Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Plus de 60 millions de personnes ont été infectées par le VIH, le virus qui cause le sida. Le VIH/sida est une crise sanitaire mondiale, et bien que des efforts de recherche intensifs leur aient permis de tuer des personnes infectées, il reste impossible de trouver un véritable vaccin. L’un des principaux objectifs de la recherche sur les vaccins contre le VIH est la glycoprotéine d’enveloppe, que le VIH utilise pour pénétrer dans les cellules cibles.

Dans cette vidéo, nous montrons comment nous obtenons des structures de cette protéine importante à l’aide d’une technique d’imagerie appelée cryotomographie électronique. En commençant par le VIH purifié, nous montrons les étapes de préparation des échantillons congelés, les étapes d’enregistrement des images au microscope électronique de ces échantillons congelés et les étapes de conversion de ces images en modèles structurels qui pourraient être utiles pour la conception d’un vaccin contre le VIH/sida. Un aspect unique de ce que nous présentons dans cette vidéo est que le travail sera démontré par des membres de son laboratoire couvrant un large éventail d’âges, des collégiens et secondaires aux étudiants de niveau collégial et supérieur, en passant par les boursiers postdoctoraux et les scientifiques chevronnés.

La préparation d’échantillons de virus vitrifiés adaptés à la cryotomographie électronique est réalisée en étalant une suspension aqueuse de virus à travers de petits trous dans un film de carbone soutenu par une grille de cuivre, puis en congelant rapidement les virus. Le but de cette étape est de préparer un échantillon congelé de virus intacts capturés dans un état presque natif. Pour commencer, les grilles sont placées à l’intérieur d’une unité de décharge luminescente.

Cet appareil nettoie les grilles en les exposant à des gaz ionisés. Maintenant que les grilles sont prêtes à l’emploi, une suspension de virus mélangée à de petites particules d’or est préparée. Ces particules sont essentielles à la collecte et au traitement des données.

Ensuite, une goutte de suspension virale est placée sur la grille fraîchement nettoyée au plasma. La grille est ensuite chargée dans un robot, qui l’éponge avec du papier filtre, réduisant la goutte à une fine pellicule de liquide. L’échantillon est ensuite plongé dans de l’éthane liquide, qui congèle rapidement les virus à une vitesse supérieure à 100 000 kelvins par seconde.

La grille congelée en plongée est ensuite transférée dans une boîte de rangement pour être transportée au microscope. Cette opération est répétée jusqu’à ce que le nombre souhaité de grilles soit gelé. Maintenant que les grilles d’échantillonnage du virus sont prêtes, l’étape suivante consiste à les charger dans le microscope.

Pour l’imagerie, cela peut être fait manuellement ou avec l’aide d’un robot. Lorsque les grilles d’échantillons sont chargées manuellement, l’utilisateur est assis à une station spécialisée où les échantillons peuvent être manipulés sous azote liquide, les échantillons sont placés dans une chambre portable refroidie à l’azote qui est scellée, évacuée, puis fixée au microscope. Les microscopes plus récents sont capables d’un chargement d’échantillon plus automatisé.

Ici, dans un microscope Titan Cryos, les échantillons congelés sont livrés au microscope par l’utilisateur, puis chargés de manière robotique avec les grilles d’échantillons chargées dans le microscope. Chaque grille peut être examinée par l’utilisateur avant que l’imagerie puisse commencer. Les paramètres du microscope sont définis pour chaque zone de la grille d’échantillonnage qui présente des caractéristiques intéressantes.

Dans ce cas, les caractéristiques sont des virus VIH. Au fur et à mesure que chaque nouvelle zone est définie, l’ordinateur du microscope stocke les paramètres d’imagerie spécifiques à la zone. Lorsque l’utilisateur a défini toutes les positions qui l’intéressent, l’ordinateur revisite automatiquement chaque position et collecte un ensemble de données.

Chaque ensemble de données est collecté en inclinant la grille d’échantillonnage par rapport au faisceau d’électrons, tout en veillant à ce que le faisceau reste focalisé au même endroit sur la grille. La collecte de données en microscopie électronique exige traditionnellement que les utilisateurs s’assoient devant le microscope et interagissent physiquement avec l’équipement. Ce style d’interaction avec le microscope est montré ici lors d’une visite du président Obama dans une usine de renseignements.

Les progrès récents en matière d’interfaces informatiques de microscope permettent désormais aux utilisateurs de surveiller et d’ajuster la collecte de données en temps réel à partir d’un ordinateur distant au laboratoire ou ailleurs. Afin de visualiser les formes de l’enveloppe, les pointes de glycoprotéine les informations de centaines d’images individuelles doivent être moyennées pour stimuler le signal. Il s’agit d’un processus intensif en calcul, qui est accompli ici à l’aide d’un groupe d’ordinateurs appelé Bio Wolf.

Situées au NIH, des méthodes puissantes ont été développées pour extraire des volumes individuels et faire la moyenne des informations à l’aide d’algorithmes capables de fonctionner à des niveaux de bruit élevés. Intrinsèques à ce type de données, les cartes de densité obtenues à partir de virus natifs et de virus complexes à des molécules biologiquement importantes fournissent une riche base de données d’informations sur la biologie structurale du VIH. Les cartes de densité prennent vie en détail moléculaire lorsque les données sont combinées avec des informations provenant de la cristallographie aux rayons X des sous-unités individuelles qui composent le pic de glycoprotéine d’enveloppe.

Les données qui sortent de ces tomos peuvent être très denses et difficiles à interpret. 3D les logiciels pour l’industrie du divertissement peuvent être utilisés pour visualiser les modèles 3D en ajoutant des couleurs, des textures et de l’éclairage, ce qui les rend plus faciles à analyser. Les logiciels de visualisation couramment utilisés comprennent un Mirror 3D Studio Max et Maya.

Nous venons de démontrer des procédures étape par étape sur la façon dont on peut obtenir des modèles moléculaires pour la structure de l’enveloppe. Glycoprotéine, à partir du VIH purifié. À l’aide de cette méthode, nous avons également déterminé les structures de la glycoprotéine d’enveloppe en complexe avec une variété de molécules qui peuvent se lier et utiliser le virus.

Nous montrons ici un exemple de la structure de la glycoprotéine d’enveloppe en complexe avec un anticorps appelé B12. Comprendre pourquoi certaines molécules peuvent se lier et utiliser le virus alors que d’autres ne le font pas est très important pour la conception rationnelle d’un vaccin. La détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d’enveloppe du VIH ou d’autres virus, tels que la grippe et Ebola, est essentielle pour comprendre l’entrée et l’utilisation du virus.

Comme vous l’avez vu, la cryo-tomographie électronique s’impose aujourd’hui comme un outil puissant pour atteindre cet objectif.