L'optimisation d'un micro-neutralisation quantitative de dosage

L’objectif global de ce test de microneutralisation est de caractériser tous les types de virus grippaux actuellement en circulation et l’activité des anticorps et des mesures antivirales de manière quantitative, à haut débit et très sensible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, telles que la caractérisation antigénique des virus de la grippe, la neutralisation quantitative des anticorps et les activités antivirales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a permis de caractériser l’ensemble de la population cellulaire infectée, y compris les plaques visibles et invisibles, et les infections unicellulaires.

Le test de microneutralisation sera démontré par le Dr Yipu Lin, directeur adjoint du Centre collaborateur de l’OMS pour la grippe à Londres. Le niveau de biosécurité, ou BSL, pour le protocole suivant est BSL 2 pour les virus de la grippe saisonnière et BSL 3+ pour les virus grippaux pandémiques potentiels. Pour commencer, aliquote suffisamment de cellules dans des plaques de 96 puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant deux à trois jours pour atteindre la confluence. En utilisant de l’éthanol à 70 %, stérilisez un laveur de plaques à plusieurs puits et utilisez du PBS ou du VGM pour le rincer. Ensuite, utilisez 200 microlitres de milieu de croissance du virus, ou VGM, pour laver les cellules confluentes.

Aspirez le VGM des cellules et ajoutez immédiatement 50 microlitres de VGM dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de VGM dans chacun des six tubes stériles. Ensuite, pipetez 100 microlitres de virus dans le premier tube et mélangez bien.

Préparez des dilutions en série du virus en commençant par le premier tube, en changeant les pointes entre chaque dilution. Ajouter 50 microlitres de chaque dilution de virus en commençant par la dilution la plus élevée pour dupliquer les puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures pour permettre au virus d’infecter les cellules.

Après avoir préparé le recouvrement selon le protocole de texte, retirez l’inoculum des puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de superposition dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit sans être dérangé. Ajoutez 200 microlitres de glace 4 % PFA dans le PBS A dans les puits et incubez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes ou à température ambiante pendant 20 minutes.

Après l’incubation, aspirez le PFA et utilisez 200 microlitres par puits de PBS A pour laver la plaque deux fois. Ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation dans la plaque et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, utilisez PBS A pour laver l’assiette deux fois.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres par puits d’un anticorps monoclonal de souris contre la grippe de type A dans les puits et incubez à température ambiante en agitant pendant une heure. Après l’incubation, utilisez 300 microlitres de tampon de lavage pour laver le puits trois fois. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’un anticorps secondaire de chèvre conjugué HRP aux échantillons et incubez à température ambiante pendant une heure.

Après avoir lavé les puits trois fois comme précédemment, ajoutez 50 microlitres de substrat par puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que le développement d’une couleur bleue soit clairement visible. Pour arrêter la réaction, utilisez 200 microlitres d’eau distillée pour laver les puits deux fois. Ensuite, après avoir séché la plaque à l’air, rangez-la dans un endroit sombre.

Placez une plaque à puits dans la zone de balayage d’un scanner à plat, en utilisant la limite de position en forme de L pour garantir l’obtention d’un emplacement d’imagerie optimal et reproductible. Scannez la plaque à l’aide des paramètres indiqués ici. Ensuite, exécutez le logiciel de lecture de plaques de puits pour calculer la concentration de virus requise en cliquant sur le bouton Charger l’image pour charger une image.

Ensuite, dans l’onglet Seuil global, faites glisser la barre rouge dans l’histogramme pour ajuster le seuil d’échantillonnage. Ensuite, cliquez sur le bouton de mise à jour pour examiner l’effet sur une image. Maintenant, cochez la case Calculer la neutralisation/titration.

Cliquez sur le bouton Échantillonnage pour quantifier la population cellulaire infectée, ou ICP. Ensuite, lorsque vous y êtes invité, cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer les résultats de l’échantillonnage. Pour obtenir les résultats du titrage, chargez ou saisissez la carte de définition de la plaque de puits.

Dans Titration :Optimal Virus Population, indiquez le seuil. Sélectionnez l’onglet Processus de titrage pour calculer les résultats du titrage. Ensuite, vérifiez les résultats du titrage avant de cliquer sur le bouton Enregistrer et fermer pour enregistrer les résultats.

Reportez-vous au supplément S1 pour des instructions plus détaillées sur le logiciel. Pour effectuer la neutralisation du virus, préparez la monocouche cellulaire deux ou trois jours à l’avance. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de VGM dans chaque puits de la plaque.

Utilisez les colonnes 11 et 12 pour le contrôle du virus et le contrôle des cellules, respectivement. Ajoutez des aliquotes de 50 microlitres d’une dilution sur 20 d’enzyme destructrice de récepteur, ou RDE, sérum traité à la première rangée de colonnes un à 10. Effectuez des dilutions en série en deux en transférant 50 microlitres de la rangée A à la rangée H et en jetant 50 microlitres de la rangée H. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de diluant dans chaque puits de la colonne de contrôle de la cellule.

Ajouter 50 microlitres du virus dans chaque puits de la plaque, à l’exception de la colonne de contrôle cellulaire. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Ensuite, retirez l’inoculum et ajoutez la superposition dans chaque puits.

Incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius sans être dérangé. Ensuite, fixez et teignez les plaques comme démontré plus tôt dans cette vidéo. Pour quantifier la neutralisation, placez une plaque à puits dans la zone de balayage d’un scanner à plat, comme démontré précédemment dans cette vidéo.

Scannez la plaque et exécutez le logiciel de lecture de plaques pour calculer les titres viraux requis comme auparavant. Après avoir chargé ou saisi la carte de la plaque de puits, indiquez le seuil dans Neutralisation :Déduction d’infection. Ensuite, sélectionnez Processus de neutralisation pour calculer les titres.

Enfin, vérifiez les titres, puis cliquez sur le bouton Enregistrer et fermer pour enregistrer les résultats de la neutralisation. On trouvera ci-dessous les résultats de titrage d’expériences récentes de caractérisation antigénique de huit virus d’entrée avec des dilutions comprises entre 1,0 fois 10 puissance moins un et 1,0 fois 10 puissance moins six. Le graphique illustre que les PIC diminuent avec l’augmentation de la dilution du virus.

Les courbes ont été normalisées par rapport aux ICP des mêmes virus qui ont produit des infections dans toutes les cellules d’un puits. Ce tableau présente les dilutions virales qui ont produit 30 % de la saturation en PCI et qui ont été choisies comme dilution virale d’entrée pour la neutralisation. Cette figure montre les résultats d’une expérience de neutralisation utilisant un virus d’entrée contre cinq antisérums.

Le graphique illustre le processus d’infection avec l’augmentation de la dilution sérique. La population positive normalisée sur l’axe vertical représente le rapport entre les PIC de la réponse antisérale correspondante et la PIC moyenne du virus de référence. Enfin, les titres de neutralisation ont été déterminés comme les inverses des dilutions de l’antisérum correspondant à une réduction de 50 % de l’ICP.

Ce test se concentre sur la cohérence, la vitesse et la sensibilité de détection, y compris le titrage quantifié des virus d’entrée, l’imagerie à haut débit et le traitement des données. Il est rentable, facile à utiliser et a été couramment utilisé dans les études antigéniques virales.