Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

L’objectif global de cette procédure est de séparer les deux principales populations cellulaires obtenues à partir d’échantillons de biopsie musculaire humaine avec une efficacité et un rendement élevés pour permettre l’évaluation de marqueurs phénotypiques et de facteurs de transcription spécifiques. Ceci est réalisé en dissociant d’abord un échantillon de biopsie musculaire humaine en une suspension unicellulaire dans la deuxième étape. Après une culture de sept jours, les cellules sont séparées par des billes immunomagnétiques en triant les CD 56 positifs, qui sont des cellules myogéniques et les fractions CD 56 négatives, qui sont les fibroblastes.

Les cellules sont ensuite colorées et imagées pour les marqueurs phénotypiques et protéiques d’intérêt souhaités. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence et l’analyse quantitative d’images peuvent être utilisées pour mesurer l’intensité de facteurs de transcription nucléaires localisés sélectionnés au sein des populations cellulaires triées. Les principaux avantages de cette technique, qui utilise le tri des cellules immunomagnétiques par rapport aux méthodes existantes telles que le tri cellulaire activé par fluorescence, sont qu’elle est douce, qu’elle permet un excellent tri des cellules musculaires primaires humaines avec un rendement et une viabilité élevés et qu’elle peut être effectuée rapidement.

Les implications de cette technique s’étendent à l’augmentation de notre compréhension de la base cellulaire de la dégénérescence musculaire fibro-graisseuse observée dans le vieillissement, ainsi que dans un certain nombre de pathologies musculaires afin d’isoler les cellules précurseurs dérivées du muscle le plus tôt possible après l’obtention de la biopsie. Tout d’abord, déterminez le poids de l’échantillon de tissu, puis gonflez le muscle en milieu basal plusieurs fois pour éliminer l’excès de sang de l’échantillon. Laissez le muscle sédimenter à température ambiante pendant 30 à 60 secondes, puis aspirez tout sauf les deux à trois derniers millilitres de milieu du tube.

Ensuite, retournez le tube sur une boîte de Pétri stérile pour permettre au liquide restant de transporter le muscle sur la boîte. Nettoyez maintenant l’échantillon de tous les morceaux visibles de graisse ou de tissu conjonctif évident. Ensuite, tournez le plat pour mobiliser les milieux restants, puis aspirez tous les milieux et ajoutez trois millilitres d’une solution enzymatique de collagénase et de désavantage pour 100 à 400 milligrammes de tissu, et coupez l’échantillon musculaire en très petits morceaux cubes d’un à deux millimètres.

Lorsque l’échantillon est suffisamment haché. À l’aide d’une pipette large de 25 millilitres, transférez les fragments de tissu et la solution enzymatique dans un tube conique stérile de 10 à 20 millilitres. Lavez la plaque avec trois millilitres supplémentaires de solution enzymatique, puis utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les fragments musculaires restants dans le tube.

Placez le tube à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Réagiter la suspension tissulaire toutes les 15 minutes avec une pipette de 10 millilitres. Terminez ensuite la dissociation enzymatique avec au moins une quantité équivalente de milieu de croissance frais réchauffé.

Ensuite, passez la suspension cellulaire à travers un filtre de 100 micromètres pour éliminer tous les gros débris, puis centrifugez les cellules en résine. Mettez la pastille en suspension dans sept à huit millilitres de milieu de croissance, puis incubez les cellules dans une fiole de culture tissulaire T 25 non enrobée. Une température de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours.

À la fin de la semaine, la trypsine observe la monocouche cellulaire pendant trois minutes. Lorsque les cellules se sont détachées, ajoutez cinq à 10 millilitres de croissance musculaire squelettique, un moyen pour éviter une digestion excessive et une granulation des cellules par centrifugation. Ensuite, après le comptage, réservez certaines cellules pour la caractérisation des marqueurs de lignage cellulaire et lavez les cellules restantes dans 15 millilitres de gain de centrifugeuse PBS.

Cette fois, mettez la pastille en suspension dans 170 microlitres de tampon de tri maximum à température ambiante et pipetez doucement pour la réhydrater. Suspendez les cellules à 35 microlitres de microbilles magnétiques conjuguées anti anticorps 56 bien mélangées. Mélangez la solution cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pipette et incubez le mélange pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avec une végétation douce.

À mi-chemin après l’incubation, laver la solution de cellules et de billes avec 10 millilitres de tampon de tri centrifugeuse et de réus. Suspendez le granulé dans un millilitre de tampon de tri frais. Ensuite, lubrifiez le filtre de séparation et la colonne avec 500 microlitres de tampon d’alimentation.

Ensuite, mélangez et transférez immédiatement tout un millilitre de suspension cellulaire à travers le filtre de séparation et dans la colonne, rincez la colonne trois fois avec un millilitre de tampon de lavage sous pression, en recueillant la fraction de fibroblastes non retenue, en passant à travers la colonne dans un tube conique stérile de 50 millilitres contenant une petite quantité de milieu de croissance. Retirez ensuite la colonne de l’aimant et enfoncez le piston dans le haut de la colonne pour recueillir la fraction de cellule positive CD 56. Dans un tube conique séparé de 50 millilitres contenant une croissance chaude, un milieu de croissance moyen est émis à partir de cette étape.

Si un double tri doit être effectué, alors considérez les fractions cellulaires collectées positives et négatives. Si une double source est nécessaire pour plus de pureté, ne placez pas le média dans le tube de collecte positif CD 56 sur le premier tri, mais répétez les étapes en commençant par la lubrification du filtre et de la colonne au point final expérimental approprié. Fixez les cultures cellulaires positives au CD 56 dans leur milieu de culture, en utilisant un volume équivalent de glace froide, 8 % de para formaldéhyde.

Les 10 minutes avec une végétation douce. Ensuite, aspirez le fixateur et lavez les cellules deux fois avec du PBS pour immunocolorer les antigènes de surface cellulaire. Bloquez les cellules pendant au moins une heure dans 1 % de BSA dans le PBS, puis marquez les cellules avec les anticorps primaires puis secondaires appropriés.

Optimisez le gain du détecteur, la puissance laser et les paramètres d’exposition pertinents à votre microscope et à votre colorant. Avant l’imagerie, les cellules prennent les images des cellules dans le nombre souhaité de canaux de détection et dans plus de six champs de vision différents. Pour l’analyse, ouvrez les fichiers d’image TIFF appropriés et faites-les glisser les unes dans les autres pour superposer les couches correspondantes appropriées.

Chaque canal apparaîtra comme un calque distinct dans le panneau des calques. Ensuite, dans la fenêtre d’analyse, choisissez Sélectionner les points de données, puis Personnaliser et sélectionner les mesures souhaitées. Pour analyser l’intensité de la fluorescence nucléaire, ouvrez la boîte de dialogue de la gamme de couleurs et sélectionnez les couleurs échantillonnées dans le menu déroulant.

Ensuite, en maintenant la touche Maj enfoncée, sélectionnez les tons spécifiques aux noyaux étiquetés. Cliquez sur Enregistrer pour stocker ce masque de sélection de gamme de couleurs à utiliser avec d’autres images sélectionnées dans la même session. Une fois les noyaux sélectionnés, écrivez, cliquez et sélectionnez remplir.

Choisissez ensuite le noir dans le menu déroulant et confirmez que l’opacité est définie sur 100 %Ensuite, cliquez sur sélectionner et inversez. Ensuite, faites un clic droit et choisissez à nouveau Remplir, puis choisissez un remplissage blanc dans le menu déroulant. Exécuter un algorithme de bassin versant pour séparer tous les noyaux qui se chevauchent partiellement sur la couche nucléaire désormais binaire.

Allez sélectionner puis la gamme de couleurs, puis les ombres pour sélectionner les noyaux séparés individuels. Transférez ensuite la sélection sur la couche contenant une image en niveaux de gris 16 bits du marqueur souhaité et cliquez sur enregistrer les mesures. Enfin, exportez les mesures sélectionnées sous forme de fichiers texte vers le logiciel d’analyse approprié pour le traitement ultérieur de l’huile.

La coloration rouge des populations cellulaires purifiées associée à l’immunocoloration pour les marqueurs de lignées adipogéniques et myogéniques révèle que seule la fraction fibroblastique est capable d’une différenciation épigénique avec l’accumulation massive de graisse par les fibroblastes visible à l’œil nu et avec une démonstration supplémentaire de leur transformation complète par la forte expression de PPAR gamma nucléaire par ces cellules au 15e jour de traitement, ces cellules ont libéré tout antigène de tissu conjonctif TE sept A restant sur leur substrat. En revanche, les cellules myogéniques conservent leur phénotype normal, y compris leur expression de la desmine et de la chaîne lourde de myosine sans régulation positive de l’expression nucléaire des PPAR gamma. Dans cette figure, un exemple d’analyse quantitative d’un champ de cellules myogéniques Desmond positives et du champ à partir duquel ces données ont été obtenues est montré, illustrant la variation de l’expression myogénique dans les noyaux individuels à cette densité d’ensemencement spécifique et à ce point temporel.

Ce graphique démontre l’utilité de la méthode permettant de comparer directement les niveaux de facteurs de transcription dans différents types de cellules, cellule par cellule. Par exemple, ces fibroblastes musculaires CD 56 négatifs expriment un niveau élevé du facteur de transcription adipogénique nucléaire, PPAR gamma, tandis que les cellules myogéniques positives CD 56 ne maintiennent que de très faibles niveaux de facteur de transcription du récepteur nucléaire après exposition à un milieu inducteur adipocytaire. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la biologie musculaire d’explorer les mécanismes des décisions de destin cellulaire dans des échantillons de muscle humain sains ou pathologiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez d’abord avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des rendements élevés de cellules dérivées de muscles humains purifiées et bien caractérisées, et deuxièmement, comment effectuer une analyse quantitative objective des constituants cellulaires identifiés par coloration immunofluorescente.