Techniques de laboratoire aseptiques: Méthodes de placage

[Narrateur] Ce protocole intègre la technique aseptique dans les méthodes de placage utilisées pour isoler, propager ou dénombrer les micro-organismes comme les bactéries et les phages. Les procédures comprennent le placage de cultures bactériennes pour isoler des colonies individuelles. Versez le placage pour déterminer la concentration de bactéries. Et étaler le placage pour énumérer les colonies bactériennes viables. Les superpositions de gélose molle sont utilisées pour isoler les phages et dénombrer les plaques, tandis que les répliques de placage transfèrent les cellules d’une plaque à une autre selon un motif spatial identique. En fin de compte, les applications pratiques de ces techniques à la culture de micro-organismes vont de l’identification de bactéries dans des environnements aux progrès technologiques en génétique moléculaire et aux bioessais à haut débit.

- En général, les personnes qui ne connaissent pas ces méthodes de placage peuvent avoir des difficultés car les manipulations nécessitent des mouvements prudents et coordonnés évitant le contact avec des surfaces non stériles. L’apprentissage de ces procédures de routine nécessite de la formation et de la pratique. Ma coordinatrice de laboratoire, le Dr Kris Reddi, fera la démonstration des procédures.

- [Narrateur] Commencez à travailler avec des micro-organismes en connaissant les règles de laboratoire et les précautions de sécurité, y compris la classification des risques biologiques, la décontamination des déchets et l’élimination. Confirmez que tous les instruments, solutions et milieux pour les procédures de placage sont stériles. Établissez également un espace de travail clair. Nettoyez-le avec un désinfectant. Installez un bec Bunsen avec un tube attaché à une conduite de gaz, organisez les fournitures nécessaires avec des matériaux correctement étiquetés. Continuez à bien vous laver les mains avec du savon antiseptique et de l’eau tiède. Tout d’abord, mouillez les mains avec de l’eau chaude et courante, puis appliquez et répartissez soigneusement le savon. Frottez vigoureusement les mains en créant des frictions sur toutes les surfaces, y compris les pouces, le dos des doigts, le dos des mains et sous les ongles. Ensuite, rincez abondamment pour éliminer les résidus de savon et séchez à l’aide d’essuie-tout distribués à partir d’un support. Enfin, avec une serviette en papier fraîche, fermez le robinet. La procédure Streak Plate est conçue pour isoler des cultures pures de bactéries, ou colonies, de populations mixtes par simple séparation mécanique. Retirez une plaque de gélose d’une boîte froide à quatre degrés Celsius et préchauffez-la à température ambiante. Choisissez un outil parmi la gamme d’instruments pour tracer la plaque. Assurez-vous que la plaque est sèche sans condensation sur le couvercle. Étiquetez le fond d’une plaque de gélose sur le pourtour. Lorsque vous êtes compétent, utilisez une seule plaque pour plusieurs échantillons. Allumez ensuite un bec Bunsen pour enflammer la boucle métallique. Commencez à trois ou quatre pouces de la boucle métallique avec le fil à l’extrémité du cône bleu, la partie la plus chaude de la flamme du bec Bunsen. Lorsque le métal devient rouge, déplacez le fil pour que la flamme s’approche de la boucle. Pour refroidir la boucle, touchez le bord de la gélose pour générer un son grésillant. Continuez à prélever l’inoculum sur la boucle. Soulevez la moitié inférieure de l’assiette. Déplacez la boucle d’avant en arrière du bord vers le centre dans le premier quadrant de la plaque. Reposez la plaque inversée sur le couvercle. Rallumez la boucle métallique. Tournez la boîte de Pétri à 90 degrés. Touchez la boucle près de la fin de la dernière série en utilisant le motif de va-et-vient, croisez la dernière moitié des traînées dans le premier quadrant, puis passez dans le deuxième quadrant vide. Une fois le deuxième quadrant rempli, posez l’assiette. Répétez la procédure de stries pour les troisième et quatrième quadrants tout en évitant le contact avec le premier quadrant. Pour tracer avec un cure-dent plat et stérile, tenez doucement l’extrémité étroite entre le pouce et l’annulaire à un angle de 10 à 20 degrés par rapport au moyen, utilisez l’extrémité large pour strier les quadrants. Reversez l’assiette sur le couvercle entre les quadrants et jetez le cure-dent de manière appropriée. Procédez à l’incubation des plaques striées à l’envers. La procédure de coulée sur plaque énumère le nombre total d’unités formant colonie à la surface et à l’intérieur de la gélose d’une seule plaque. Réglez une minuterie sur 10 minutes, puis transférez 18 millilitres de milieu gélosé fondu d’un bain-marie à 55 degrés Celsius à un bloc de chaleur à 48 degrés Celsius et équilibrez pendant 10 minutes. Étiquetez le fond d’une boîte de Pétri stérile. S’il y a lieu, inclure le facteur de dilution. Maintenant, versez un millilitre d’échantillon au milieu de la boîte de Pétri. Fermez le couvercle. Retirez le capuchon du tube d’agar fondu et passez le bord du tube ouvert à travers une flamme. Versez délicatement l’agar dans la boîte de Pétri. Fermez le couvercle puis mélangez l’échantillon avec la gélose en faisant tourner doucement la plaque. Attendez 30 minutes pour permettre à la gélose de se solidifier. Une fois que l’agar s’est solidifié, retournez et placez la plaque dans une pièce chaude. L’étalement vise à séparer les micro-organismes contenus dans un petit volume d’échantillon, en répartissant uniformément les colonies résultantes sur la surface de la gélose. Équilibrez une plaque à température ambiante et étiquetez-la de manière appropriée. Positionnez la plaque sur le plateau tournant. Pipeter 0,1 millilitres d’échantillon au centre de la gélose et fermer le couvercle. Éjectez la pointe dans un conteneur à déchets. Trempez la tige métallique dans un bécher rempli d’éthanol à 70 % couvrant toute la partie inférieure de l’épandeur et le premier pouce de la tige, puis égouttez-le. Allumez l’excès d’éthanol en passant à travers la flamme d’un bec Bunsen. Ensuite, ouvrez le couvercle de la plaque de gélose et refroidissez l’épandeur en le touchant à la gélose le long du bord près du bord. Faites tourner la platine lentement. En tenant doucement l’épandeur sur la surface de la gélose, répartissez progressivement l’échantillon uniformément sur toute la plaque en utilisant un mouvement de va-et-vient pendant que le plateau tournant tourne. Fermez le couvercle et laissez l’échantillon bien absorber pendant au moins cinq minutes. Ensuite, incubez la plaque inversée. Tout d’abord, étiquetez la plaque de gélose de manière appropriée. Ouvrez le couvercle de la plaque de gélose. Ouvrez ensuite le récipient de billes de verre pré-stérilisées et allumez le bord à la flamme. Versez soigneusement 10 à 12 billes de verre stériles sur une plaque de gélose. Fermez le couvercle de la plaque et allumez le bord du récipient à billes de verre avant de remettre le bouchon. Maintenant, pipetez l’échantillon au centre de la gélose. Dans un mouvement horizontal, secouez doucement les perles sur la surface de la gélose sept fois. Si elle est bien faite, la procédure ressemble à des maracas secoués. Faites pivoter la plaque de 60 degrés et secouez-la à nouveau horizontalement sept fois. Encore une fois, tournez la plaque de 60 degrés et secouez à nouveau. Vérifiez que l’échantillon est absorbé. Ensuite, versez les billes contaminées dans un bécher de collecte marqué contenant 10 % d’eau de Javel. Incuber la plaque inversée. Le dosage de la plaque est couramment utilisé pour détecter et quantifier les phages bactériens. Cultivez les bactéries indicatrices en phase exponentielle et stockez-les sur de la glace. Ensuite, étiquetez deux tubes de microcentrifugation stériles et ajoutez respectivement 50 microlitres d’échantillon de phage ou de tampon à chacun. Ensuite, faites tourbillonner la culture bactérienne dans le ballon, puis transférez une aliquote de bactéries dans un tube stérile et vortex doucement les bactéries indicatrices, puis ajoutez 500 microlitres de bactéries dans chaque tube d’absorption. Mélangez en effleurant doucement les tubes. Ne jamais vortex ou pipette vigoureusement des échantillons de phages. Incuber le mélange de phages à une température appropriée pour la souche indicatrice pendant 20 minutes. Pendant ce temps, transférez deux tubes de gélose molle d’un bain-marie à 55 degrés Celsius vers un bloc chauffant à 48 degrés Celsius. Équilibrez-vous pendant 10 minutes. Étiquetez deux plaques de gélose dure nutritive sans condensation pré-équilibrées à la température ambiante. Retirez un tube de gélose souple du bloc chauffant et vérifiez que le contenu n’est pas trop chaud au toucher. Ensuite, transférez aseptiquement le mélange du tube d’absorption de phages dans le tube de gélose molle. Ensuite, tournez rapidement entre les paumes pour mélanger le contenu. Avec le tube dans une main, ouvrez le couvercle de la plaque de gélose dure de l’autre main. Versez immédiatement tout le contenu du tube sur la surface d’une plaque de gélose dure. Secouez l’assiette rapidement et doucement. Fermez le couvercle et placez la plaque sur un niveau pendant 30 minutes jusqu’à ce que la gélose molle se solidifie. Ensuite, répétez la procédure pour le tube d’absorption de contrôle en transférant le mélange de contrôle dans un tube de gélose molle. En le mélangeant, en versant le contenu sur une plaque de gélose dure, en la balançant et en laissant la gélose molle se solidifier pendant 30 minutes. Inspectez les plaques pour la formation de plaques. Pour isoler une plaque d’un mélange hétérogène, perforez soigneusement le centre avec un cure-dent stérile et transférez l’inoculum dans un tube de microcentrifugation stérile contenant 100 microlitres de tampon de phage. Continuez à purifier ce lysat en répétant le dosage de la plaque trois à six fois avec des dilutions en série si nécessaire. Le placage de réplique exploite un phénotype sélectionnable en permettant de comparer la croissance cellulaire sur une plaque primaire à celle des plaques secondaires. Marquez une grille au bas de l’assiette, étiquetez l’assiette principale et numérotez les carrés résultants. Maintenant, utilisez une technique aseptique pour retirer un cure-dent pré-stérilisé du bécher, tamponnez le centre de chaque carré avec un échantillon de cellule et jetez le cure-dent dans une poubelle appropriée. Incuber la plaque primaire. Empilez la plaque primaire et toutes les plaques secondaires. Placez une marque d’orientation sur le côté de la moitié inférieure des plaques. Retirez maintenant un chiffon de velours stérile de son emballage et placez-le sur le bloc cylindrique. Ensuite, placez le support en alignant les marques sur le support avec celles du bloc. Notez la marque d’orientation sur le bloc et le support. Ensuite, retirez le couvercle de la plaque principale. Alignez les marques d’orientation sur la plaque et le bloc. Abaissez la plaque de manière à ce que la surface de la gélose entre en contact avec le chiffon de velours. Du bout des doigts, appuyez légèrement mais uniformément sur l’arrière de la plaque principale, puis retirez-la délicatement du bloc. Vérifiez que l’empreinte des cellules est visible sur le velours. Remettez le couvercle sur la plaque. Maintenant, répétez séquentiellement le protocole sur le chiffon de velours avec chacune des plaques secondaires. Utilisez l’impression de velours des cellules de la plaque primaire pour inoculer jusqu’à huit plaques secondaires classées du substrat le moins favorable au plus favorable. Enfin, comme témoin positif, pour la dernière plaque de la série, utilisez un milieu gélosé dans lequel toutes les souches testées doivent se développer. Collez les plaques inversées ensemble et incubez-les. Inspectez les plaques secondaires pour la croissance. Éteignez le bec Bunsen, puis rangez toutes les fournitures. Placez les vêtements de laboratoire, la verrerie et les déchets dangereux contaminés dans le récipient d’élimination approprié. Nettoyez la zone de travail avec un désinfectant. Enfin, lavez-vous soigneusement les mains avec du savon antiseptique et de l’eau tiède. Serratia Marcescens est une protéobactérie à Gram négatif, en forme de bâtonnet, qui produit un pigment rougeâtre appelé prodigiosine. On le trouve couramment dans les salles de bains et sur les rideaux de douche. Dans cet exemple, la technique de la plaque striée génère des colonies uniques dans le quatrième quadrant. Cette analyse des bactéries présentes dans un échantillon d’eau prélevé dans une fontaine publique utilise la technique de la Plaque Pour. Notez la différence d’apparence des colonies. Les colonies de surface sont grandes et de forme circulaire, tandis que certaines colonies de surface sont très petites et de forme irrégulière. La technique de la plaque étalée est un élément important dans les expériences d’enrichissement, de sélection et de criblage. Par exemple, la méthode copacabana est un outil de différenciation dans l’écran bleu-blanc classique de la technologie de l’ADN recombinant. Le phage T4 est un phage d’ADN double brin virulent qui infecte son hôte sous la forme d’Escherichia coli pour lyser et libérer le phage de descendance. Ce dosage sur plaque sur gélose EHA montre que le phage se trouve dans des zones de clairance d’environ un millimètre de diamètre. En l’absence de particules de phages infectieuses, la croissance bactérienne entraîne une suspension trouble des cellules dans la gélose molle dans laquelle des colonies discrètes ne sont pas visibles. Dans la technique de recouvrement de gélose molle, les morphologies des plaques varient. Par exemple, ici, la même souche hôte de mycobactérie produit des morphologies de plaque distinctes en présence de destructeurs de phages de microbactéries par rapport aux MSSS de phages de mycobactéries. La puissance du placage de réplique réside dans le criblage simultané d’un grand nombre de micro-organismes. Dans ce cas, quatre souches de pseudomonas ont été testées en double pour la croissance sur trois sources de carbone différentes. Acétamide, lactose et glycine. Ici, la plaque primaire est un milieu YTA complet inoculé avec les quatre souches indiquées ci-dessous. Les souches présentent des schémas de croissance variables sur des plaques répliques d’un milieu MSA minimal complété par une source unique de carbone, d’acétamide, de lactose ou de glycine. Toutes les souches se développent sur la dernière plaque de contrôle positif confirmant que les cellules ont été transférées sur toutes les plaques secondaires de cette série. La tabulation des résultats de ces répliques détaille le criblage simultané des différentes souches de type sauvage pour les exigences de croissance caractéristiques.

- Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des procédures de placage sans contaminer les milieux ou les cultures et également d’utiliser la méthode de placage appropriée pour toute tâche expérimentale donnée en laboratoire. Devenir compétent avec ces techniques demande de la pratique. Cependant, avec une formation appropriée, les procédures de placage décrites dans cette vidéo deviendront une seconde nature lorsque vous travaillerez sur la paillasse du laboratoire.