li> Ajouter 100 μ; L de tampon de blocage par puits et incuber 20 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 50 ul d&#39;anticorps (ou sérum) par puits, dilué à la concentration appropriée en tampon de blocage. Typiquement, en utilisant une concentration de 1 ug / ml. Incuber 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois avec 100 pi tampon de blocage et puis répétez lavage 3x processus avec 100 ul du tampon de lavage. </li><li> Retirer le surnageant, ajouter 100 ul tampon de blocage, et incuber 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 50 ul d&#39;anticorps secondaire dilué 1/3000 en tampon de blocage. Varier la dilution optimale de l&#39;anticorps selon l&#39;une des différences du fabricant. Incuber 40 minutes à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois avec 100 pi tampon de blocage et puis répétez lavage 3x processus avec 100 ul du tampon de lavage. </li></ol> 4. d&#39;acquisition de données <ol><li> Retirer le surnageant de la plaque et ajouter 30 ul 1x chimioluminescence amplifiée (ECL) substrat par puits. </li><li> Acquérir chemsignal de iluminescence pour 1 sec / puits sur une plaque-lecteur approprié conformément aux instructions du fabricant. Temps de lecture peut varier en fonction des différences matérielles. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Ce dosage est optimisé pour détecter l&#39;interaction d&#39;Acm spécifiques de HIV-1 Env trimérique exprimée à la surface cellulaire. Une fois que le protocole a été établi, il peut être utilisé au moyen de débits élevés avec de faibles coûts globaux des matières et des petites quantités d&#39;anticorps. Etant donné que ce dosage est basé transfection, il peut facilement être adapté pour la co-expression de protéines cellulaires telles que les cellules CD4 dans le but d&#39;étudier leurs effets sur la conformation de E...

Humaine de type 1 du virus de l&#39;immunodéficience (HIV-1) d&#39;entrée, à médiation par les glycoprotéines de l&#39;enveloppe virale (Env) trimères est la première étape du cycle infectieux. Étant le seul antigène viral exposé présenté à la surface des virions, le trimère Env suscite des anticorps neutralisants et nonneutralizing. En tant que tel, il représente un candidat intéressant pour la conception d&#39;un vaccin immunogène. Cependant, les essais de vaccination avec Env dans des formes solubles ou recombinantes suscité des réponses avec seulement l&#39;efficacité minimale contre la plupart des isolats primaires du VIH-1 1-3. Néanmoins, l&#39;efficacité partielle observée dans l&#39;essai de vaccin RV144 4 regain d&#39;intérêt pour le VIH-1 Env comme candidat immunogène. Cela a été corroboré par une étude récente décrivent que les anticorps anti-Env vaccination suscité étaient suffisantes pour générer un certain degré de protection contre les SIV et les défis du VIH 5. Après avoir été synthétisée dans le réticulum endoplasmique, la glycoprote Enven précurseur, gp160, subit diverses modifications post-traductionnelles qui sont critiques pour sa capacité à alimenter le processus de fusion virale. Le précurseur Env doit se replier correctement et associé dans trimères avant d&#39;être coupé dans ses gp120 et gp41 transmembranaire extra-cytoplasmiques des sous-unités 6-10, avec des interactions non covalentes le maintien de la liaison gp120-gp41. La machinerie de la cellule infectée est également responsable de glycosylation fortement Env, comprenant environ 50% de sa masse totale 11,12. La structure complexe qui en résulte permet Env être conformation souple 13,14, tout en offrant une métastabilité qui est pensé pour permettre Env de s&#39;adapter et de cacher certains épitopes hautement immunogènes qui autrement seraient exposés 15-19, soulignant l&#39;importance de mieux comprendre les différentes conformations échantillonné par le Env trimère natif. A ce jour, plusieurs techniques ont été développées avec succès et utilisé pour étudier la conformation Env changes. Toutefois, ils varient dans leurs limites, étant souvent limitée à des contextes spécifiques Env. Par exemple, la résonance plasmonique de surface ou des analyses d&#39;immunoprécipitation en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques de conformation (Acm), reposent soit sur ​​des molécules Env monomères solubles ou solubilisés qui sont connus pour être différents de leurs immunogénétiquement formes trimères 20,21. Des études récentes suggèrent également que le clivage affecte conformations Env résultant de l&#39;exposition des épitopes essentiellement reconnus par des anticorps nonneutralizing 14,22,23. Nous décrivons ici en détail une méthode qui permet de déterminer rapidement et facilement la conformation de cellulairement exprimé Env trimères 18,24-26. Après la transfection transitoire de Env dans une lignée humaine de cellules adhérentes de la liaison d&#39;anticorps spécifiques à Env est détecté en utilisant une réaction de chimioluminescence simple. Cette technique peut également être utilisée pour caractériser la conformation de préférence de conformation dépend de l-anticorps dent. Par conséquent, ce dosage fournit un procédé de détection très robuste et souple.

<table><tbody><tr><td>Cellules HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire opaque blanche, 96 puits, fond plat</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, linéaire, 25 000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Préparé dans une solution de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humain de chèvre, conjuguée à la peroxydase</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de chimiluminescence améliorée</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, lecteur de plaques</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de conformation du vih-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test elisa

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

<classe p = 'jove_content'> Les glycoprotéines d’enveloppe du VIH-1 (Env) interviennent dans l’entrée virale dans les cellules cibles et sont essentielles au cycle infectieux. Comprendre comment ces glycoprotéines sont capables d’alimenter le processus de fusion par leurs changements de conformation pourrait conduire à la conception d’immunogènes meilleurs et plus efficaces pour les stratégies vaccinales. Nous décrivons ici un test ELISA basé sur des cellules qui permet d’étudier la reconnaissance du VIH-1 trimérique Env par des anticorps monoclonaux. Suite à l’expression du trimère du VIH-1 Env à la surface des cellules transfectées, des anticorps anti-Env spécifiques de la conformation sont incubés avec les cellules. Un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort et une simple réaction de chimiluminescence sont ensuite utilisés pour détecter les anticorps liés. Ce système est très flexible et peut détecter les changements conformationnels Env induits par des CD4 solubles ou des protéines cellulaires. Il nécessite une quantité minimale de matériel et aucun équipement ou savoir-faire hautement spécialisé. Ainsi, cette technique peut être établie pour le criblage à moyen et haut débit d’antigènes et d’anticorps, tels que les anticorps nouvellement isolés.

En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons adapté le protocole de dosage de l'impact de CD4 soluble (sCD4) cellulaire CD4 et co-exprimées sur l'exposition d'épitopes sur CD4i de type sauvage (wt) ou mutée Env, 18,24, comme décrit précédemment, 25,28. figure 1 représente schématiquement la procédure générale et l'exposition d'épitopes CD4i après un traitement avec sCD4 ou par la co-expression de CD4 cellulaire 18. Dans la figure 2, n...

Comprendre les conformations des antigènes de surface viraux est nécessaire pour évaluer la neutralisation des anticorps et guider la conception d’immunogènes vaccinaux efficaces. Nous décrivons ici un test ELISA basé sur des cellules qui permet d’étudier la reconnaissance du VIH-1 trimérique Env exprimé à la surface des cellules transfectées par des anticorps anti-Env spécifiques.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’interroger les glycoprotéines d’une enveloppe RIC HIV ou la confirmation ENV avec des anticorps monoclonaux. Ceci est réalisé en transectant d’abord les cellules d’adhérence pour exprimer les protéines chimériques du VIH un E NV à la surface de la cellule. Dans un deuxième temps, les cellules sont incubées avec des anticorps monoclonaux anti-ENV, qui vont se lier à l’ENV en fonction de l’exposition à l’épitope.Ensuite, un anticorps secondaire conjugué HRP est ajouté afin de quantifier l’interaction des anticorps par un test de chimiluminescence. On obtient des résultats qui montrent les niveaux relatifs d’anticorps liés au VNV en fonction des unités de lumière relatives acquises pour chacun. Eh bien, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la liaison basée sur les faits, est que cette technique peut être réalisée avec une faible quantité d’anticorps et à haut débit, un post-doctorant en laboratoire effectuera cette technique.Les cellules d’ostéosarcome humain sont utilisées dans cette expérience un jour avant la plaque de transfection, deux fois 10 à la quatrième cellule par puits. Dans une plaque de culture cellulaire opaque de 96 puits adaptée à la lecture par luminescence. Le milieu d’aigle modifié Delcos utilisé complété par du sérum de veau fœtal et de la streptomycine à la pénicilline incube les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.Préparez le mélange de transfection. Tout d’abord, disposez deux tubes, deux baies et deux B à deux baies. Ajoutez cinq microlitres de DMEM complétés par 25 millimolaires de hippies, suivis de 10 nanogrammes de tat et de plasmide d’enrobage, et de 150 nanogrammes de plasmide codant pour une glycoprotéine chimérique du VIH.Il est à noter que le plasmide codant pour TAT n’est requis que lors de l’utilisation d’un plasmide codant pour une glycoprotéine d’enveloppe du VIH dépendant de TAT à deux B à cinq microlitres de DMM et 450 nanogrammes de polyéthaline ou PEI. Les quantités de réactifs et d’ADN doivent être ajustées en fonction du nombre de puits qui doivent être transfectés avec la même glycoprotéine d’enveloppe du VIH. Ensuite, ajoutez le contenu de deux B à deux baies et mélangez soigneusement en vortex pendant 10 secondes.Incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, ajoutez 10 microlitres du mélange de transfection par puits de la plaque de 96 puits incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % d’oxyde de carbone. L’étude Ali SA pour étudier la reconnaissance de la glycoprotéine chimérique d’une enveloppe du VIH par des anticorps monoclonaux est réalisée deux jours après la transfection des cellules de l’ostéosarcome humain.Préparez 250 millilitres de tampon de lavage par plaque utilisée en même temps. Préparez 125 millilitres de tampon de blocage par assiette en ajoutant 1 % de lait écrémé en poudre et cinq millimolaires de tris pH 8,0 au tampon de lavage. Retirez le milieu de culture cellulaire et le mélange de transfection de la plaque à 96 puits.Ajouter 100 microlitres de tampon de blocage par puits et incuber pendant 20 minutes. À température ambiante, retirer le surnageant et ajouter 50 microlitres d’anticorps par puits dilués à la concentration appropriée dans un tampon de blocage. Incuber pendant une heure à température ambiante.Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis répétez le processus de lavage trois fois. Lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, puis lavez trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage après le dernier lavage. Retirez le sate.Ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage et incubez pendant cinq minutes. À température ambiante, retirez le surnageant et ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués un à 3000 dans un tampon de blocage. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante après 40 minutes.Laver trois fois avec 100 microlitres de tampon de blocage, suivi de trois lavages avec 100 microlitres de tampon de lavage. Pour préparer les échantillons à l’acquisition des données, retirez le surnageant de la plaque de 96 puits et ajoutez 30 microlitres d’un substrat de chimiluminescence x amélioré par puits. Acquérir le signal de chimiluminescence pendant une seconde par puits sur un lecteur de plaques approprié.Selon les instructions du fabricant, l’impact du CD quatre soluble ou du CD quatre S sur l’exposition des épitopes du CD quatre I sur les glycoprotéines d’enveloppe ou l’ENV a été l’interaction du CD quatre avec l’ENV induit des changements de confirmation de l’ENV qui exposent les épitopes 17 B et 48 D qui chevauchent le site de liaison du corécepteur, mais n’affecte pas le domaine externe reconnaissant l’anticorps deux G 12. Pour évaluer l’impact des mutations ponctuelles dans la confirmation NV, deux mutants ENV ont été utilisés : H 66 A, qui a une propension réduite à échantillonner spontanément la confirmation liée à quatre CD, et S3 75 W, qui prédispose la NV à l’état CD à quatre liaisons. La normalisation des données brutes en fonction des niveaux d’expression révèle que H 66 A diminue la reconnaissance des CD quatre I 17 B, tandis que S3 75 W améliore le signal 17 B et est suffisant pour restaurer le phénotype du H 66.Un mutant testant les cellules cot transfectées avec des quantités croissantes d’un exprimeur CD quatre. Avec les barres bleues NV, les barres bleues ont révélé des signaux croissants pour les anticorps monoclonaux CD quatre I, A trois, deux et C 11, qui ont reconnu les épitopes discontinus dans le domaine interne de la glycoprotéine ENV. La reconnaissance de GP un 20 ENV par les deux anticorps G 12 n’a pas été affectée.Enfin, les données brutes ont été normalisées à deux G 12, l’absence d’une modulation 32 et C 11 lorsque ENV a été transfectée avec un mutant CD quatre avec une capacité réduite à interagir avec ENV indique que l’augmentation des signaux dépendait de l’interaction E NV CD quatre Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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