Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l'aide traditionnels et nouveaux

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la concentration virale par la quantification de la varion infectieuse en comptant des plaques discrètes dans la culture cellulaire. Ceci est accompli en plaquant d’abord les cellules pour former une monocouche confluente pour l’infection. La deuxième étape consiste à effectuer une dilution en série de l’échantillon viral inconnu à quantifier.

Ensuite, les monocouches confluentes sont infectées par la dilution en série du stock viral, suivie de l’application d’une superposition immobilisante. La dernière étape consiste à fixer et à colorer les plaques après le temps d’incubation approprié pour le virus en question afin de compter les plaques discrètes. En fin de compte, les tests sur plaque peuvent être utilisés et modifiés de différentes manières afin de déterminer les titres viraux d’un échantillon viral inconnu.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le revêtement semi-solide, est que l’application et le retrait sont beaucoup plus simples dans les applications à haut débit et traditionnelles. De plus, il n’est pas nécessaire de chauffer les réactifs. Les implications de cette technique s’étendent à la recherche de nombreux virus lytiques différents comme l’utilisation d’une superposition liquide.

Dans un format à 96 puits, il est possible de cribler rapidement de nouveaux composés thérapeutiques, ce qui peut réduire considérablement les longues heures passées en laboratoire à effectuer des tests traditionnels sur plaque La veille de la plaque de test, les cellules appropriées pour le virus en question afin d’atteindre une fluidité de 90 à 100 % le jour de l’infection. Les solutions mères peuvent également être préparées la veille du test : préparez d’abord une solution de fixation de 10 % de formaldéhyde dans de l’eau distillée en mélangeant 5,56 millilitres de formaldéhyde à 36 % avec 14,44 millilitres d’eau distillée. Préparez ensuite la coloration violet cristallin composée de 1 % de violet cristallin dans 20 % d’éthanol dilué avec de l’eau distillée.

Ensuite, tout en travaillant dans des conditions stériles, préparez le milieu de plaque deux x approprié pour le type de cellules utilisées. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micron si l’un des réactifs n’est pas stérile. Pour préparer un recouvrement liquide à utiliser dans le dosage de la plaque à raison de 2,4 grammes de cellule d’avy dans un flacon contenant 97,6 millilitres d’eau distillée qui se mélange rapidement avec un agitateur.

Mélangez la solution à température ambiante jusqu’à ce qu’elle devienne trop visqueuse pour le barreau. À ce stade, transférez le ballon dans un agitateur et agitez-le fortement pendant 30 minutes pour assurer une homogénéisation uniforme. Enfin, autoclavez la solution à 121 degrés Celsius à 14 PSI pendant 30 minutes.

Et lorsque le programme est terminé, conservez-le scellé à température ambiante pour une superposition aros. Préparez une solution mère à 0,6 % d’agro dans de l’eau distillée. Mélanger avec un agitateur et un autoclave pour amener en solution ou un revêtement de carboxyméthylcellulose.

Préparez une solution de carboxyméthylcellulose à 2 % dans de l’eau distillée et mélangez ensuite à l’autoclave comme avant le lendemain du placage. Utilisez un microscope inversé pour vérifier la fluidité et la viabilité des cellules avant de commencer le test. S’assurer que les cellules présentent une morphologie cellulaire standard et une fluidité d’environ 90 %.

Effectuer une dilution en série décuplé des échantillons infectieux dans des milieux de croissance cellulaire, en faisant varier le nombre de dilutions nécessaires en fonction du titre attendu du virus en question. Préparez également un échantillon de contrôle non infecté pour assurer de manière indépendante la viabilité cellulaire et aider à l’identification de la plaque. Pipeter le témoin non infecté et la dilution en série dans les puits de la plaque, en prenant soin de ne pas perturber la monocouche.

Utilisez un volume suffisant d’inoculum pour couvrir les cellules tout en maintenant le volume aussi bas que possible afin de maximiser le contact viral avec la monocouche. Mettez les plaques dans l’incubateur de culture tissulaire et infectez les cellules pendant 45 minutes à une heure toutes les 20 minutes. Basculez doucement les plaques pour assurer une couverture uniforme et pour empêcher la monocouche cellulaire de se dessécher pendant l’infection.

Préparez la solution de travail de recouvrement pour les revêtements liquides. Mélangez un milieu de plaque chauffé et une cellule de 1,2 à 2,4 % à température ambiante dans un rapport de un à un pour obtenir une solution de travail de milieu de recouvrement de cellules d’avy de 0,6 à 1,2 % ou de substrat de plaque réchauffé mixte AROS ou CMC, et une solution mère de 0,6 % d’AROS chauffé ou de 2 % de CMC dans un rapport de un à un. Ensuite, placez dans un bain-marie à 56 degrés Celsius, 30 minutes pour l’équilibre de la température.

Assurez-vous que la solution est chaude mais pas chaude au toucher pour éviter la mort cellulaire et réduire les titres viraux. Après l’infection, appliquez les superpositions sur les monocouches infectées après l’ajout de la superposition Incubez les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à 14 jours selon le virus analysé pour fixer les cellules avec une superposition liquide, versez ou aspirez la couche de cellules e, puis pipetez la solution de formaldéhyde à 10 % dans les puits et fixez à température ambiante pendant 30 minutes pendant la nuit ou aros ou CMC directement. Ajoutez la solution de formaldéhyde à la superposition pendant une heure jusqu’à toute la nuit à température ambiante après la fixation, jetez le formaldéhyde, puis retirez manuellement les bouchons semi-solides où se trouve l’aros avec la spatule.

Rincez les plaques cellulaires aby avec de l’eau pour éliminer les résidus de fixateur de recouvrement avant la coloration. Pour colorer, couvrez les cellules avec une quantité minimale de solution de violet cristallin pendant environ 15 minutes. Basculez les plaques si nécessaire pour assurer une couverture uniforme.

Lavez doucement la tache violette cristalline avec de l’eau une fois fixée, tachée et séchée, stockez plex indéfiniment pour une analyse future. Comptez les plaques dans chaque puits, en excluant les puits de moins de cinq ou de plus de 100 plaques. Prenons la moyenne de toutes les répétitions techniques de la même dilution.

Prenez note de la taille et de la morphologie de la plaque. Déterminer le titre viral de l’échantillon de stock en prenant le nombre moyen de plaques pour une dilution et l’inverse du facteur de dilution total. Cette image montre des comparaisons de rechargement de plaques du virus de la fièvre de la vallée du Rift à l’aide de plaques à 12 puits. Des bureaux ont été plaqués à 2,5 fois 10 des cinquièmes cellules dans des plaques à 12 puits et infectés avec 200 microlitres en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de MP 12.

Après l’infection, des superpositions de 1,5 millilitre de 0,3 %aros, 0,6 % AVY ou 1 % CMC ont été appliquées pour comparer directement les superpositions. Cet histogramme montre les résultats du dénombrement et du titrage des plaques pour les trois superpositions. Ici. Des comparaisons de recouvrements de plaques ViiV utilisant des plaques à 12 puits montrent que les bureaux ont été plaqués comme auparavant et infectés avec un volume de 200 microlitres en utilisant le même échantillon de départ dilué en série de la souche vaccinale ViiV TC 83 après l’infection, des superpositions de 1,5 millilitre de 0,3 % aros, 0,6 % de cellule AVY ou 1 % de CMC ont été appliquées comme auparavant.

Encore une fois, l’histogramme montre les résultats du comptage des plaques et du titrage pour les trois superpositions. Cette image montre un exemple de superposition de plaques à haut débit. Une plaque de 96 puits de VIR plaquée à trois fois 10 des quatrièmes cellules par puits a été infectée avec 50 microlitres d’inoculum en utilisant le même échantillon de départ dilué en série du virus de la fièvre de la vallée du Rift MP 12 pendant une heure en quadruple double pour les superpositions 0,6 et 1,2 % Les concentrations finales de cellules d’avy ont été testées afin de déterminer la faisabilité et la reproductibilité de l’utilisation de superpositions liquides à haut débit.

Cet histogramme montre les titres déterminés à partir de chaque superposition. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque virus est différent et que des optimisations, notamment l’utilisation de différents types de cellules, de temps d’incubation et/ou de milieux de croissance, peuvent être nécessaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un dosage de plaque de base en utilisant des superpositions liquides et semi-solides.